几种测蛋白含量方法的比较
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内一种重要的有机化合物，具有构建细胞结构、调节生理功能等重要作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于生物科学研究和临床诊断具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质含量测定方法及其原理。
一、比色法比色法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂形成显色物，根据显色物的光吸收特性来测定蛋白质的含量。
1. 低里氏法低里氏法是一种经典的蛋白质含量测定方法，其原理是利用试剂双硫苏三唑酮（DTNB）与蛋白质中的半胱氨酸残基反应产生黄色的二硫苏三唑，然后通过分光光度计测定其在412nm处的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 伯杰法伯杰法是一种基于酪蛋白与浊度试剂金霉素的显色反应来测定蛋白质含量的方法。
酪蛋白与金霉素结合形成沉淀，通过比色法测定沉淀的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
3. 白蛋白-酷伊斯基（BCA）法BCA法是一种常用的高灵敏度蛋白质测定方法，其原理是在碱性条件下，蛋白质与BCA试剂中的铜离子络合生成紫色的离子螯合物，通过比色法测定在562nm处的光吸收度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
二、光谱法光谱法是一种基于蛋白质在特定波长下的吸收特性来测定蛋白质含量的方法。
1. 紫外吸收法紫外吸收法根据蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、酪氨酸和色氨酸）在紫外光区域（200-400nm）的吸收特性来测定蛋白质含量。
通过分光光度计测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度，再根据标准曲线计算出蛋白质的含量。
2. 近红外光谱法近红外光谱法是一种无损、非破坏性的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质溶液在近红外光区域（700-2500nm）的吸收特性与其含量之间的关系。
通过近红外光谱仪获取蛋白质溶液的光谱图像，然后利用化学计量学方法建立标准模型，通过光谱图像预测蛋白质的含量。
三、生化分析法生化分析法是一种利用生化技术和仪器设备来测定蛋白质含量的方法。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，其含量的测定对于生物学和医学研究具有重要意义。
目前常用的蛋白质含量测定方法主要包括生物化学法、生物物理法和免疫学法等。
下面将对这几种方法的原理进行详细介绍。
1. 生物化学法：生物化学法通过酶促反应或化学反应，将蛋白质转化成可以测定的可溶物或在一定条件下呈现特定吸光度的产物，从而测定蛋白质的含量。
常用的生物化学法有Lowry法、Bradford法和BCA法。
(1) Lowry法：Lowry法是1969年由Lowry等人开发的一种蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂在碱性条件下发生氧化反应，生成具有最大吸收峰的蓝色产物，通过测定产物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(2) Bradford法：Bradford法是Bradford于1976年提出的一种测定蛋白质含量的方法。
该方法基于蛋白质与染料(Coomassie Brilliant Blue G-250)之间的特异结合，蛋白质和染料形成一个蛋白质-染料复合物，该复合物的吸光度变化与蛋白质的浓度呈正相关。
通过测定复合物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(3) BCA法：BCA法是一种在碱性条件下，将蛋白质还原成具有强吸收的蓝色离子的方法。
BCA试剂(含有琥珀酸铜II配合物和增强剂)能与蛋白质中的酸性氨基酸残基(尤其是含有两个以上连续胺基的肽键)发生氧化还原反应，生成具有强吸收的蓝色离子。
利用光密度测定产生的蓝色离子与一系列标准溶液进行比较，即可确定蛋白质的含量。
2. 生物物理法：生物物理法是通过光学原理，利用蛋白质溶液对光的吸收、散射或旋光等性质进行测定，来间接推算蛋白质的含量。
常用的生物物理法有紫外吸收光谱法、比色法和荧光法等。
(1) 紫外吸收光谱法：紫外吸收光谱法是通过蛋白质在紫外光区域的吸收特性来测定蛋白质的含量。
三种常见蛋白质含量测定方法
三种常见蛋白质含量测定方法
蛋白质含量是决定植物质量的重要因素，在植物栽培及种子货架上，精确掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
目前，研究常用的植物蛋白质含量测定方法有Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种。
Kjeldahl法是一种多功能性的蛋白质定量方法，它可以测定含氮量甚至微量有机氮，此法在测定蛋白质含量方面易于操作，测试效率高， get精度也较高。
该法简单地以氨作为氮源，以硫酸释放氨，用硫酸钠将氨碱中的氨携带，然后进行缓冲及蒸发水解，最后通过酚酞形成深蓝色络合物对氮进行定量，从而间接的得到蛋白质的含量。
Bradford法同样是一种多用途的法子，它能够直接测定蛋白质中的色氨酸及胆羧酸含量，该方法的操作简便，使用成本低，测试效率高，可在一个小时内达到较高精度的测定结果。
Bradford法原理是将蛋白质及它的沉淀由蛋白质合酶结合至二价铬J络合物，从而形成一种光电的特异性比色反应。
