细胞计数法
1、细胞计数方法
细胞如何计数？(整理自网络)
方法一：血球计数盘
此物一般有二个chambers，分别刻有9 个1 mm²大正方形，4 个角落之正方形再细刻为16 个小格，深度均为0.1 mm。
当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm²×0.1 mm=0.1 mL。
计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以10000，即为每mL 中之细胞数目。
操作步骤
1、取少许细胞悬液（约15 μL）自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100
倍倒立显微镜下观察；
2、计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数，最后乘以10000，即为每mL 中
细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于刻线上，只计上线与右线之细胞（下线与左线之细胞）。
计算公式为：4个大格细胞总数×稀释倍数×10000/4=细胞数/mL。
注：（1）计数板计数时，最适浓度为5～100000 细胞/mL，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
（2）吸管吸取细胞，让吸管在计数板一侧的凹槽处流出液体，至盖玻片被液体充满为止，不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡；（有人认为，10 uL 就可以被虹吸作用吸入且铺满计数板）。
（3）移液器（20 μL 的微量加样器）吸取20 μL 细胞悬液至计数板边缘，液体经虹吸作用进入凹槽。
（4）静置半分钟再于显微镜下观察。
方法二：粒子计数器自动计数。
细胞计数的方法
细胞计数的方法一、细胞计数简介细胞计数是生物学实验中常用的一种方法，用于确定生物样品中的细胞数量。
它对于研究细胞增殖、细胞死亡、药物毒性等具有重要意义。
目前常用的细胞计数方法包括显微镜计数法、流式细胞术和自动化计数仪。
二、显微镜计数法显微镜计数法是最传统的细胞计数方法之一，其步骤如下：1.准备工作：取出需要计数的样品，将其悬浮在生理盐水或PBS缓冲液中，并充分混合。
2.制备涂片：取出一块干净的载玻片，在玻片上滴上适量的悬浮液，用另一块载玻片将其涂匀。
3.显微镜观察：将制备好的涂片放入显微镜下，选择适当倍率观察，并记录每个视野中出现的细胞数量。
4.计算平均值：随机选择多个视野进行观察，并将每个视野中出现的细胞数量相加，最后除以观察视野总数，即可得到平均值。
5.计算细胞数量：根据平均值和涂片中的面积，可以计算出样品中的细胞数量。
三、流式细胞术流式细胞术是一种高通量的细胞计数方法，它通过将样品中的细胞单个分离并进行检测，可以快速、准确地得到大量数据。
其步骤如下：1.制备单细胞悬液：将需要计数的样品进行消化、分离或剪切等处理，使其成为单个细胞悬液。
2.标记荧光染料：通过荧光染料对单个细胞进行标记，在流式细胞仪中可以对其进行检测。
3.流式细胞仪检测：将标记好的单个细胞悬液注入流式细胞仪中，通过激光束照射和荧光检测器检测，得到每个样本中不同类型的单个细胞数量。
4.数据处理：通过软件对数据进行处理和分析，可以得到每种类型的单个细胞数量以及比例等信息。
四、自动化计数仪自动化计数仪是近年来发展起来的一种新型计数方法，它通过数字化技术和图像处理技术，能够自动识别和计数样品中的细胞。
其步骤如下：1.准备工作：将需要计数的样品制备成单细胞悬液，并将其放入自动化计数仪中。
2.图像采集：自动化计数仪通过高速摄像头拍摄样品中的细胞图像，并对其进行数字化处理。
3.图像分析：通过图像处理软件对数字化后的细胞图像进行分析和识别，得到每个视野中出现的细胞数量。
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法1.细胞计数法细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一、该方法通过显微镜观察细胞密度和数量来判断细胞的增殖情况。
首先，将培养皿中的细胞样本取出，使用显微镜观察细胞的形态和数量，然后用显微镜同时观察已知数量的细胞，计算出单位面积或体积中的细胞数量，最后通过比较细胞数量的变化来评估细胞的增殖情况。
2.三(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐(MTT)法MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
MTT是一种黄色噻唑盐，可以通过还原作用转化为紫色的甲氧基-4-硝基苯胺（formazan），这个转化过程是仅在活细胞中发生的。
首先，将MTT溶液加入细胞培养皿中，细胞内的活细胞色素（还原酶）可以将MTT转化为紫色的formazan。
然后，用溶剂将formazan溶解，测量溶液的吸光度，就可以通过测量吸光度的变化来评估细胞的活力。
3.荧光素酶体积法（ATP法）ATP法是一种用于检测细胞的能量代谢水平的方法。
ATP是细胞内的能量分子，在细胞进行代谢活动时会不断产生。
将细胞样品加入含有高能底物的反应溶液中，ATP酶将底物中的ATP转化为体积比较大的荧光素酶（luciferin）。
接下来，荧光素酶与荧光素生成一个反应产生的发光，发光强度与ATP浓度成正比。
通过测量发光强度来评估细胞的活力。
4.分子探针染色法分子探针是一种与特定分子结合的荧光标记物质，可以通过显微镜观察细胞中特定分子的分布和浓度。
常用的分子探针有细胞核染色剂（如DAPI），线粒体染色剂（如JC-1），胞质钙染色剂（如Fluo-3）等。
将细胞与特定分子探针共同孵育，根据分子探针的荧光强度和分布情况，可以评估细胞内特定分子的含量和活动水平，从而间接评估细胞的增殖和活力。
