生化实验 设计试验--PAGE
生化实验SDS-PAGE
将凝胶后的玻璃板放进槽内
拔梳子
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约5μl。
4、电泳：
接通电源→稳压→调 节电压为50V（约 8V/cm） →当溴酚蓝 前沿进入分离胶后， 将电压调至120V→待 溴酚蓝下行到距胶末 1cm停止电泳。
电泳仪参数设定操作方法
稳定电压 首先将电压的准确数值输进去，其它电流或功率值要高于正
生物化学实验
生命科学与生物工程学院
主要内容
实验一 DNA的定量测定 实验二 蛋白质的定量测定 实验三 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质
生物化学实验
实验三 SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳检测蛋白质
实验目的
1．了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原 理
2．掌握电泳仪的使用方法及凝胶电泳测定 蛋白质相对分子量的操作技术
四、结果与计算
电泳迁移率的计算 标准曲线的制作 待测蛋白质样品相对分子质量的计算
蛋白质样品相对分子质量的计算
五、思考题
1. 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完 后,需在其上加一层水,为什么?
2. 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3. 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩
胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4. 样品液为何在加样前需在沸水中加热几
试剂 用量
30％聚丙 烯酰胺贮 存液
ddH2O
0.5M TrisCl(pH 6.8)
10%SDS
10%AP
TEMED
用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。
凝胶后插梳子
凝胶后插梳子
3、装槽、点样
取出胶板下端胶条→将胶板固定在电泳槽 上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲 液至内侧玻板上边约0.4cm →小心取出梳 子。
生化实验
实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。
分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。
特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。
二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。
溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。
能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。
3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。
吸光度A:透光率的负对数。
A愈大，溶液对光的吸收愈多。
5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。
式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。
三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。
生化反应设计实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握生化反应的基本原理和操作方法。
2. 通过实验验证不同生化反应的特性和规律。
3. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理生化反应是指生物体内发生的化学反应，主要包括酶促反应、非酶促反应等。
本实验选取了以下几种生化反应进行探究：1. 酶促反应：以淀粉酶催化淀粉水解为例，研究酶促反应的特性和影响因素。
2. 非酶促反应：以蛋白质变性为例，研究非酶促反应的特性和影响因素。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶- 淀粉- 碘液- 氢氧化钠- 蛋白质溶液- 乙醇- 硫酸铜- 水浴锅- 试管- 移液枪- 滴管- 研钵- 研杵2. 实验仪器：- 恒温水浴锅- 酶标仪- 紫外可见分光光度计- 精密天平- 移液枪- 试管架- 移液器四、实验方法1. 酶促反应实验：（1）将淀粉酶与淀粉按一定比例混合，加入适量水，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一段时间。
（2）取一定量的反应液，加入碘液，观察颜色变化。
（3）以未加淀粉酶的反应液为对照组，分析酶促反应的特性和影响因素。
2. 非酶促反应实验：（1）将蛋白质溶液与氢氧化钠按一定比例混合，观察颜色变化。
（2）将混合液加入乙醇，观察沉淀形成情况。
（3）将沉淀加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。
（4）以未加氢氧化钠的反应液为对照组，分析非酶促反应的特性和影响因素。
五、实验结果与分析1. 酶促反应实验结果：通过实验观察，加入淀粉酶的反应液颜色逐渐变浅，说明淀粉被水解。
在对照组中，未加淀粉酶的反应液颜色未发生变化。
这说明淀粉酶具有催化淀粉水解的作用。
2. 非酶促反应实验结果：通过实验观察，加入氢氧化钠的反应液颜色逐渐变深，说明蛋白质发生变性。
在对照组中，未加氢氧化钠的反应液颜色未发生变化。
这说明氢氧化钠可以导致蛋白质变性。
六、实验结论1. 酶促反应具有高效、专一性等特点，是生物体内重要的化学反应类型。
2. 非酶促反应也具有重要的作用，如蛋白质变性等。
生物化学SDS-PAGE_吴旭日
CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺
CH2-CH
C(H2¯ CH)n C=O NH2
CH2-CH C( H2-CH)m
C=O C=O
NH
NH2
CH2 NH
CH2-CH
C=O
CH2-CH ( CH2-C)Hn CH2-CH C( H2-CH)m CH2-CH
C=O
C=O
NH2
NH2
பைடு நூலகம்聚丙烯酰胺
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O
注意凝胶时间 约15 min
SDS-PAGE实验操作
2、凝胶的制备
2）浓缩胶的制备（按表2配制3%的浓缩胶） 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，直至短玻
璃上缘，然后插入梳子。静置20 min左右，浓缩胶即可 聚合，轻轻取出样品槽模板。
注意凝胶时间 约8 min
SDS-PAGE实验操作
3、蛋白质样品的处理
CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
SDS-PAGE的特点
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂
中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一
致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白:
兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200
鸡卵白蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400
生化试验设计报告
生物化学期末设计实验报告——考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验名称__________________________________________________专业__________ 班级__________ 指导老师____________报告人__________ 学号__________ 报告时间__________ 选择考核形式___自主答辩____ 考试具体时间地点另行通知该考试模式共分为两个阶段：自主安排内容设计实验、递交实验设计报告、进行现场解答辨析(也可通过考生自行准备ppt展示配合解说)、最后呈交实验报告。