Lowry法也是一种多功能性的定量方法，该方法能测定有机物中蛋白质、氨基酸等氮含量，以及各种物质中的亲合体，操作过程简单，精度也较高，比Kjeldahl法快7倍以上，Lowry法原理是蛋白质分解成其中的氨基酸，通过对色比色反应，底物络合过程自络合金属，再经冷酰膦处理，酰膦中色素降解，形成比色荧光，定量检测氮含量，从而间接得到蛋白质含量。
以上就是蛋白质含量测定常见三种方法。
从Kjeldahl法，Bradford法和Lowry法等三种方法，人们可以很好地掌握植物蛋白质含量，进而为植物中品质和效用性提供重要的评价依据。
经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介-课件
（二）材料
标准蛋白溶液(10mg/ml BSA)、 未知液(人血清×10)
（三）试剂
双缩脲试剂 溶解0.175 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于 15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸 馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h， 再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15 分钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时, 其max由465 nm 变为595nm
强碱性缓冲 液；Triton
X-100;SDS
最好的方法; 干扰 物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同 蛋白质变化
一、实验目的
➢掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理
和方法。
➢进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原
用于标准蛋白质 含量的准确测定; 干扰少;费时太长
灵敏度低 1～20mg
中速 多肽键＋碱性 20~30 Cu2＋紫色络 分钟 合物
硫酸铵;Tris 缓冲液；某 些氨基酸
用于快速测定, 但 不太灵敏; 不同蛋 白质显色相似
较为灵敏 50～100g
快速 5～10 分钟
各种蛋白质中的 Tyr和Trp残基在 280 nm处的光吸 收
嘌吟和嘧啶； 用于层析柱流出 各种核苷酸 液的检测；核酸
的吸收可校正
灵敏度高～ 5g
慢速 40～ 60分 钟
双缩脲反应; 磷 钼酸－磷钨酸试 剂被Tyr和Phe还 原
硫酸铵; Tris 缓冲液;甘氨 酸;各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝 法
(Bradford法)
生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较
①容量瓶②试管及试管架
③恒温水浴槽④吸量管
⑤分光光度计⑥电热套
⑦锥形瓶⑧比色皿
(3)紫外吸收法
试剂:
样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。
器材:
①紫外分光光度计②容量瓶
③试管、试管架④吸量管
⑤锥形瓶⑥比色皿
4．实验方法步骤及注意事项
双缩脲法
标准曲线的绘制:
取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。
实验远没有我想象的那样简单，要想做好一个实验，容不得半点马虎。综合实验正是这培养了我们的耐心、恒心和信心，让我们的思维和创造力得到了大幅度的提高，让我们的科学素养有了很大的飞越。真真正正变学生的被动学习为主动学习，激发了我们的学习热情，不管实验成功或是失败，我们都能从中获得很多从其它地方得不到的知识，让我们获益匪浅！
若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
5.实验数据处理方法
双缩脲法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
O．D540
0
0.021
0.052
0.160
0.316
0.345
0.08
0.029
标准蛋白质浓度(mg/ml）
0
1
2
3
4
5
X
Y
考马斯亮蓝染色法
试
剂
0
1
2
3
4
5
样品1
样品2
蛋白质浓度（ug/ml）
样品测定:
①制备样品的蛋白质提取液。
②取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份
计算:
4种-蛋白质含量测定方法的比较
蛋白质含量测定方法的比较蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。
目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford）。
其中Bradford 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20 倍,比Biuret法灵敏100 倍以上。
凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
这4种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑：⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度；⑵蛋白质的性质；⑶溶液中存在的干扰物质；⑷测定所要花费的时间。
1 凯氏定氮法1. 1 原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4 个过程。