5.流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞的物理和化学性质，通过细胞悬浮液在液体流动中的传递和分析的技术。
通过染色、抗体标记、荧光探针等方法，可以区分和分析细胞的不同类型和状态。
细胞计数方法细胞计数板法
细胞计数方法——-－-—细胞计数板法实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中得细胞得数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞得细胞数目。
具体操作:１. 将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板。
２、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片与计数板之间,静置３miｎ,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
3。
计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧与上方得。
然后按公式计算:细胞数/ｍL=四大格细胞总数/4×1０个／ml(注:当细胞很多时,可在四个格中选一定数目较平均得小格,由于每大格中有１6个小格,然后计左侧与上方得细胞数,求出每小格得细胞数,取平均值m,m×1６即每个格得平均值。
所以,细胞密度=m×1６×10个／ml)说明:公式中除以4,因为计数了４个大格得细胞数。
公式中乘以10因为计数板中每一个大格得体积为:１。
0mm(长)×1.0mm(宽)×０。
１mm(高)=0.1mm 而1ml=1０00ul＝１0０0ｍm (注意:镜下偶见有两个以上细胞组成得细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
)=========＝===============＝==＝=＝=＝＝===＝=＝＝====＝==细胞计数板得使用一、血球计数板-基本构造血球计数板就是一块特制得厚型载玻片,载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间得平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各刻有一小方格网,每个方格网共分九个大格,中央得一大格作为计数用,称为计数区。
计数区得刻度有两种:一种就是计数区分为１６个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成２5个小方格;另一种就是一个计数区分成２5个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成1６个小方格。
但就是不管计数区就是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成、计数区边长为１ｍｍ,则计数区得面积为1mm２,每个小方格得面积为1/400mm2。
细胞生物学细胞计数法和MTT法
实验题目：细胞增殖和活力的检测方法一、摘要：细胞增殖是生物体生长和繁殖的基础，当细胞增殖发生异常时往往会导致疾病的发生，比如肿瘤的发生就是细胞增殖失控的结果。
掌握细胞增殖和活力的检测是从事细胞生物学研究的一个重要方面。
针对细胞增殖和活力的检测方法有很多，这些方法除了能用于细胞本身增殖特性的研究、还能应用于药物毒副性检测，生长因子对细胞增殖和活力的影响等。
二、实验原理：〔1〕细胞计数法：最简单直接的方法：传统细胞计数的方法是用血球计数板，原理：将一定量的细胞悬液载入固定体积的玻片夹层中，在显微镜下数出细胞数量，然后换算出原始的细胞悬液浓度。
使用自动化细胞计数器，它通过拍下计数界面照片，利用软件程序设定去识别细胞，实现自动化计数。
好处:这种方法能兼容台盼蓝染色，染上蓝色的细胞视为死细胞，直接观察就能大致判断细胞的活力状态，计数后能定量分析细胞存活率。
缺点:①它的灵敏度低②线性范围太窄，细胞浓度低于 10 万个/ml 则计数不准确。
〔2〕 MTT 法MTT 称为噻唑蓝，是一种黄颜色染料。
定义：MTT 比色法是一种通过检测细胞代谢活性间接反映细胞增殖的方法。
原理：活细胞线粒体里的酶能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，活细胞数量越多，形成的有色沉淀越多，通过测定颜色的深浅也就是吸光值来反映细胞代谢活性的强弱，而细胞代谢活性与细胞数量呈正比，从而反映细胞数量的多少。
缺点： MTT被还原形成的有色沉淀需要溶解后才能比色，检测用时较长，检测结果会受到沉淀溶解效果的影响。
三、实验材料和用品：细胞计数法：待测细胞悬液、细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、微量移液器及枪头、酒精棉球、吸水纸、台盼蓝染液MTT法：贴壁细胞（A549 肺癌细胞株）酶标仪、酶标板振荡器、超净工作台，倒置显微镜，CO2培养箱、96 孔培养板，EP 管及管架，微量移液器及枪头、5mg/ml MTT 溶液，DMSO 溶液，1640 完全培养液四、实验操作（细胞计数法）：实验过程分为四个环节：（首先）清洁细胞计数板及盖玻片—（然后）镜检计数室—（接着）细胞加样—（最后）细胞计数具体操作细节如下：1、清洁细胞计数板及盖玻片：用 75%酒精棉球仔细擦拭细胞计数板的计数室区域，接着擦拭盖玻片，放置吸水纸上自然晾干；2、镜检计数室：1）细胞计数板和盖玻片干燥后，将盖玻片覆盖到细胞计数板的计数室部位；2）在显微镜下观察擦拭效果，确定计数室区域已擦拭干净、能清晰看到计数室的大方格及中方格3）直接平行移出计数板，平放在实验台上；3、待测细胞加样：1）将待测细胞悬液混匀后，吸取 10ul 细胞悬液加入 EP 管，然后再吸取10ul台盼蓝染液加入 EP，混匀，染色静置 2 分钟。
细胞计数方法------细胞计数板法..
