色谱的基础知识
色谱基础知识
紫外检测器使用前需要预热，待基线稳定后再进样，流通池与管路漏液或堵塞时应及时处理。 使用时应关闭检测器前面板，紫外检测器流通池耐压指标为12MPa（12μL），是所有液相检测 器中最高。，两台检测器串联使用时应先经过紫外检测器再串联其他检测器。氘灯的保证使用 时间是2000小时，使用时不要频繁开关，如果2000小时内氘灯故障可以联系厂家更换。如果使 用时间超过2000小时，氘灯能量正常还可以继剂效应：溶剂效应（solvent effect）亦 称“溶剂化作用”。指液相反应中，溶剂 的物理和化学性质影响反应平衡和反应速 度的效应。溶剂化本质主要是静电作用。 对中性溶质分子而言，共价键的异裂将引 起电荷的分离，故增加溶剂的极性，对溶 质影响较大，能降低过渡态的能量，结果 使反应的活化能减低，反应速度大幅度加 快。
荧光检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性，比紫外检测器的灵敏度高两个数量级，特别适 用于痕量分析，在环境检测、药物分析、生化分析中有着广泛的用途。多环芳烃、霉菌毒素、 卟啉、儿茶酚氨等都可用荧光检测器检测。对于某些本身不发荧光的物质，如氨基酸、脂肪酸 可利用化学衍生技术使其生成荧光衍生物再进行检测。荧光检测器对温度、流量变化不敏感， 可以使用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱相关知识
色谱柱通常安装再柱温箱内起到恒温恒压提高柱效延长柱寿命的目的，安装柱子时需要注意流 动相的方向，下进上出以排除气泡，根据分析的目的选择合适的色谱柱。
高效液相色谱柱相关知识
反相模式是第一选择，其中又以C18柱最为常见，反相离子对色谱和正向色谱是第二选择。 色谱柱连接时应避免产生死体积，常用的色谱连接头是peek接头，连接peek接头时如果peek接 头管线伸出的长度不够将产生缝隙，这就是柱外死体积；如果死体积产生再进样器出口处，上样体 积将增加，样品将展宽。如果死体积产生再色谱柱出口，本来分离的样品又混合了，一同进入检测 器，样品分离度将下降。死体积严重时甚至可能会导致漏液、色谱峰形劣化、重复性差。
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色谱法分离原理示意图
A＋B
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进样口
A＋B |一 ＋B
色谱柱
B | A B
检测器
B | 一
| B A
| 峰一 A
B |
时间
峰B
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一些色谱图相关的术语： 1）色谱图：在分析过程中色谱仪记录下来的检测器 信号随时间变化的曲线。（一般纵坐标为信号值，横 坐标为时间） 2）基线：在不分析状态下色谱仪检测器信号随时间 变化的曲线。 3）色谱峰：在分析过程中，当某一组分流过检测器 时，检测器信号随之产生变化，在谱图上即表现为峰 状，称之为色谱峰。
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一些色谱图相关的术语
180000
TOP
160000 140000 120000 100000
Demo Chromatogram
80000
60000 40000 20000 0 0 -20000
峰高 峰面积（阴影部 分）
1
2
保留时间
一些色谱图相关的术 语：
以右边谱图中第一个峰为例： 峰高： 284909 uV 峰宽： 约15s (从0.6到0.9min) 峰面积：2043631 uV*s 保留时间：0.76 min
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正向
检测器
色谱柱
5 放空 6 4
1
2
4
反向
样品气
定量管
检测器
3
3
1 2
载气
色谱柱
分离系统：反吹
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反吹的典型应用：8通阀进样+反吹 测O2中的CH4-NMHC
7
色谱柱
6
放空
8
样品气
1
定 量 管
色谱基础知识
蒸馏 离心 电泳 过滤 色谱(目前最有效的分离方法)
