细胞培养之细胞计数
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
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M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
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7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
细胞生物学细胞计数法和MTT法
实验题目：细胞增殖和活力的检测方法一、摘要：细胞增殖是生物体生长和繁殖的基础，当细胞增殖发生异常时往往会导致疾病的发生，比如肿瘤的发生就是细胞增殖失控的结果。
掌握细胞增殖和活力的检测是从事细胞生物学研究的一个重要方面。
针对细胞增殖和活力的检测方法有很多，这些方法除了能用于细胞本身增殖特性的研究、还能应用于药物毒副性检测，生长因子对细胞增殖和活力的影响等。
二、实验原理：〔1〕细胞计数法：最简单直接的方法：传统细胞计数的方法是用血球计数板，原理：将一定量的细胞悬液载入固定体积的玻片夹层中，在显微镜下数出细胞数量，然后换算出原始的细胞悬液浓度。
使用自动化细胞计数器，它通过拍下计数界面照片，利用软件程序设定去识别细胞，实现自动化计数。
好处:这种方法能兼容台盼蓝染色，染上蓝色的细胞视为死细胞，直接观察就能大致判断细胞的活力状态，计数后能定量分析细胞存活率。
缺点:①它的灵敏度低②线性范围太窄，细胞浓度低于 10 万个/ml 则计数不准确。
〔2〕 MTT 法MTT 称为噻唑蓝，是一种黄颜色染料。
定义：MTT 比色法是一种通过检测细胞代谢活性间接反映细胞增殖的方法。
原理：活细胞线粒体里的酶能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，活细胞数量越多，形成的有色沉淀越多，通过测定颜色的深浅也就是吸光值来反映细胞代谢活性的强弱，而细胞代谢活性与细胞数量呈正比，从而反映细胞数量的多少。
缺点： MTT被还原形成的有色沉淀需要溶解后才能比色，检测用时较长，检测结果会受到沉淀溶解效果的影响。
三、实验材料和用品：细胞计数法：待测细胞悬液、细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、微量移液器及枪头、酒精棉球、吸水纸、台盼蓝染液MTT法：贴壁细胞（A549 肺癌细胞株）酶标仪、酶标板振荡器、超净工作台，倒置显微镜，CO2培养箱、96 孔培养板，EP 管及管架，微量移液器及枪头、5mg/ml MTT 溶液，DMSO 溶液，1640 完全培养液四、实验操作（细胞计数法）：实验过程分为四个环节：（首先）清洁细胞计数板及盖玻片—（然后）镜检计数室—（接着）细胞加样—（最后）细胞计数具体操作细节如下：1、清洁细胞计数板及盖玻片：用 75%酒精棉球仔细擦拭细胞计数板的计数室区域，接着擦拭盖玻片，放置吸水纸上自然晾干；2、镜检计数室：1）细胞计数板和盖玻片干燥后，将盖玻片覆盖到细胞计数板的计数室部位；2）在显微镜下观察擦拭效果，确定计数室区域已擦拭干净、能清晰看到计数室的大方格及中方格3）直接平行移出计数板，平放在实验台上；3、待测细胞加样：1）将待测细胞悬液混匀后，吸取 10ul 细胞悬液加入 EP 管，然后再吸取10ul台盼蓝染液加入 EP，混匀，染色静置 2 分钟。
培养皿规格细胞计数
培养皿规格细胞计数是一项重要的实验室工作，它可以帮助研究人员评估细胞生长情况并确定最佳的细胞培养条件。
以下是关于培养皿规格细胞计数的1000字回答：一、背景知识细胞计数是生物学研究中的一项基本技术，主要通过计数细胞数量来评估细胞生长情况。
常用的细胞计数方法包括活细胞计数和死细胞计数的区分。
培养皿是一种常见的细胞培养容器，具有较大的容积，可以容纳大量的培养液和细胞。
在计数细胞时，我们需要考虑培养皿的规格对计数结果的影响。
二、培养皿规格对细胞计数的影响培养皿的规格对细胞计数的影响主要体现在两个方面：一是计数难度，二是计数结果的准确性。
1. 计数难度培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，这会增加计数难度。
在计数大量细胞时，容易出现漏计或重复计数的现象。
因此，我们需要采用适当的计数策略，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察。
2. 计数结果的准确性培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，但计数结果的准确性不一定越高。
这主要受到以下因素的影响：（1）死细胞的比例：在细胞培养过程中，一些细胞可能会死亡，这些死亡的细胞在计数时不会被计入，因此会使计数结果偏小。
相反，一些活细胞可能会在生长过程中死亡，这些死亡的细胞在计数时会被计入，因此会使计数结果偏大。
因此，我们需要对死细胞进行准确的区分和计数，以获得更准确的细胞数量。
（2）污染细胞的比例：在细胞培养过程中，一些杂质可能会进入培养皿中，这些杂质在显微镜下看起来像细胞，但实际上不是真正的细胞。
这些污染细胞的加入也会使计数结果偏大。
为了减少污染细胞的干扰，我们需要选择高质量的培养基和过滤器，并在显微镜下仔细观察每一个视野中的细胞。
三、结论和建议综上所述，培养皿规格对细胞计数的影响是显著的。
为了获得准确的细胞数量，我们需要采用适当的计数策略和技巧，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察；同时，我们还需要注意死细胞和污染细胞的区分和计数。
小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。
2、学习细胞计数的方法。
3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。
细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。
2．细胞死活鉴定。
常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
本次实验即采用此方法。
伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。
