以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较

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【人教版】初中生物第二单元《生物体的结构层次》期末考知识点

【人教版】初中生物第二单元《生物体的结构层次》期末考知识点一、选择题1．科学家利用胚胎干细胞成功培育出了心肌细胞。

依据的原理主要是下图中的哪个过程A．①B．②C．③D．④【答案】D【解析】【分析】细胞分化是指细胞在生长过程中细胞的形态、结构和功能发生变化的过程，细胞分化形成了不同的组织，如动物的肌肉组织、上皮组织、神经组织和结缔组织，植物的保护组织、营养组织、分生组织和输导组织。

【详解】图示中①、②、③表示细胞分裂，细胞分裂使细胞数目增加。

细胞分化是指细胞在生长过程中细胞的形态、结构和功能发生变化的过程，细胞分化形成了不同的组织。

因此，利用胚胎干细胞培育心肌细胞的原理是④细胞分化，细胞分化的结果是形成了不同的组织。

故选D。

【点睛】解答此类题目的关键是理解掌握细胞分裂、细胞分化的过程和特点。

2．下列属于器官的是( )A．番茄果肉B．洋葱鳞片叶C．血液D．口腔上皮【答案】B【解析】【分析】除病毒以外，细胞是生物体结构和功能的基本单位。

组织是细胞分化的结果，细胞分化产生了不同的细胞群，每个细胞群由形态相似，结构、功能相同的细胞联合在一起形成的，这样的细胞群叫组织。

器官是由不同的组织按照一定的次序结合在一起构成的。

系统是由能够共同完成一种或几种生理功能的多个器官按照一定的次序组合在一起构成的。

【详解】A.番茄果肉属于营养组织，具有营养的作用，故A错误。

B.洋葱鳞片叶属于器官，是由不同的组织按照一定的次序联合起来形成具有一定功能的结构，故B正确。

C.血液属于结缔组织，由血浆和血细胞组成，故C错误。

D.口腔上皮属于保护组织，故D错误。

故选B。

【点睛】本题考查器官的概念，解题的关键是理解器官的概念。

3．制作临时装片时必须让盖玻片的一边先接触水滴，然后缓缓放下，其目的是（）A．防止水溢出来污染装片B．避免实验材料移动C．避免盖玻片下面出现气泡D．增强透明度【答案】C【解析】【分析】在制作临时装片在盖盖玻片这一步很重要，要不然容易产生气泡，气泡与细胞重叠不易观察。

【人教版】八年级生物第七单元《生物圈中生命的延续和发展》知识点

【人教版】八年级生物第七单元《生物圈中生命的延续和发展》知识点一、选择题1．营养繁殖是植物最常见的无性生殖方式，与有性生殖相比最根本的区别是（）A．繁殖速度快，新个体与母体相似B．能够保持母体优良性状C．不经过两性生殖细胞的结合D．产生后代的过程中不产生生殖细胞【答案】C【解析】有性生殖指的是两性生殖细胞精子和卵细胞结合形成受精卵，由受精卵发育成新个体的过程。

无性生殖指的是不需要经过两性生殖细胞的结合，由母体直接产生新个体的过程。

所以有无两性生殖细胞的结合是无性生殖与有性生殖的本质区别。

2．学习了性状的遗传后，同学们议论纷纷：甲：“基因组成相同，性状不一定相同”乙：“性状表现相同，但基因组成不一定相同”丙：“隐性基因控制的性状一定被隐藏起来”丁：“生物的变异都能遗传给后代”上述四位同学的说法，不正确的是（）A．甲乙B．甲乙丙C．丙丁D．甲乙丙丁【答案】C【解析】【分析】生物体的形态结构、生理特性和行为方式都称为性状。

基因控制生物的性状，但不能控制生物的全部性状，还受环境的影响。

生物体的某些性状是由一对基因控制的，而成对的基因往往有显性和隐性之分，当控制生物性状的一对基因都是显性基因时，显示显性性状；当控制生物性状的基因一个是显性一个是隐性时，显示显性基因控制的显性性状；当控制生物性状的一对基因都是隐性基因，显示隐性性状。