内容自定，最好在原本所学基础上深化拓展，有创新和实践意义的为佳。
一、实验目的1.熟练应用分光光度计2.掌握标准曲线法测定物质含量的方法3.掌握关于蛋白质测定（学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法）的原理和方法。
二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，比紫外吸收法灵敏10～20倍。
测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
SDS-PAGE实验报告
生化实验总结报告实验名称：SDS - PAGE法测定蛋白质的相对分子量作者：田景辉（201306230114）专业：生物工程指导教师：许培雅日期：2015.12.30组员：杨瑞徐巧妹尹彪程健刘嘉南目录一、实验介绍 (3)二、实验原理 (3)三、实验材料、试剂、器皿 (4)四、操作步骤 (5)五、注意事项 (7)六、实验数据记录与处理 (7)七、总结与建议 (8)八、术语表 (9)九、参考文献 (9)十、附录 (9)一、实验介绍1.实验目的掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法和测定蛋白质分子量的技术。
2.实验背景在实验一中，用100g新鲜酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸钠）法进行了蔗糖酶的提取以及粗提取，得到初提取液A、热提取液B、乙醇提取液C。
最终得到9.0ml蔗糖酶初提取液。
实验二采用QAE-葡聚糖凝胶离子交换柱层析法进行蔗糖酶的纯化，得到经线性阶梯洗脱的分离液D1和经阶梯梯度洗脱的分离液D2。
实验三采用苯基琼脂糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，得到经2mol/L(NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E1和经2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 缓冲液洗脱的分离液E2。
二、实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
生物化学大实验
生物化学大实验一、装柱及标准样品的分子筛层析：把柱子固定在夹子上，打开下面的盖，用取液器匀速加入介质。
保证介质均匀沉淀，且要缓慢加入，防止产生气泡。
待介质完全沉降打开柱的上盖，剪一与柱内径大小一致的圆形滤纸片放入柱中，沉淀于介质表面。
液体接近界面时加入3ml超纯水，同时在层析杯中加入100ml超纯水，连接泵洗柱15min，同时配制平衡液200mL（20mmol Tris-HCl,pH 8.0; 20mmol NaCl）。
待液体接近界面时，在柱中加入3ml平衡液（其余平衡液加到层析杯中），调节流速，控制滴速为3ml/10min（一分钟约6-7滴）。
平衡柱过中午。
实验材料：牛血清蛋白、糜蛋白酶二者比例为2:1 溶于20mmol Tris-HCl，pH 8.0; 20mmol NaCl（教师统一配制）。
缓慢向柱中加入样品（4ml）打开层析柱上下端，使样品靠重力流出。
当样品接近界面时在柱中加入3ml 上样缓冲液（即平衡液），连接泵，调T=100 A(0.5A)=0 ，开启记录仪，同时配制100ml 0.1M Nacl。
待两个峰都出来后，把层析杯中的液体换为0.1M Nacl洗柱20min，再用超纯水洗柱30min，封柱，关机。
实验二BAP的诱导表达1.在5ml培养基中加入Amp2.5μl（母液为100mg/ml）和10μl菌液。
在摇床上37℃ 130转过夜预培养。
2.取2.5ml菌液加入50ml含有Amp (25μl)的LB培养基中（1:20扩培）。
37℃恒温摇床，180-200rpm培养40-60min左右。
测OD600,使其值达到0.5-0.7。
3.加入终浓度为1mM的IPTG(500μl)进行外源基因的诱导表达。
于室温诱导4-5小时。
4.取出后进行细胞超声破碎，留1ml破碎前菌液处理后进行western及PAGE，其余放入冰箱于4度保存。
实验三BAP的亲和层析纯化一、破碎细菌A.盐酸胍破碎1.100ml诱导后的菌液分别放于大离心管中，配平，5000rpm离心15min。
生化实验的设计实验报告
一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。
2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。
3. 熟悉DNA的鉴定方法。
二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。
在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。
三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。
2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。
四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。
2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。
3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。
4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。
5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。
6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。
五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。
2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。
3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。
4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。
六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。
2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。
3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。
七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。
2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。
3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。
4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。
5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。
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tetramethyl ethylene diamine, 简称TEMED)的
作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
Exit 生命科学学院
实验原理
设计试验
聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连
生 续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓 物 冲液PH均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电 化 荷及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲 学 液离子成分、PH、凝胶总浓度及电位梯度均不连 实 续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分 验 子筛效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电
生