色谱法定义
利用混合物中各组分物理化学性质的差异 （如溶解性、吸附力、分子形状及大小、极性、 分配系数等）而使各组分以不同的速度移动， 从而获得分离。
与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各 组分的分离与检测。 两相及两相的相对运 动构成了色谱法的基础
色谱分离是色谱体系热力学过程和动力学过程的 综合表现。热力学过程是指与组分在体系中分配 系数相关的过程；动力学过程是指组分在该体系 两相间扩散和传质的过程。 热力学理论：塔板理论——平衡理论 动力学理论：速率理论——Vander方程
速率理论的贡献
解释了影响板高因素
u u u u u
填充均匀度 颗粒大小 流动相流速 类型 固定相厚度
理论塔板数n越大，理 论塔板高度H越小，色 谱峰越窄，表明柱效越 高； 理论塔板高度H与柱长 无关。
n 塔板理论的贡献
描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲 线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计 算和评价柱效的参数。
n 塔板理论的局限
在理想情况下导出，未考虑分子扩散因素、其它动力学 因素对柱内传质的影响。不能解释： v 流速对理论塔板数的影响。 v 影响柱效的动力学因素等。
★峰高(h)：色谱峰最高点到
基线的距离，一般用cm为单位。 ★峰面积(Peak Area): 峰与峰底之间的面积，又称响应值， 用A表示。 信号
进 样
h t
定量分析的主要依据
★区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条
件下的动力学因素。通常有三种表示方法：
标准偏差σ： 0.607倍峰宽处的一半。 信号 半峰宽W1/2： 峰高一半处的峰宽。 W1/2=2.354 σ 峰底宽W： 色谱峰两侧拐点上切线 与基线的交点间的距离。 W= 4σ
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色谱基础知识•第一部分色谱基础知识1、色谱起源2、色谱定义色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相，色谱柱3、色谱分类1、高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography (HPLC)2、气相色谱 Gas Chromatography (GC)3、薄层色谱 Thin-Layer Chromatography (TLC)4、毛细管电泳 Capillary Electrophoresis(CE)4、色谱优点1、同时分析2、分离性能好3、灵敏度高 (ppm-ppb)4、进样量小 (1-100uL)HPLC vs GC液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法1、适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析2、流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法1、适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析2、流动相只起运载样品分子的能力5、HPLC分类1、正相模式 (NP-LC)2、反相模式 (RP-LC)3、反相离子对色谱 (IPC)4、离子交换色谱 (IEC)5、尺寸排阻色谱 (GPC / GFC)反相模式 (RP)填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基相互作用力：反相模式下流动相的选择：优化水相（缓冲液）和有机相的比例非常重要（甲醇，乙腈和THF 是常用的有机溶剂）在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和pH值非常重要增加流动相极性：固定相极性变化对分离的影响：固定相极性变化对分离的影响：离子对色谱离子对试剂·阴离子化合物：氢氧化四丁基铵、溴化四丁基铵·阳离子化合物：丁烷基磺酸钠(C4)、戊烷基磺酸钠(C5)、己烷基磺酸钠(C6）、庚烷基磺酸钠(C7)、辛烷基磺酸钠(C8)、癸烷基磺酸钠(C10)、十二烷基磺酸钠(SDS)离子对色谱影响因素·离子对试剂的类型·离子对试剂的浓度·流动相的pH正相色谱色谱柱：·硅胶柱:常用·氰基柱: 常用·氨基柱: 分析糖·二醇基柱: 分析蛋白质相互作用力氢键力·如果样品有–-COOH: 羧基–-NH2: 氨基–-OH: 羟基则氢键力强.