【详解】生物的特征是由遗传物质决定的，但也会受环境因素的影响。

因此，基因组成相同，则性状不一定相同，甲同学说法正确；性状表现相同，则基因组成不一定相同，如单眼皮和双眼皮是一对相对性状，双眼皮为显性，基因组成为AA或Aa，乙同学说法正确；生物体的某些性状是由一对基因控制的，而成对的基因往往有显性和隐性之分，当控制生物性状的一对基因都是显性基因时，显示显性性状；当控制生物性状的基因一个是显性一个是隐性时，显示显性基因控制的显性性状；当控制生物性状的一对基因都是隐性基因，显示隐性性状。

2017年高考生物分类试题及答案汇编知识点19 现代生物科技专题

知识点19 现代生物科技专题1.(2017·江苏高考·T11)牛雄性胚胎中存在特异性H-Y抗原,可在牛早期胚胎培养液中添加H-Y单克隆抗体,筛选胚胎进行移植,以利用乳腺生物反应器进行生物制药。

下列相关叙述正确的是( )A.H-Y单克隆抗体由骨髓瘤细胞分泌B.应选用原肠胚做雌雄鉴别C.鉴别后的雄性胚胎可直接做胚胎移植D.用H-Y抗原免疫母牛可获得相应抗体【解析】选D。

H-Y单克隆抗体一般是用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞相融合形成的杂交瘤细胞来制备,A项错误;早期胚胎细胞分化程度低、全能性高,应选用囊胚的滋养层做雌雄鉴别,B项错误;进行胚胎移植应选用雌性胚胎,C项错误;用H-Y抗原免疫母牛,该母牛可以产生相应的抗体抵御H-Y抗原,D项正确。

2. (2017·江苏高考·T14)下列关于小鼠体外受精及胚胎发育的叙述,错误的是( )A.精子在获能液中于37℃、5% CO2条件下培养的目的是使精子获能B.小鼠在特定光控周期条件下饲养,注射相关激素有促进超数排卵的作用C.分割的胚胎细胞有相同的遗传物质,因此发育成的个体没有形态学差异D.注射到囊胚腔中的胚胎干细胞可以参与个体器官的发育【解析】选C。

在37℃、5% CO2条件下,精子在获能液中培养是为了使精子获能,获能后的精子才有受精能力,A项正确;小鼠在特定光控周期条件下饲养,并注射促性腺激素,可以促进排卵(或超数排卵),B项正确;分割的胚胎细胞有相同的遗传物质,但是遗传物质在发育过程中可能有差异性的表达,所以发育成的个体可能有形态学差异,C项错误;注射到囊胚腔中的胚胎干细胞因为具有发育的全能性,且有滋养层为其提供营养,可以参与个体器官的发育,D项正确。

3. (2017·北京高考·T5)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。

浙江高三高中生物月考试卷带答案解析

浙江高三高中生物月考试卷班级:___________ 姓名：___________ 分数：___________一、选择题1.糖类不含有，脂质不一定有，蛋白质也不一定有，而核酸一定有的元素是()A．N B．S C．P D．Fe2.下列有关高等植物原生质体制备和培养的叙述，正确的是()A．纤维素酶和果胶酶混合液可用于制备悬浮培养细胞的原生质体B．加入0．6mol/L甘露醇的目的是保护纤维素酶和果胶酶C．从不同植物组织分离得到的原生质体亚显微结构相同D．原生质体的结构由细胞膜、液泡膜及两膜之间的细胞质组成3.下列属于哺乳动物和人体“内环境”的是()A．呼吸道内的气体B．消化道内的消化液C．毛细血管内的血浆D．膀胱内的尿液4.能催化DNA分子一条链上两个相邻的核苷酸形成磷酸二酯键的酶有()①限制性核酸内切酶②DNA连接酶③DNA聚合酶④反转录酶A．①②③B．①③④C．①②④D．②③④5.下列哪一项是通过减少生长素产生量而发生的 ()A．修剪树篱，降低其高度，可以使其枝繁叶茂B．稻农将水稻种子置于流动的河水中一段时间，促其早发芽C．将未成熟果实密封一段时间，果实成熟时间缩短D．移栽树苗之前，将部分叶片摘除，树苗更容易成活6.下图为突触结构模式图，下列有关说法正确的是()A．在a中实现电信号→化学信号的转变，该信息传递需要能量B．①中内容物以被动转运的方式释放至②中C．兴奋传递时，②处的组织液含有特异性受体D．①中内容物使b兴奋时，兴奋处外表面分布着正电荷7.下列关于细胞学说及其建立过程的叙述，不正确的是()A．离不开技术的支持B．需要理性思维和实验的结合C．论证了动植物的统一性D．标志着生物学的研究进入分子水平8.下列有关生态系统结构的叙述，正确的是()A．每种生物在生态系统中只能处在一个营养级上B．动物都属于消费者，其中食草动物处于第二营养级C．自养生物都是生产者，是生态系统的主要成分D．细菌都属于分解者，其异化作用类型有需氧型和厌氧型两类9.通过以下方法所获得的免疫能力在体内保持较长时间的是()A．成人注射丙种球蛋白(抗体)B．注射乙肝疫苗C．婴儿通过母乳获得某些抗体D．注射淋巴因子10.某些类型的染色体结构和数目的变异，可通过对细胞有丝分裂中期或减数第一次分裂时期的观察来识别。