其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨, 氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
1. 2 特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。
凯氏定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜2.50 g, 硫酸钾0.10 g,浓硫酸4.00 mL；硫酸铜的用量为影响消化时间的主要因素,硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第三主要因素；用此最佳条件做实验, 消化时间仅为12 min；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方法对比,该法所需消化时间最短,试剂用量减少,可降低实验成本,也降低了对环境的污染。
凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确,重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。
若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。
2 双缩脲法(Biuret )2. 1 原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出1 个分子氨后得到的产物。
蛋白质含量测定方法及优缺点
蛋白质含量测定方法及优缺点嘿，咱先说说凯氏定氮法吧！这方法就是把蛋白质里的氮给测出来，然后再换算成蛋白质含量。
步骤呢，先把样品消解，让蛋白质里的氮变成铵盐，再用碱把铵盐变成氨气，用硼酸吸收氨气，最后用酸滴定硼酸里的氨。
哇塞，听起来是不是超厉害？注意事项嘛，消解的时候一定要小心，别让样品溅出来烫伤自己。
这方法安全不？只要操作得当，还是挺安全的。
稳定性也不错，只要仪器状态好，结果就比较准。
那它应用场景可多了去了，像食品检测、饲料分析啥的都能用。
优势就是比较经典，大家都认可。
比如说检测牛奶的蛋白质含量，用凯氏定氮法就很靠谱，结果准确得很呢！再讲讲双缩脲法。
这方法是利用蛋白质和双缩脲试剂反应产生颜色变化来测含量。
步骤就是把样品和双缩脲试剂混合，然后看颜色深浅。
简单吧？注意不能有干扰物质哦，不然颜色就不准了。
安全性那是杠杠的，没啥危险。
稳定性也还行，只要试剂没问题。
应用场景呢，像生物制品检测就常用。
优势就是快速方便呀！想象一下，这就像你一下子找到了宝藏，又快又准。
比如检测蛋白质溶液，双缩脲法几分钟就能出结果，多爽！最后说说考马斯亮蓝法。
这个是靠蛋白质和考马斯亮蓝结合变色来测。
把样品加进考马斯亮蓝溶液里，颜色一变就知道含量了。
注意溶液的浓度要合适哦。
安全得很，没啥风险。
稳定性也不错。
应用在生物化学实验里很多。
优势就是特别灵敏。
这就好比你有一双超级厉害的眼睛，啥都能看得清清楚楚。
比如检测蛋白质提取物，考马斯亮蓝法能检测出微量的蛋白质，厉害吧！总之，不同的蛋白质含量测定方法都有自己的特点和优势，咱得根据实际情况选择合适的方法，这样才能准确又高效地测出蛋白质含量。
蛋白质定量的方法
蛋白质定量的方法蛋白质是构成生物体的重要组成部分，对于理解生物体的结构和功能具有重要意义。
因此，准确测定蛋白质的含量是许多生物科学领域研究的基础。
目前，人们已经发展出了多种方法来定量蛋白质的含量。
本文将介绍几种常用的蛋白质定量方法及其原理、优缺点和应用范围。
1. 高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography, HPLC）HPLC是一种常用的蛋白质分离和定量方法。
它利用样品中蛋白质与流动相在分离柱中的相互作用来实现分离和定量。
HPLC方法的优点是分离效果好、重复性好、能够同时检测多个样品。
但是，该方法需要相对较高的设备要求和操作技巧，对样品预处理也较为复杂，且比较耗时。
2. 比色法比色法是一种常用的定量蛋白质的方法。
其中，低里氏试剂法和双硫键试剂法是比较常用的比色法。
低里氏试剂法是通过蛋白质与龙氏试剂（碱性铜硫脲）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
双硫键试剂法则是通过蛋白质与2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）之间的比色反应来定量蛋白质含量。
比色法具有操作简单、设备要求低等优点，但是对于不同类型的蛋白质，比色反应的敏感度和选择性可能不同。
3. 显微波特光度法（Bradford法）Bradford法是一种常用的蛋白质定量方法，基于酒红素（Coomassie BrilliantBlue G-250）与蛋白质之间的相互作用产生的颜色变化。
蛋白质与酒红素结合后，溶液的吸收光谱发生变化，可测量溶液的吸光度来定量蛋白质含量。
该方法操作简单快捷，而且灵敏度较高，适用于常规蛋白质定量。
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定量方法，可以通过电泳分离蛋白质并定量。
该方法通过将样品中的蛋白质在电场中进行分离，然后通过比色或者近红外成像等方法来定量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质含量测定方法的比较及肽含量的测定一）蛋白质测定方法的比较（原理、优缺点）蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。
其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20 倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。
