胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立
家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2009(013)028【摘要】BACKGROUND: Rabbit serum samples are widely used in basic researches, and two-dimensional gelelectrophoresis (2-DE) is the most classic technique for protein separation. Therefore, it is of great significance to establish a stable technique system of 2-DE for rabbit serum.OBJECTIVE: To establish a 2-DE technique system for rabbit serum protein separation. DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observational experiment was performed at Tianjin Key Laboratory of Biomarkers for Occupational and Environmental Hazard of Chinese People's Armed Police Forces Medical College from June to July in 2008. MATERIALS: Six healthy rabbits were provided by the Animal Experimental Center of Tangshan Vocational Technical College METHODS: Health rabbit serum was dissolved in rehydration sample loading buffer before and after eliminating high abundance proteins to make proteins in it schizolysis adequately. After reductive alkylation, the samples were loaded into the rehydration tray to undergo passive rehydration for 14 hours. Isoelectric focusing (IEF) electrophoresis was followed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After sliver staining, the gel was analyzed by PDQuest7.4. MAIN OUTCOME MEASURES: ①Efficiencyof eliminating high abundance proteins. ②Two-dimensional eleotrophoregrams (2-D electrophoregrams)RESULTS: Distinct 2-D eleotrophoregrems were obtained with high resolution and good reproducibility. The removal of high abundance proteins in serum failed to result in better 2-D electrophoregrams.CONCLUSION: We have successfully established a 2-DE technique for rabbit serum proteome, which can lay the foundation for the further study of serum proteomics of diseases.%背景:家兔血清是基础研究中常用的实验样品,双向凝胶电泳是蛋白质组学中最经典的蛋白分离技术,因此建立稳定的家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术体系非常重要.目的:建立家兔血清蛋白分离的双向凝胶电泳技术体系.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2008-06/07在武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室完成.材料:健康家兔6只,由唐山市职业技术学院动物中心提供.方法:去除高丰度蛋白前后的健康家兔血清样品,分别加入水化上样液使样品中的蛋白充分裂解,还原烷基化后上样,被动水化14 h.等电聚焦电泳后进行SDS-PAGE电泳.凝胶银染后用PDQuest7.4软件进行分析.主要观察指标:①高丰度蛋白去除效率.②2-DE图谱.结果:双向电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好.未去除高丰度蛋白的血清2-DE图效果优于去除高丰度蛋白后的血清2-DE图.结论:成功建立家兔血清蛋白质双向凝胶电泳技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.【总页数】4页(P5440-5443)【作者】要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲【作者单位】唐山职业技术学院基础医学部,河北省唐山市063004;武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津市300162;华北煤炭医学院基础部病理生理教研室,河北省唐山63000;华北煤炭医学院基础部病理生理教研室,河北省唐山63000;武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津市300162;唐山职业技术学院基础医学部,河北省唐山市063004【正文语种】中文【中图分类】R341【相关文献】1.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 董红;王世鑫;罗来龙;栾大伟2.寻常型银屑病血清蛋白质组学研究中双向凝胶电泳-质谱技术的初步建立 [J], 刘占奎;谭升顺;于春水;樊靖华;白转丽;李俊杰3.优化并建立双向凝胶电泳初步研究糖尿病视网膜病变血清蛋白质组 [J], 李俊;贾丽丽;陆琳娜;王悦4.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 张明顺;李雪华;兰晓霞;栾大伟;赵化冰;王世鑫5.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立 [J], 李雪华;李欣;丁彦青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析李杨目的：筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白，并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用。