(通用版)高二生物专题05 胚胎工程暑假作业(含解析)-人教版高二全册生物试题

专题05 胚胎工程【知识回顾】1.受精(1)精子获能：刚刚排出的精子，不能立即与卵子受精，必须在发生相应的生理变化后，才能获得受精能力。

(2)卵子的准备：卵子要在输卵管内进一步成熟，到期时，才具备与精子受精的能力。

(3)受精过程；获能的精子穿过→精卵通过细胞表面的糖蛋白相互识别→精子遗传物质进入卵细胞→原核形成和融合。

(4)防止多精子入卵的机制：第一道屏障：反应，第二道屏障：反应。

(5)受精标志和受精完成的标志：受精的标志是在之间观察到两个极体；而受精过程完成的标志是。

2.早期胚胎发育3.体外受精(1)卵母细胞的采集和培养(2)精子的采集和获能(3)受精：和培养成熟的卵子在或专用的受精溶液中完成受精作用。

4.胚胎的早期培养(1)目的：检查受精状况和受精卵的发育能力。

(3)胚胎处理：向或冷冻保存。

5.胚胎移植(1)地位：胚胎工程其他技术的最后一道工序。

(2)过程：(3)意义：充分发挥。

6.胚胎分割(1)材料：发育良好，形态正常的。

(2)实质：胚胎分割可增加动物后代，其实质是。

(3)分割要求：对囊胚分割时，注意将均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

7.胚胎干细胞(1) 。

【想一想】例1.关于受精过程的叙述错误的是A．获能后的精子与卵子相遇后，释放顶体酶穿过透明带进入放射冠B．透明带反应是防止多精入卵的第一道屏障C．精子与卵黄膜相互融合，精子入卵D．雄原核形成的同时，卵子完成减数第二次分裂例2.治疗性克隆有望最终解决供体器官的短缺和器官移植出现的排异反应等问题。

下图表示治疗性克隆的过程，下列有关叙述不正确的是A．上述过程利用了动物细胞核移植、动物细胞培养等技术B．上述过程充分说明动物细胞具有全能性C．①过程的完成离不开胚胎干细胞的增殖和分化潜能D．①②过程都发生DNA的复制和蛋白质的合成例3.让羊产牛奶，科学家对此做了相关的构想，过程如图所示。

请据图判断下列说法正确的是A．图中涉及的现代生物技术有基因工程、动物体细胞核移植、胚胎移植、胚胎分割和动物细胞融合B．小羊a、小羊b、小羊c的性状表现不同，小羊a与羊N的性状表现相同C．若研究发现羊N细胞中线粒体基因的表达产物丰富，故而它的产奶率高，则小羊a会有这一优良性状D．依据目前的生物技术和理论，还不能通过生物工程手段获得新物种“羊—牛”【练一练】1.分析下面图解判断以下哪一项不是精子、卵细胞发生的区别A．初级精母细胞、初级卵母细胞的形成时间B．MⅠ和MⅡ的时间连续性C．成熟生殖细胞是否经过变形D．成熟生殖细胞中染色体的数目2.通过体外受精培育牛的过程，下列叙述错误的是A．①过程获取的卵子如果来源于实验动物，通常可直接与获能精子在体外受精B．②过程在获能液中完成后，可以在卵细胞膜和透明带之间观察到两个极体C．③过程细胞在发育培养液中以有丝分裂增殖，开始出现早期分化D．④过程属于胚胎移植过程，移植的胚胎应发育到桑椹胚或囊胚3.牛胚胎移植试验的主要流程如下，下列相关叙述正确的是①供体超数排卵→②配种→③胚胎收集→④______→⑤胚胎移植→子代小牛。