细胞计数方法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个格的平均值。
所以，细胞密度=m×16×104个/ml)说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000ul=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
）================================================细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
细胞计数方法--细胞计数板法
细胞计数方法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104个/ml(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个格的平均值。
所以，细胞密度=m×16×104个/ml)说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而 1ml=1000ul=1000mm3（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
）================================================细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。
但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
《临床检验基础》课程中细胞计数的常用方法
《临床检验基础》课程中细胞计数的常用方法细胞计数是临床检验中常用的一种方法，用于测量体液或组织中的细胞数量。
细胞计数的结果可以反映出疾病的程度和进展情况，对于疾病的诊断和治疗具有重要的参考价值。
本文将介绍细胞计数的常用方法。
一、直接计数法直接计数法是最常用的一种细胞计数方法。
其原理是将待测液体或组织样本通过显微镜观察，手工计数细胞数量。
该方法操作简单、准确性高，但由于需要手工计数，所以工作量大，速度慢，不适用于大批量样本的计数。
二、电子计数法电子计数法是一种自动化的细胞计数方法，通过电子计数器对待测样本进行计数。
该方法具有快速、高效、准确的优点，适用于大批量样本的计数。
但是，该方法需要设备的支持，成本较高，同时对于不同类型的细胞计数，需要进行不同的设备调整，操作难度较大。
三、显微镜计数法显微镜计数法是一种通过显微镜观察待测样本进行计数的方法。
该方法适用于细胞数量较少的样本，可以进行手工计数或电子计数。
该方法操作简单，准确性较高，但需要使用显微镜进行观察，对于不同类型的细胞计数，需要进行不同的显微镜调整，操作难度较大。
四、流式细胞术流式细胞术是一种通过细胞表面标记物的特异性识别和分离，实现对细胞种类和数量的分析的方法。
该方法具有高准确性、高速度、高通量的优点，适用于大批量样本的计数和分析。
但是，该方法需要设备的支持，成本较高，同时对于不同类型的细胞计数，需要进行不同的设备调整，操作难度较大。
综上所述，细胞计数是临床检验中常用的一种方法，其常用的方法包括直接计数法、电子计数法、显微镜计数法和流式细胞术。
不同的方法适用于不同的样本类型和计数需求，临床医生需要根据实际情况选择合适的方法进行细胞计数，以提高诊断和治疗的准确性和效率。
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细胞计数法
细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。
一般利用计数板（血球计数板）进行。
即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。
不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。
1、制备细胞悬液
对于悬液培养的细胞，可直接进行下面的步骤2（计数与计算过程）。
如果计数对象为贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。
1）、终止培养，将培养液吸出，用PBS洗培养物一次。
2）、给培养瓶内加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，于37℃消化1-3min 。
期间在镜下观察。
当细胞变圆接近脱壁时，弃消化液。
3）、加入一定量的培养液（如果这些培养细胞不再有用，可加PBS），用吸管吹打，使细胞脱壁而制成细胞悬液。
2、计数与计算过程
1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。
2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。
3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。
对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。
4）、按下式计数细胞悬液的密度：
细胞密度＝（4个大正方格细胞总数/4）×稀释倍数×104个/ml
注：稀释倍数（至少乘以2，因与trypanblue等体积混合）
表示不计数：
范例：
T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
（其实取20ul即可）
活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2
细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106
细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243
注意事项：
1）、务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。
2）、显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。
如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2
时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。
血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
0.4%w/v trypan blue（GibcoBRL15250-061 ）
Erythrosin bluish（SigmaE-9259）
细胞计数及活力测定
一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。
计数结果以每毫升细胞数表示。
细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。
复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）
2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液
三、操作步骤
（一）细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×稀释倍数×10-4
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
（二）细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。
（其实取20ul即可）
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
（三）MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。
其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。
2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。
3、37℃下保温2小时。
4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。
打匀。
5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。
注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
附：1、0.4%台盼兰染液配制：
台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。
2、MTT配制：
MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。
4℃下保存。
3、酸化异丙醇配制：
异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。