·如果样品没有任何官能团，象碳水化合物·如果样品有大的基团, 由于空间障碍则氢键力弱.正相模式下流动相的选择：·主要试剂：烷烃(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烃(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳·辅助试剂：甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氢呋喃(THF)、二氧杂环乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、异丙醇、乙醇、甲醇为了调整保留时间，可以选择主要试剂然后再加入辅助试剂。
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色谱基础知识1.名词狭义：色谱—1903俄国科学家茨维特提出，色谱就是色带。
广义：色谱系统—采用固定相和流动相分离混合物的系统。
载气－气体流动相carrier gas担体－色谱柱中的固定相，可以是颗粒物质，毛细管的管壁也可以起到担体的作用。
支持固定液or分离作用。
DEGS，硅藻土、固定液－涂布在担体表面的高沸点有机物。
OV225并不是每个色谱柱都需要担体和（或）固定液。
柱容量：色谱柱能一次有效分离的物质最大量。
决定了进入色谱柱的样品量。
内因由物质的种类决定，外因主要由色谱柱横断面上分离作用组分的量决定。
脉冲式进样器：分流装置：保留时间：（Rt reserve time）物质在色谱柱中的停留时间。
影响因素：一是固定液或者担体与被分析的物质之间作用力；二是色谱条件，包括使用的温度、载气种类及流速、升温方式（程序升温或者恒温条件）；Porapak Q2m,N2,30ml/min,110℃,140℃。
2.色谱分类固定相：纸色谱，薄层色谱，柱色谱，流动相：液相色谱liquid chromatograph（离子色谱），气相色谱gas chromatograph，电色谱，磁色谱，超临界流体色谱气固色谱－气体流动相和固定相（担体）组成的色谱系统gas solid chromatograph，GSC，担体的极性决定色谱柱的极性。
吸附色谱气液色谱－气体流动相、（担体和）固定液组成的色谱系统gas liquid chromatograph，GLC，固定液的极性决定色谱柱的极性。
分配色谱超临界流体色谱－介于气相色谱和液相色谱之间的一种色谱。
电色谱－毛细管电泳，凝胶电泳磁色谱－有待开发3.几种色谱柱径流效应：分离度：两种物质被分离开的程度。
分子结构相似度（内因），色谱条件（外因）：柱种类，温度，气体，柱长毛细管色谱柱－内径很小的色谱柱（一般在0.20mm，0.25mm，0.32mm，0.52mm左右），对上样操作要求比较高；把固定液直接涂布在色谱柱的（内）管壁上，固定液（se30）厚度一般在微米（0.25µm）数量级。
色谱基础知识
色谱的优点
★ 分离效率高 ★ 分析速度快 ★ 应用范围广 ★ 样品用量少 ★ 灵敏度高 ★ 分离和测定同步完成 ★ 易于自动化，可在工业流程中使用
高分子多孔微球：新型的有机合成固定相（苯乙烯/二乙烯苯共聚）。 适用于水、气体及低级醇的分析。
②气液色谱：溶质在固定相和流动相中进行分配，通过分子间作用力
（色散力、静电力、诱导力、氢键）的差异实现分离。
固定相=载体+固定液
对载体的要求：√具有化学惰性
√具有热稳定性
√具有一定的机械强度 √具有适当的比表面
ECD1A, ECD1A, 前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
归一化 325
相交的两点之间的距离，W=1.698644× W ECD1A,ECD1A,前部信号(HP5-ECD\STD-50PPB.D)
300
1/2
归一化
275
800 700
250
600
225
500
200
W1/2