细胞工程作业题

细胞工程作业题判断题1.细胞与组织培养技术是细胞工程最基本技术。

（√）2.细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。

（√）3．Van Beneden和Strassbruger分别于1876年和1884年在动物和植物中观察到了受精和精卵融合现象。

（×）Van Beneden和Strassburger分别于1883和1886年在动物和植物细胞中发现减数分裂。

Hhertwig和Strassbruger分别于1876年和1884年在动物和植物中观察到了受精和精卵融合现象4．预防细胞污染是细胞培养成功与否的关键。

（√）5．抽滤式滤器压力比较恒定，滤过效果比加压滤过好，蛋白质不易变性。

（×）加压式滤器压力比较恒定，滤过效果比抽滤滤过好，蛋白质不易变性。

6．0.２２μm滤膜可去除支原体，过滤除菌最保险。

（×）0.1μm滤膜可去除支原体，过滤除菌最保险。

一般为0.22μm滤膜除菌效果较保险。

7.四级生物安全是生物安全实验室等级最高的实验室。

( √ )8.酸性活体染料只用于体外活体染色，体内活细胞难以着色。

（×）酸性活体染料只用于体内活体染色，体外活细胞难以着色9.培养细胞一旦发生污染多数将能够挽救。

( × )无法挽救10.反复使用抗生素使微生物产生耐药性，但对细胞本身无影响。

( × )对细胞本身有一定影响判断题1.由细胞接触而抑制细胞运动的现象称为接触抑制。

（√）2.原代培养细胞与体内原组织相似性很小。

（×）相似性大3. Hanks液缓冲能力较强，利用空气平衡。

（×）Hanks液缓冲能力较弱，需利用空气平衡4.合成培养基是十分完全的培养基。

（×）尚未成为十分完全5.原代培养是建立各种细胞系的第一步。

（×）原代培养是建立细胞系第一步6.组织块法不适合于组织量少的原代培养。

( × )特别适合7.动物细胞培养工艺的选择首先考虑的是该产品所涉及的生物反应器系统。

八年级生物下册第七单元考点归纳人教版

八年级生物下册第七单元考点归纳（人教版）第七单元生物圈中生命的延续和进展第一章生物的生殖和发育一、植物的无性生殖和有性生殖．有性生殖：（d2）由两性生殖细胞结合成受精卵，由受精卵发育成新个体的生殖方式。

（优势：后代具有更大的生活力、变异力）2．无性生殖：（d4）不通过两性生殖细胞结合，由母体直接产生新个体的生殖方式。

3．无性生殖常见的方式有扦插和嫁接：嫁接有枝接和芽接，成活的关键是使接穗与砧木的形成层紧密结合。

4、组织培育：（d6）是利用无性繁衍原理，使植物组织在人工操纵的条下，通过细胞的增殖和分化，快速发育成新植株的高新技术手腕。

（利用茎尖、根尖、花药、花粉等）二、昆虫的生殖和发育（d13）．完全变态:在由受精卵发育成新个体的进程中,幼虫与成体的结构和生活习性不同专门大,这种发育进程叫完全变态发育卵→幼虫→蛹→成虫。

举例：家蚕、蜜蜂、蝶、蛾、蝇、蚊2．不完全变态:卵→假设虫→成虫。

举例：蝗虫、蝉、蟋蟀、蝼蛄、螳螂三、两栖动物的生殖和发育进程、青蛙发育进程：雄蛙鸣叫→雌雄蛙抱对→蛙的卵块（体外受精）→蝌蚪→青蛙二、青蛙发育的四个时期：受精卵、蝌蚪、幼蛙、成蛙。