定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度; （2）蛋白质的性质;（3）溶液中存在的干扰物质；（4）测定花费时间。
蛋白质含量测定法，目前包括定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry 法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法。
其中考马斯亮蓝和福林酚法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比双缩脲法灵敏100倍以上。
定氮法较复杂，但准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
在选择方法时应该考虑：（1）实验测定要求的灵敏度和精确度; （2）蛋白质的性质;（3）溶液中存在的干扰物质; （4）测定花费时间。
1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）1.1原理样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
1.2 操作方法样品经前处理、炭化、消化、蒸馏、滴定等主要步骤1.3特点准确度较高，适用于0.2~ I.Omg氮，误差为^2%;操作复杂费时，整个过程需要耗时8~10h,试剂消耗量大。
，测得结果为总氮含量，包括蛋白氮和非蛋白氮含量；适用范围广，几乎所有样品均可用此方法。
2 双缩脲比色法2.1原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。
因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm 测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。
22操作方法标准蛋白溶液或样液直接加双缩脲试剂反应30min，即可测定。
先绘制标准曲线，再测定样品2.3特点灵敏度低1〜20mg , 20~30分钟操作简便、呈色稳定性好、试剂单一；测定结果与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关；灵敏度不高，约为1mg，双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
3 福林酚法（Lowry 法）3.1原理蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
该化合物在750nm 有最大吸收峰。
3.2操作方法测定依次加福林酚甲液、乙液后可见光度计750nm测定；先绘制标准曲线、再测定样品。
3.3特点试剂配制略麻烦，但试剂可长期保存；测定灵敏度高，约5mg ，测定时间约40〜60 分钟，操作简便；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化测定结果受待测样品蛋白中肽键存在形式及含量的影响）。
4 紫外吸收法4.1原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
4.2操作方法直接上紫外分光光度计测定，需绘制标准曲线4.3特点灵敏度50〜100mg ，5〜10分钟完成，操作十分简便，但结果受样品蛋白品种影响大。
5 考马斯亮蓝法5.1原理考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm 处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
5.2操作方法直接加考马斯亮蓝试剂反应5min 后即可测定；先绘制标准曲线，再测定样品。
5.3特点灵敏度高，约为1〜5mg （比Lowry法灵敏4倍），测定时间5〜15分钟，操作简便、迅速、干扰物质少、重线性好，但要求样品颜色为无色或浅色，灵敏度高。
二）蛋白含量的测定方法及步骤1 微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）1.1 试剂硫酸铜、硫酸钾、硫酸、2%硼酸溶液、混合指示液（1 份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合；或2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合）、40%氢氧化钠溶液、0.1mol/L 盐酸标准溶液。
1.2 仪器消化架、吸量管、量筒、微量滴定装置、锥形瓶、容量瓶、定氮蒸馏装置1.3 分析步骤：1.3.1 消化精密称取固体样品0.2~2g,半固态2~5g，液体样品10~20mL （约相当于30~40mg 氮）于干燥洁净的凯氏烧瓶，加入6g 无水K2SO4，0.2g CuSO4，20mLH2SO4。
瓶口放一小漏斗，先小火加热待泡沫停止后加大火（330~400C）,直到溶液澄清透明，再继续加热0.5h~1h。
冷却后加水定容100mL （数次冲洗，使样品溶液全部移入容量瓶）1.3.2 蒸馏将2%硼酸溶液10mL 放入100mL 三角瓶中（接收瓶），加入甲基红混和指示剂2~3 滴，此时为紫红色，将冷凝管尖端浸入液面下。
蒸馏装置中的水蒸气发生器装水2/3，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
准确吸取2.0 mL〜10.0 mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。
将10.0 mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。
