紫外吸收法测蛋白质含量的方法(精)
紫外吸收法测定蛋白质含量分析灵敏度的测定
紫外吸收法测定蛋白质含量分析灵敏度的测定一．实验目的：1.掌握紫外分光光度计法测定蛋白质浓度的原理与方法，及其优缺点；2.掌握分析灵敏度的概念及原理；3.进一步掌握标准曲线的测定及利用标准曲线求物质浓度的方法。
二．实验原理：分析灵敏度即可检测的最低分析物浓度。
这个浓度限值对毒品检验在法庭上特别重要，希望通过检测知道样品中究竟有无药物，这是很关键的。
另外，肿瘤标志物及许多特定蛋白应该有一个可检测的最低浓度或某个量；如：前列腺特异蛋白，这是病人治疗后监视复发的重要信息；长期来，临床对报告的前列腺特异蛋白究竟有意义的最小量要求予以明确。
核酸检测报告的阴、阳性也要求说明，能检出的最小拷贝的核酸量或者相当于多少病毒，因此，确定检测系统的可报告底限是重要的分析性能。
检测低限（LLD ）每次检测，总是做一个空白样品。
检测方法常以空白响应值校准至零点，再检测各检测样品的反应响应值。
这些样品的反应响应值在扣除了空白相应量后，是分析物的对应响应量。
但是，空白响应量也有波动。
若重复多次做空白检测，以空白均值和标准差表示这些空白响应量的平均水平和所有空白响应量对于空白均值的离散程度指标。
在确定方法性能或绘制标准曲线时，常常以空白均值表示空白响应量。
实际工作时，每次只做一个空白，这个空白响应量各有50%的可能性，大于或小于空白均值。
当空白响应量小于空白均值，对同一个样品检测响应值（为扣除空白响应量）。
似乎反映分析物要多一点，检测方法要灵敏些，当空白响应量大于空白均值，似乎原先可以检测出来的东西检测不出来了。
统计说明：如果空白响应量的波动服从正态分布规律：每个单位检测的空白响应值x 有95%的可能性为：空白空白空白空白s *2x x *2+≤≤-s x即空白空白空白s *2x -x ≤其中较空白均值小的一半会使分析物更易检测出来，若有一个检测响应量较空白响应量均值大于空白s *2，仍然认为是响应量的可能性只有5%；有95%的可能性属于样品中分析物形成的检测响应值；它较空白均值差空白s *2以上。
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量
实验9 紫外吸收法测定蛋白质含量（一）原理蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等残基，它们的结构中具有共轭双键，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。
在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。
若将已知不同浓度的蛋白质标准溶液在280nm处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。
此法测定迅速，用量较少，而且不消耗样品和试剂。
但若样品中含有其他在280nm吸收的物质，如嘌呤嘧啶等化合物时，就有干扰作用。
（二）试剂及器材（1）标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液。
（2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液。
（三）操作1. 280nm的光吸收法（1）标准曲线的绘制：取8支试管，编号后按下表加入试剂。
混匀，选用光程为1cm的石英比色杯，在紫外分光光度计280nm波长处以0号管调“零”分别测定各管溶液的光密度（OD280）。
以纵坐标为光密度值，横坐标为蛋白质浓度绘出标准曲线。
（2）样品测定：取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
2．280nm和260nm的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2~2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。
应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。
公式：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45 OD280—0.74 OD260。
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理紫外吸收法是一种常用的测定蛋白质含量的方法。
它基于蛋白质分子中含有芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的特性，这些氨基酸在紫外光区域（200-400 nm）有很强的吸收能力。
因此，蛋白质溶液在紫外光的照射下，会发生吸光现象，吸收的光强度与蛋白质的浓度呈正相关关系。
紫外吸收法测定蛋白质含量的原理可以用以下步骤来描述：1. 准备样品溶液：将待测蛋白质样品溶解在适当的缓冲液中，使其达到所需浓度。
2. 设置测量条件：根据样品的特性和仪器的要求，选择合适的波长和路径长度，以确保能够准确测量吸光度。
3. 调零：在测量前，先用纯缓冲液调零仪器，以消除仪器本身的吸光度。
4. 测定吸光度：将样品溶液放入光路中，通过紫外光的照射，测量样品的吸光度。
根据比尔-朗伯定律，吸光度与溶液中物质的浓度成正比。
5. 构建标准曲线：为了确定未知样品的蛋白质含量，需要测量一系列已知浓度的标准样品的吸光度，并绘制标准曲线。
标准曲线应该是线性的，通过对标准曲线的测量，可以根据吸光度值计算出蛋白质的浓度。
6. 计算蛋白质含量：根据未知样品的吸光度值，利用标准曲线上的回归方程，可以计算出未知样品中蛋白质的浓度。
紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是测量简单、快速、准确，且不需要破坏样品，可以重复使用。
然而，该方法也有一些限制，例如只能测定芳香族氨基酸含量较高的蛋白质，对于无芳香族氨基酸的蛋白质不适用。
另外，一些物质的存在（如某些化合物或离子）可能会影响测量结果，需要进行干扰校正。
在实际应用中，紫外吸收法常用于测定蛋白质的总含量，而不适用于定量特定蛋白质的含量。
对于后者，需要使用其他方法，如比色法、荧光法或质谱法。
紫外吸收法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，基于蛋白质分子中芳香族氨基酸的吸光特性。
通过测量样品的吸光度，并与已知浓度的标准样品建立标准曲线，可以准确计算出蛋白质的含量。
该方法简单、快速、准确，但对于含有较低芳香族氨基酸含量的蛋白质可能不适用。
药典-蛋白质含量测定(紫外吸收法、Lowrry法、双缩脲法)
3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。
以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。
用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。
紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。
计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。
蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。
1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。
3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。
2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。
取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
两种测定蛋白质含量方法的比较(精)
其中,Y为标准曲线查得ห้องสมุดไป่ตู้白质得浓度（mg/mL），N为稀释倍数， V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度（mg/mL）。