3、青蛙的幼体生活在水中，用鳃呼吸，成体生活在陆地，也能生活在水中，用肺呼吸，兼用皮肤辅助呼吸。

致使两栖动物散布范围和种类少的缘故是：两栖动物的生殖和幼体发育必需生活在水中，幼体经变态发育才能上陆。

4、环境转变对两栖动物繁衍的阻碍：致使两栖动物生殖和繁育能力下降。

显现畸形蛙的缘故：水受到污染。

四、鸟类的生殖和发育进程（d17-18）、鸟卵的结构：胚盘里面含有细胞核。

卵壳和壳膜——爱惜作用，卵白——营养和爱惜作用，卵黄——营养作用。

胚盘——胚胎发育的场所。

卵黄、卵黄膜、胚盘是一个卵细胞。

二、鸟类的生殖和发育进程：求偶、交配、筑巢、产卵、孵卵、育雏。

第二章生物的遗传和变异一、基因操纵生物的性状（d24-26）、遗传是指亲子间的相似性，变异是指亲子间和子代间的不同。

(全国通用)高考生物二轮复习胚胎工程和生态工程专题卷1(2021年整理)

（全国通用）2018届高考生物二轮复习胚胎工程和生态工程专题卷1 编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（（全国通用）2018届高考生物二轮复习胚胎工程和生态工程专题卷1）的内容能够给您的工作和学习带来便利。

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胚胎工程和生态工程一、单选题1．下列有关说法中,不正确的是（ )A．观察卵子是否受精的重要标志是卵细胞膜和透明带之间是否出现两个极体B．胚胎移植时受体需选择遗传性能和生产性能优秀的个体C．标志着受精作用完成的是雎雄原核融合形成合子D．胚胎工程实际上是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁育后代的过程【答案】B【解析】试题分析：当精子与处于减二中期的次级卵母细胞结合时(即受精时）,次级卵母细胞才被激活分裂出第二极体，所以只要在卵黄膜和透明带之间能看到两个极体就代表有精子与其受精，A 正确;胚胎移植技术中，供体要有优秀的遗传性能和生产性能,但受体不需要，B错误；标志着受精作用完成的是雎雄原核融合形成合子,C正确；胚胎移植实际上是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程，D正确.考点:胚胎移植2．我国在西部多省区实行退耕还林还草工程，这一工程属于A. 农村综合发展型生态工程 B。

大区域生态系统恢复工程C. 小流域综合治理生态工程 D。

湿地生态恢复工程【答案】B【解析】试题分析：大区域生态系统恢复工程的问题有问题由于过度樵采、过度放牧、盲目开垦、不合理利用水资源荒漠化，故B正确.点睛：生态工程的实例分析3．下列不属于细胞工程技术的是A. 将高产奶牛的早期胚胎移植到普通母牛的体内,产出高产小奶牛B. 经体细胞杂交,获得胡萝卜-羊角芹植株C. 培养人的细胞构建人造皮肤D。