3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。
细胞计数原理
细胞计数原理
细胞计数是生物学和医学领域中常用的实验技术之一，用于确定给定样本中细胞的数量。
细胞计数原理基于显微镜下观察细胞形态、结构和数量的方法。
以下是细胞计数的原理及其步骤。
1. 样本制备：首先，从待测样本中取得一定数量的细胞。
样本可以是细胞培养物、血液样本、组织样本等。
确保样本取得的方式不会破坏细胞的完整性。
2. 稀释样本：根据细胞的浓度，将样本适当稀释。
这样有助于将细胞分散开来，使其更容易被计数和观察。
3. 准备计数室：可以使用计数室或者用带有方格的显微镜载片。
计数室有预定的区域，用来放置需要计数的细胞。
4. 抹片制作：在计数室或者显微镜载片上制作细胞抹片。
将少量稀释的细胞放在载玻片上，然后用另一块载玻片将其涂抹开来，形成一个薄层的细胞悬液。
5. 显微镜观察：在显微镜下使用适当的放大倍率观察制作好的细胞抹片。
细胞通常可见为圆形或不规则形状。
6. 细胞计数：通过目视细胞数量和位置进行计数。
通常是在计数室或方格中选择一个特定的区域计数，然后根据所选择的区域的大小和形状进行计算。
7. 计算细胞浓度：使用计数的结果可以计算出细胞的浓度。
假
设样本已经稀释了，可以将计数的细胞数乘以稀释倍数来计算初始样本中的细胞数量。
细胞计数是许多实验和研究中必不可少的步骤。
通过了解细胞计数的原理和步骤，可以对细胞样本的数量和浓度进行准确的评估。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
细胞的培养-传代-计数-冻存-复苏
一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。
2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。
吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。
反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。
进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。
（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。
细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。
注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。
降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
培育技术中细胞存活率的评估方法
培育技术中细胞存活率的评估方法在细胞培育的过程中，细胞存活率是一个非常重要的指标，它可以反映细胞培养的成功与否，以及细胞在特定条件下的适应能力。
因此，评估细胞存活率的方法对于细胞培养的研究具有重要意义。
一、显微观察法显微观察法是最常见的评估细胞存活率的方法之一。
通过在显微镜下观察细胞的形态和染色情况，可以初步判断细胞的存活与否。
存活的细胞通常具有完整的形态，胞质透明，核染色体鲜艳。
而死亡细胞则可能出现胞浆膨胀、核固缩等现象。
二、染色评估法染色评估法是一种常用的细胞存活率评估方法。
通过染色剂染色细胞，然后观察染色细胞的数量和形态，来评估细胞的存活率。
一种常用的染色剂是胞浆内的乙酰化酯酶，乙酰化酯酶是活细胞中的一种酶，死细胞则失去乙酰化酯酶的活性。
因此，通过染色乙酰化酯酶，可以将活细胞和死细胞区分开来，从而评估细胞存活率。
三、流式细胞术流式细胞术是一种高分辨率的细胞存活率评估方法。
通过流式细胞仪测量细胞的荧光强度或其他物理性质，可以精确计算出细胞的存活率。
流式细胞术可以同时检测多个指标，例如DNA含量、膜完整性等，从而更准确地评估细胞的存活率。
四、细胞计数法细胞计数法是一种简单直接的评估细胞存活率的方法。
通过显微镜观察，使用计数板或血细胞计数实验仪来计算特定区域内的细胞数量，然后与总细胞数进行比较，即可得到细胞存活率。
这种方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，但对于大规模的细胞培养可能不太适用。
综合上述方法，我们可以选择合适的方法来评估细胞存活率。
当然，每种方法都有其优缺点，需要根据具体研究目的和条件来选择。
同时，为了准确评估细胞存活率，我们还需要注意一些实验中可能的干扰因素，例如培养基成分、温度、PH 值等。
总结起来，选择合适的评估方法对于培育技术中细胞存活率的研究非常重要。
显微观察法、染色评估法、流式细胞术和细胞计数法都是常用的方法，根据实际情况选择最适合的方法，可以更准确地评估细胞的存活率。
同时，还需要注意实验中的干扰因素，以保证评估结果的准确性。
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细胞培养之细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备：
用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。
活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误：
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六.本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项：
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
简便方法：
胰蛋白酶液消化>>离心>>PBS液1ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液>>取1ul悬液+9ulPBS>>细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.用10ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）的细胞数目。
4.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×106。