注意事项
（1）须于显色后30min内比色测定。各管由显色到比色的 时间应尽可能一致。 （2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混 合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液 再测定。 （3）由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显 色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只 适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外 蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋 白质含量的准确性。
• 试剂：
双缩脲试剂：
试剂和器材
• 材料
1. 标准蛋白溶液 两种浓度的结晶牛血清白蛋白
溶液(BSA)。
2. 待测蛋白质溶液 人血清（稀释适当倍数，使其浓 度在标准曲线测试范围内。）
操作方法
一、制作标准曲线 二、样品测定
三、计算 取两组测定的平均值计算：
YxN 血清样品蛋白质含量（mg/100mL）=
紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品， 低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗 脱情况的检测。
此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色 氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中核酸 等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测 定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可 测定蛋白范围应在0.1~1.0mg /mL。
思考题
1．干扰双缩脲实验的因素有哪些？ 2．若样品中含有核酸类杂质，应该如何校正实验结
紫外分光光度法测定蛋白质含量_百度文库(精)
教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。
紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理一、紫外吸收法。
紫外吸收法是一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是根据蛋白质在280nm波长处的特征吸收峰来进行测定。
在实验中，首先将待测样品溶解于适量的缓冲液中，然后使用紫外可见分光光度计测定样品在280nm处的吸光值，通过标准曲线的对照，可以计算出样品中蛋白质的含量。
二、比色法。
比色法是另一种常用的蛋白质含量测定方法，其原理是利用蛋白质与某些特定试剂发生化学反应后产生显色物质，通过测定显色物质的吸光值来计算样品中蛋白质的含量。
常用的试剂包括布拉德福试剂、伯杰试剂等，不同试剂适用于不同类型的蛋白质测定。
三、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子与蛋白质中的蛋白质酰基发生还原反应的测定方法。
其原理是将待测样品与BCA试剂混合后在60℃条件下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
四、Lowry法。
Lowry法是一种以菁蓝G与蛋白质发生化学反应产生显色物质的测定方法。
其原理是将待测样品与碱液、菁蓝G和还原剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
五、总蛋白法。
总蛋白法是一种直接测定样品中总蛋白含量的方法，其原理是将待测样品与总蛋白试剂混合后在室温下反应，然后使用分光光度计测定产生的显色物质的吸光值，通过标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
总结，蛋白质含量的测定方法及原理有多种，每种方法都有其适用的样品类型和测定条件，研究人员可以根据自己的实验需要选择合适的方法进行蛋白质含量的测定工作。
希望本文所介绍的内容能为相关领域的研究工作提供一定的参考价值。
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紫外吸收法测蛋白质含量的方法
蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
特别适用于
柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。
核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。
但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。
此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。
1.280nm的光吸收法
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1%1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与
（A1%1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。
文献值A1%1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度= (A280´10 )/ A1%1cm,280nm (mg/ml)
(Q 1%浓度»10mg/ml)
2.280nm和260nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。
核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。
通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 » 1.8
纯核酸的光吸收比值： A280/A260 » 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml) 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。
3.215nm与225nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225 以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。
再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH,0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。
4.肽键测定法
蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。
因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm 的光吸收值A238，以A238为纵座标,蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。
未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。
本方法比280nm吸收法灵敏。
但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。
所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。
若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。