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以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较作者：刘永刚，李芳菲，陈地龙，王莎莉，王亚平【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类Comparison between STO cells and hELF used as feeder layers of embryonic germ cells【Abstract】 AIM: To compare the influence on the growth of human embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant (STO) cells and human embryonic lung fibroblasts（hELF）respectively as feeder layers and the changes of the two kinds of the feeder layers themselves processed with mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured hELF of 3-4 month embryos. The changes of the two kinds of the feeder layers themselves treated with mitomycin C were observed. STO and hELFs erved as feeder layer to cultivate human EG cells.The formation rate of embryonic germ cell colony and the expression of EG cell surface markers(SSEA1, SSEA4) expression were detected. to discuss the influence on human EG cell growth. RESULTS: HELF treated by mitomycin C survived longer than STO cells treated by mitomycin C did. There was no obvious difference between the two kinds of feeder layers in the formation rate and immunologic markers (SSEA1, SSEA4) of EG cell colony. CONCLUSION:HELF as feeder layers is better than STO cells in culturing EG cells.【Keywords】 STO cells; embryonic lung fibroblasts; embryonic germ cells; humans【摘要】目的：比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化. 方法：分离、培养3~4 mo hELF，观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化，以STO细胞和hELF 作为饲养层培养人EG细胞，计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4). 结果：经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异. 结论：在培养人EG细胞时，hELF饲养层较STO 细胞饲养层更有优势.【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类0引言自1998年Thomason等［1］首次建立人胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)系和Shamblott等［2］建立人胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG)系以来，胚胎性干细胞研究已成为当今生命科学领域内的热门课题. 胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞，将为细胞、组织甚至器官替代治疗提供无限细胞来源，也将为临床治疗模式带来革命性变革［3］. 谢松涛等［4］也对人胚胎生殖嵴来源的人EG细胞进行了培养，但迄今为止，来源于人胚胎生殖嵴的EG细胞系仅有一例报道. 有学者认为STO细胞在建立人EG细胞系过程中具有不可替代的作用. 由于STO 细胞是来源于鼠的成纤维细胞系，用STO细胞作为饲养层将会给临床应用带来潜在的危险. 我们用STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast, hELF）作为饲养层培养人EG细胞，旨在探讨两种饲养层经丝裂酶素C处理后的变化和对EG细胞生长的影响.1材料和方法1.1材料高糖DMEM培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）购自GIBICO公司；无钙镁磷酸缓冲液 (Dulbeccos phosphate buffered saline, DPBS)、非必需氨基酸、二甲基亚砜、优质胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、β巯基乙醇、毛喉素（Forskolin）购自Sigma公司；丝裂霉素C 购自Kyowa Hakko Kogyo 公司；胶原酶购自上海桥源生物制药公司； DNA酶Ⅰ购自Roche公司；人重组碱性成纤维细胞生长因子(human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF) 购自Pepro Tech EC公司；人重组白血病抑制因子(human recombinant leukemia inhibitory factor, hrLIF)购自CHEMICON公司；抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)mAb和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)mAb由美国芝加哥大学Dr. Bruce Lahn提供；UltrasenstinveTM SP试剂盒购自迈新公司；DAB显色试剂盒购自中山公司；6～11 wk人工流产胚胎（重庆医科大学第二临床学院人流室同意提供）用于分离人EG细胞；3～4 mo胚胎用于制备hELF；STO细胞由本室保存.1.2方法mo人工流产胚胎肺组织，按照薛庆善等的方法分离获取hELF，常规方法培养传代，经反复传代获得纯化的hELF. 