h
400 300
色谱的发展历程
1931年，Kuhn和Lederer重复了Tswett的实验，用氧化铝和碳 酸钙做固定相分离出了3中胡萝卜素（α、β、γ），此后用这种方法 分离了60多种这类色素。
1940年，Martin和Synge提出液液分配色谱法。 1941年， Martin和Synge提出用气体代替液体做流动相的可能。 此后的11年内，James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气 液色谱方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。 1956年，Van Deemter提出速率理论。1965年Giddings对其进 行了总结和发展。 1957年，Golay开创了毛细管柱气相色谱法。
色谱基础知识简介
质分析。对于任何方法都必须进行验证
1.专一性 专一性（specificity）又称为特效性，是指在可能存在诸 多干扰组分时方法明确确定被分析组分的能力，分析含 有和不含有干扰组分的样品，比较分析结果，其差异即 是方法偏差（bias）。如果结果没有差异，则说明方法 具有专一性。 HPLC方法的专一性可以通过检查色谱峰 纯度来验证。采用多波长紫外检测器时，同时在两个波 长下检测色谱峰，如果测得该峰在两波长之处的吸收之
1.产生机理 质谱法是将样品置于高真空中（＜10-3 Pa），
并受到高速电子流或强电场等作用，失去外层
电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种
碎片离子，然后将分子离子和碎片离子引入到
一个强的正电场中，使之加速，加速电位通常
用到6~8kV，此时可认为各种带正电荷的离子都
（intra-day）、不同实验批（intra-assay）、不同分析
者、不同仪器间的一致程度。再现性是不同实验室间的
一致程度。 在HPLC分析中，如果只用对照品（或样品）溶液重复 进样测定精密度，这只表示色谱系统的精密度。而方法 的精密度的验证应该对均一的真实（QC）样品进行包 括样品处理在内的全过程操作,用接近最低、中间和最 高浓度的三个样品浓度进行随机分析。日间精密度还应 该连续测定8天，每个样品每天至少测定2次。
色谱基本知识入门
现在的色谱法是指含义更为广泛的分 离方法：它是利用混合物中各组分在互不 相溶的两相中分配系数的差异，当两相作 相对运动时，混合物各组分在两相中反复 分配达到分离，然后分别测定，是一种分 离与检测相结合的方法。
气体 固定相 固体 液体
流动相
液体 超临界流体
色谱分离基本原理
利用外力使含有样品的流动相通过一固定于柱或平板 上、与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两
10-9-10-3
—— 可以 可以
10-6-10-3
—— 可以 可以
10-7-10-13
-9-10-3 10-9-10-1 10 进样量
1.3.3色谱法与其他方法的比较
(1)与经典的化学法比较
化学法：根据某种物质具有某种独特的 化学性质来进行分析. 色谱法：不受限制，可使化学性质相同 的复杂组分互相分离.
CE
固定相
固体吸 固体吸 固体吸 附剂 附剂 附剂 键合分 键合分 键合分 子层 子层 子层 粘稠液 体
0.1~10 有 0.5~5 有 0.1~5 有
胶束、 添加剂 等
膜厚 （um）
1mm 有
—— 有
分子间作 用力
色谱 方法 气体 液体 固体 （g ）
GC
HPLC
SFC
TLC
CE
样品适应性 可以 可以 可以 —— 可以 可以 —— 可以 可以
第一章 色谱分离法概述
1.1色谱法的产生和发展
1.1.1 色谱分析法的历史 色谱法是1906年俄国植物学家M.Tswett创立 叶绿素分离动画 实验现象：混合物被分成不同颜色的区域 色谱带， 所以命名为色谱法（色层法、层析法）. 不同色素的运动距离s=v×t
M.Tswett 实验的实质： CaCO3——固定相 } 两相作相对运动 石油醚——流动相 混合物随流动相在柱中流动，吸附 脱附 再吸附 再脱附 分离
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有关色谱图得概念
图5-11给出了色谱图示意图,
有关术语列于表5-1-1()。