方法：建立胎兔背部切割伤模型，运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质，并进行质谱和数据库检索分析。
结果：筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织中特异高表达的蛋白质点，经过质谱和数据库检索分析后确定：伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(异质性胞核核糖核蛋白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加。
结论：上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控，促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配，以及促进细胞的增殖、分化和发育等，促进胎兔皮肤创伤的修复，参与其无瘢痕愈合过程。
标签：胎兔；皮肤；无瘢痕愈合；创伤：蛋白质组；基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱自Burrington首次发现胎儿皮肤创伤后修复无瘢痕形成，并确立了“无瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以来，“无瘢痕愈合”模式成为人们孜孜以求的理想，但至今胚胎个体“无瘢痕愈合”的具体机制还不清楚。
我们在前期的研究中发现在胎兔皮肤创伤无瘢痕愈合过程中确有基因表达的差异存在，且差异表达基因可能在其过程中具有重要的作用。
而基因最终是通过蛋白质的表达才发挥其功能，本实验运用双向电泳技术，筛选胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白，并进行初步分析。
1材料和方法1．1动物与试剂：健康雌性大耳白兔20只，体重(3．0～3．5)kg(第三军医大学大坪医院动物中心)，“速眠新”合剂(长春农牧大学兽医研究所)，哺乳动物总蛋白提取试剂盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)预制胶条(Bio-Rad公司)，银染增强型试剂盒(Bio-Rad公司)。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用体会
像分析系统 。还应该强调分析 中是否进行了光密度 的校准 和空 间的标定以及 ＭＯ Ｄ的计算 方法 ， 以便 其他 科研 工作 者能够判 断测量结果 的精度 和客观性 。此外在科研实验 中不 能片面地夸 大计算机图像分 析的作用 ， 要注意样本 的代表性和随机性 ， 选择 合适的参数 ， 并保证实验条件和分析步骤完全统一 。
参 考 文 献
个 实 验 的 所 有 图 片手 工 进 行 上 述 的 分 析 步 骤 极 为 烦 琐 ，
并要保持 统 一 的标 准尤 为 困 难。这 就需 要进 行 批 处 理 ， 宏 即 （ ｃｏ 功能 ， Ｍａｒ） 该功能 由图像 分析软件提 供 ， 操作 中不受人 为 在
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最后聚焦结束为36000v1124胶条的平衡重泡胀和等电聚焦结束后用四蒸水打湿的滤纸充分吸干胶条上的矿物油和多余的样品把胶条放入平衡液i胶条平衡缓冲液母液10mldtt03g中于摇床摇振15rain再于平衡液胶条平衡缓冲液母液10iill碘乙酰胺0375g中摇床摇振15min25第二向电泳sdpage用滤纸吸去胶条上多余的水化液及样品将胶条转移至事先制好的聚丙烯酰胺凝胶上转移时注意胶条支持膜紧贴长玻板胶面朝向短玻板
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
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概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
《蛋白质双向电泳》课件
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。
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孕 "# N 的新西兰大耳白兔、 行宫内手术致胎兔皮肤全层切割伤， "& 0 后 取致伤胎兔及其同胞未致伤胎兔背部皮肤，分别确定为致伤组和未致 伤组， 应用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取其总蛋白。应用双向电泳法 电泳结束后硝酸 将致伤组和未致伤组分别制成 * 块固相 VA 梯度胶条， 银染色、 图像扫描。同一胶条进行 * 次双向电泳， 对所得图像进行蛋白 质点、 匹配率以及伤后蛋白表达差异的分析。 结 果：致伤组和 未致伤组胎 兔皮肤组织 总蛋白分别 分离出蛋白 质点 （ （ 个、 个， 在两组中各选 ’ 块胶作为参考胶进行 * 块 ’#$ b ’& ） ’#8 b ’( ） （ 个、 个， 匹配率分别 胶间的匹配， 平均匹配点数分别是 （ 88 b 8 ） (# b ) ） 同一样本 * 块胶上不同蛋白质点在第一向的位置偏差分 为 8&d 、 8*d ， 别为 （ #4 8$ b #4 "$ ）55、 （ #4 ( b #4 & = 55， 在 第 二 向 的 偏 差 分 别 为 （ （ ’4 "$ b #4 $ ）55、 ’4 $ b #4 $ ）55。通过比对得到胎兔伤后表达增加的 蛋白质点 "# 个。 结论：加大皮肤组织总蛋白上样量进行双向电泳得到重复性和分辨率 均较好的电泳图谱， 并初步找到伤后差异表达的蛋白质点， 为无瘢痕愈 后的深入实验研究打下基础。 电泳 主题词： 创伤； 动物， 皮肤； 蛋白质类 > 分析；
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