夹紧螺旋夹，开始蒸馏。
蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。
然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。
1.3.3 滴定馏出液用标准HCl 溶液滴定，直到蓝绿色变为淡紫色。
并将滴定结果用空白试验校正。
1.3.4 计算：蛋白质(%) = (V i-V2)x CX 0.0140X FX 100/m V3X 100%V i—样品滴定时消耗的标准HCI溶液体积（mL）V2—空白滴定时消耗的标准HCI溶液体积（mL）C—标准HCI溶液的摩尔浓度（moI/L ）0.0140—1mL 1moI/IL HCI 相当于0.0140g 氮F —氮换算成蛋白质的系数，一般食物为6.25m—试样的质量（g）V3—测定时吸取消化液的体积（mL）2 双缩脲法2.1 试剂（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/mL的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280nm为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O或0.9% NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称取 1.50g硫酸铜（CuSO4.5H2O ）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6.4H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10% NaOH溶液, 用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.2 器材可见光分光光度计、试管1 5支、旋涡混合器等。
2.3操作方法2.3.1标准曲线的测定：取7支试管，分别加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8，1.0mL 的10mg/mL标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温(20~25°C)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
以蛋白质的含量为横坐标，光3 福林酚法(Lowry法)3.1试剂3.1.1试剂甲：50份A与1份B混合，即为试剂甲A 液：10g Na2CO3, 2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6.4H2O)。
溶解于500 mL蒸馏水中。
B液：0.5g硫酸铜(CuSO4?5H2O)溶解于100mL蒸馏水中。
3.1.2试剂乙:在2 L磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H fe O), 25g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)及700 mL 蒸馏水，再加50 mL85%磷酸，100 mL 浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150g硫酸锂(Li2SO4), 50 mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤) 。
稀释至1L,过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L 左右。
3.1.3标准蛋白质溶液（250他/mL ）:精确称取结晶牛血清清蛋白，溶于蒸馏水 再定容。
3.2仪器可见光分光光度计、旋涡混合器、秒表、试管3.3分析步骤3.3.1标准曲线的测定：取7支大试管，分别加入0，0.1, 1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为 250 pg/mL ）。
用水补足到 试管加入5mL 试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（ 分钟。
再逐管加入0.5 mL 试剂乙，同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置 10分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试4紫外吸收法 4.1分析步骤 4.1.1绘制标准曲线取八只试管分别加入 0 ml 、0.5 ml 、1.0 ml 、1.5 ml 、2.0 ml 、2.5 ml 、3.0 ml 、 4mL 的1mg/mL 牛血清蛋白标准溶液，加水至 4 mL ，在280nm 条件下测定其吸 光值0.2，0.4，0.6, 0.8, 1.0毫升，然后每支 20〜25C ）放置10 管作为空白对照，于750nm 处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质浓度为横5考马斯亮蓝法 5.1试剂 5.1.1 1mg/mL 牛血清蛋白标准储备液：精密称取0.1g 牛血清蛋白标准品用蒸馏 水定容于100mL 容量瓶。
5.1.2 100卩g/m.牛血清蛋白标准工作液液：取 10mL 牛血清蛋白标准储备液加 水定容至100mL5.1.3考马斯亮蓝试剂：取0.1g 考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入 lOOmL 质量浓度为0.85 g/mL 的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到lOOOmL 。