2、有关保留值得术语
色谱最常用得保留值就是保留时间。
在填充柱GC中,特别就是测定物化参数时,常用保留体
积得概念。
表5-1-2列出了各种保留值得定义(参见图5-1-1)。
表5-1-2 有关保留值得术语()
表5-1-2涉及到一个压力校正因子j。
因为色谱柱中各处得压力不同,故载气体积流量
也不同,j就就是用来校正色谱柱中压力梯度得,其定义为
式中,pi为柱入口处压力,即柱前压;po为柱出口压力,一般情况下(除使用MS外)为大气压力。
还有一个载气流速得问题。
通常用皂膜流量计测得得就是检测器或柱出口处得温度与压力条件下得载气体积流量F0,扣除水得蒸气压,并经温度校正后,就得到柱出口处得实际载气流量F∞:
Fe为色谱柱中载气得平均流速。
由于气体就是可压缩得,虽然单位时间通过色谱柱中任一横截面得载气质量就是不变得,但由于柱中各处载气压力不同,密度不同,故体积流速也不同。
为求得色谱柱中载气得平均流速,还需对F∞进行压力校正:
毛细管气相色谱中更多采用得就是载气平均线性流速u。
当Fe不变时,载气通过色谱柱得线速度随柱内径不同而不同。
为此采用载气线性流速(简称线流速)’ 来描述载气在色谱柱中得前进速度。
3、有关分离得参数
(1)相对保留值αα又叫选择性或选择性因子。
即在一定得分离条件下,保留时间大得组分B与保留时间小得组分A 得调整保留值之比:
这就是一个很常用得色谱参数。
当固定相与流动相一定时,一对物质得α可以认为只就是温度得函数,故α常用于色谱峰得定性,在动力学分离理论中,α用来描述一对物质得分离程度优劣。
(2)分配系数K 其定义为在平衡状态时,某一组分在固定液(CL)与流动相(CC)中得浓度之比:
(3)容量因子k 也叫分配比或分配容量。
它定义为平衡状态时,组分在固定相与流动相中得质量之比:
(4)分离度R 表示相邻两个色谱峰分离程度得优劣,其定义为(参见图5-1-1):
当两峰得峰高相差不大,且峰形接近时,可认为WA=WB,这时R=△tR/W。
对于高斯峰(正态分布)来说,R=1、5时,两峰得重叠部分为0、3%,被认为就是达到了基线分离。
有时两峰远未分离,无法测定峰底宽,就可采用峰高分离度Rh来描述其分离情况(见图5-1-2):
可见,Rh等于1时,相邻两峰就达到了基线分离。
(5)分离数TZ或SN 它就是指某一同系物相邻两峰间可容纳得峰数。
其定义为
4、有关色谱柱性能得参数
色谱柱得基本参数有柱长(L)、柱内径(r)、柱材料、固定相等,此外还有几个描述柱性能得参数。
(1)相比β 色谱柱中气相与液相体积之比,β=Vc/VL
(2)柱效也叫柱效能。
就是指色谱柱在分离过程中主要由动力学因素(操作参数)所决定得分离效能,通常用理论塔板数n 或理论塔板高度H来表示:
这就是色谱塔板理论导出得公式。
现在塔板理论虽已过时,但此公式一直沿用至今,用以衡量色谱柱得柱效。
在相同得操作条件下,用同一样品测定色谱柱得n或H值,n值越大(H越小),柱效越高。
在色谱速率理论中,H得定义就是被分析物分子在无轨行走时单位步长得离散度,已经失去了塔板理论中塔板高度得意义,它就是一个统计学概念。
注意,计算n与H时,tR与W1/2或W得单位要一致。
实际工作中常用单位柱长得理论塔板数,2来比较柱性能,即n'=n/L。
有时还用有效板数(neff)来表示柱效,其定义为用调整保留时间测得得柱效:
理想得色谱峰应为正态分布得高斯峰,即流出曲线呈高斯分布。
然而,实际上色谱过程很复杂,色谱峰形取决于多种因素。
如色谱柱对某些组分得吸附性太强,或者进样量太大造成柱超载,均会导致色谱峰得不对称。
即使色谱柱得, 很高,也可能出现某些组分得拖尾峰或前伸峰。
λ即就是对峰对称性得描述。
当λ>1时为拖尾峰,λ<1时为前伸峰。
λ越接近于1,说明色谱柱得性能越好。
5、保留指数I
保留指数I就是GC定性分析得重要参数,最早有Kovats提出,故又称Kovats保留指数。
其定义为:
一般来讲,GC中对未知峰得定性仅用保留值———包括保留指数———就是不够得,这就是因为不同得化合物在相同得色谱条件下可能有相同得保留指数,故还须有其她辅助定性方法,如GC/MS。
反过来,仅有GC/MS得质谱图对一个未知物得定性也就是不充分得。
只有当保留值与GC/MS得定性结果相吻合时,未知物得定性才被认为就是可靠得。
另外,用不同固定相上得保留指数对未知物定性(即所谓多柱定性)也就是GC常用得定性方法。