生物化学实验
物 化
设计试验
学 实
主讲：刘连芬
验
聊城生命科学学院
E-Mail：liulianfen@
生命科学学院பைடு நூலகம்
设计试验
相关知识背景
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel
生 electropHoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺为支 物 持介质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺
物 1.准确称取新鲜材料3g，加入9ml 提取缓冲液
Exit 生命科学学院
设计试验
生 物 化 学 实 验
Exit 生命科学学院
设计试验
试剂
1、1mol/L盐酸48.0 mL Tris 36.6g TEMED 0.24 mL
生
物
2、Acr 28.0g
Bis 0.753g
化 3、过硫酸铵 0.14- 0.3g
学
4、1mol/L盐酸48 mL Tris 5.98g TEMED 0.48 mL
化 （acrylamide. Acr）和交联剂N, N’-甲叉双丙烯
学 酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在催化
实 剂过硫酸铵（ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8
验
简称AP）或核黄素(ribofavn即vitamin B2)和加 速剂N, N, N’, N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-
中均有三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）及HCI。Tris的作用是
生
维持溶液的电中性及PH值，是缓冲配对离子。HCI在任何溶 液中均易解离出Cl-，在电场中迁移率快，走在最前面成为快
物 离子。电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）,其pI=6.0在PH8.9的电
化 极缓冲液中,易解离出甘氨酸根（NH2CH2COO－），而在
物 各种血清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时, 蛋白分子量小且
化 为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻
学
力大,移动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋 白质分成各自的区带。
实
3.电荷效应 进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白所带净电荷
验 不同,而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快；反之则慢。
可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度
生 （即E高m慢=E低m快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最
物 化
大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓 度低的区域,即低电导区,电场强度与电导成反比关系：I=Eη, 式中E为电场强度,I为电流强度,η为电导率,E与电导率成反
学 比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯
实 5、Acr 10.0g
Bis 2.5g
验 6、蔗糖 40.0g
7、电极缓冲液Tris 6.0克；甘氨酸 28.8克；加水到1L 用时稀释10倍
Exit 生命科学学院
实验步骤
设计试验
生
一、样品的提取
物
化
学
二、PAGE电泳
实
验
三.结果分析
生命科学学院
（一）、样品的提取
设计试验
生 一、过氧化物同功酶的提取
泳中浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。
按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。
下面就三种物理效应的原理分别加以说明：
Exit
生命科学学院
设计试验
1.样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种
生 物
不连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。 （1）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶
中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔
实
度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和 慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子
验 和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效迁移恰好介于快、慢离子之间,因此也就
聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。
由于浓缩胶为大孔胶, 对样品没有分子筛作用。
Exit
生命科学学院
设计试验
2.分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通
过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移
率,这就是分子筛效应。蛋白质进入PH8.9的同一孔径的分离
生
胶后。此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解 离度增加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过
化
胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳
学 动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶
实 时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在
验 2层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄
的区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排
列分开，通常可浓缩样品300倍。
Exit 生命科学学院
设计试验
（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连系性。在三层凝胶
甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此氯离子
及甘氨酸根沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量
大，被留在后面，然后再分成多个区带。（如图）。
Exit
生命科学学院
设计试验
生 物 化 学 实 验
Exit 生命科学学院
设计试验
（⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速
度的快慢有关（V=mE）,迁移率低的离子在高电位梯度中
因此各种蛋白质按电荷多少,分子量及形状(既荷质比q/r),以
一定顺序排成一个个区带。
PAGE连续体系应用也很广,但无浓缩效应, 利用分子筛
及电荷效应进行样品分离,条件温和,对生物活性的保持有益。
Exit
生命科学学院
设计试验
生 物 化 学 实 验
Exit 生命科学学院
设计试验
生 物 化 学 实 验
学
pH6.8的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有0.1—1%， 因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质pI在5.0左
实 右在pH6.8或pH8.9时均带负电荷向正极移动，其有效迁移率
验 介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成
的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，