取对数生长期hELF，用终浓度为12.5 μg/mL丝裂霉素C处理2.5～3 h；DPBS 洗3次； 2.5 g/L胰酶消化2 min；DPBS洗3次；以细胞浓度为2×105/mL种植在1 g/L明胶处理后的24孔培养板中，每孔1 mL；置37℃，95%湿度和50 mL/L CO2恒温细胞培养箱中培养，4 h后吸去培养液和尚未贴壁的细胞，换入等量培养液，置培养箱中备用，1 wk内均可使用.，用终浓度为10 μg/mL丝裂霉素C按上述方法处理备用.wk胚胎生殖嵴用DPBS冲洗3次；400 U/mL的胶原酶0.5 mL, 37℃下消化45 min；灭菌加样枪反复吹吸，将生殖嵴离散为小细胞团；1 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA溶液，37℃下消化5 min；加入等体积含100 mL/L胎牛血清的培养液终止反应；加入200 U的DnaseⅠ作用10 min；轻柔吹打使细胞分离，胚胎干细胞培养液重悬后以1×105, 1×10, 1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF细胞饲养层，胚胎干细胞培养液包含800 mL/L高糖DMEM, 200 mL/L胎牛血清,2 mmol/L L谷胺酰氨,0.1 mmol/L非必需氨基酸,0.1 mmol/L 2巯基乙醇,10 μmol/L Forskolin, 2 μg/mL hrbFGF, LIF 10×105 IU/L, 10×104 IU/L青霉素和10×104 IU/L链霉素. 置50 mL/L CO2, 95%湿度,37℃恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基.d，在倒置相差显微镜下观察两种饲养层细胞的形态变化. 倒置相差显微镜下观察在STO细胞饲养层和hELF饲养层上人EG细胞集落形态., 1×104, 1×103/mL的细胞悬液，分别种植于STO细胞和hELF饲养层上，每种细胞浓度种植4个复孔. 置于37℃, 50 mL/L CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 计算集落形成率，即4个复孔形成集落总数与种植细胞总数之比.，40 g/L多聚甲醛固定15~20 min；经PBS洗3次；按免疫组化SABC法检测细胞表面抗原SSEA1和SSEA4（一抗工作浓度为1∶50）. 设不加一抗组为阴性对照组.统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS12.0进行方差分析F检验. 显著性水平α=0.05, P<0.05为有显著性差异.2结果2.1hELF体外生长与传代原代培养时所得细胞，细胞形状多种多样. 传代细胞至第3～5代时细胞形态基本一致，以长梭形成纤维样细胞为主，细胞排列成为放射状、漩涡状或栅栏状（图 1A）. 将其反复传至第45代，在第5～30代时生长最旺盛，平均3~4 d达到汇合；第31～45代时平均5~6 d达到汇合，形态无显著变化.2.2丝裂霉素C处理后STO细胞和hELF形态变化用人ES生长培养液培养STO细胞和hELF饲养层，培养48 h观察，STO细胞的培养液变黄，而人hELF的培养液颜色没有明显改变. 不更换培养液，培养72 h后，少部分STO细胞浮起，细胞内可见颗粒状物形成；培养超过6 d，大部分细胞浮起. 每3 d更换一次培养液，STO细胞培养5 d后有部分细胞浮起，细胞内出现颗粒状物（图 1B）. 而人hELF，培养7 d未见细胞浮起，细胞形态未见明显改变，并可维持14 d（图 1C）.2.3两种饲养层细胞对胚胎生殖细胞集落形成的影响人胚胎生殖嵴细胞以1×105，1×104，1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF饲养层上，培养7 d后观察计数. 结果显示：以1×104/mL 组，集落形成最多，集落形态典型 (图2A，B);1×103/mL组，集落形成数量最少；1×105/mL组，可见较多集落分化，集落细胞质中有颗粒样物出现,饲养层细胞和胚胎生殖细胞容易卷折. 以相同浓度种植胚胎生殖嵴细胞，两种饲养层细胞对人EG细胞集落形成率没有显著性差异.A: 丝裂霉素C处理前hELF； B: 丝裂霉素C处理STO细胞后培养7 d；C: 丝裂霉素C处理hELF后培养7 d.图1丝裂霉素C处理前后hELF和STO细胞×400（略）A: hELF饲养层上EG细胞集落；B: STO细胞饲养层上EG细胞集落.图2STO细胞和hELF饲养层上的EG细胞集落×400（略）2.4人胚胎生殖细胞集落免疫学特征经检测集落表面抗原SSEA1和SSEA4，显示两种饲养层细胞上培养的人胚胎生殖细胞集落均表达SSEA1和SSEA4（图3A，B）.A: hELF饲养层上表达SSEA1集落；B: STO细胞饲养层上表达SSEA4集落.图3胚胎生殖细胞集落表达SSEA1和SSEA4×400（略）3讨论饲养层是建立和维持人胚胎性干细胞系未分化状态的必要条件. 迄今为止，己分离得到的非人灵长类和人胚胎性干细胞系无一不是在有饲养层条件下建立和维持的，在无饲养层的情况下，人ES, EG 细胞毫无例外地分化为多种细胞类型. 目前已建立的人胚胎性干细胞系都以鼠源性胚胎成纤维细胞为饲养层［5］. 有报道称用人源性饲养层，如人胚胎皮肤和肌肉细胞、输卵管细胞和人骨髓基质细胞，也能维持人ES细胞体外增殖和保持其未分化状态，由于上述饲养层存在来源、体外增殖能力低等问题而在应用中受限［6-8］. 而在仅有的一例关于人EG细胞系的建系报道中，用MEF作为饲养层却是不成功的，因而有学者认为ST0细胞饲养层在人EG细胞建系中具有不可替代的作用. 这―结论是很难解释的，因为仅有一例报道，尚不能确定其他饲养层在人EG细胞建系中的确切作用，尤其是人胚胎成纤维细胞饲养层.我们的研究结果显示： 1×104/mL接种的生殖嵴细胞在两种饲养层上形成的人EG集落最多，且经过对集落的表面标志物SSEA1和SSEA4的检测证实所形成的集落为人EG细胞集落. 但是以STO细胞作为饲养层和以hELF作为饲养层之间对EG集落形成率并无显著性差异. 提示两种饲养层都能较好支持人EG细胞的生长和克隆的形成. 以1×105/mL和1×103/mL接种的生殖嵴细胞形成的EG集落数量较少，而两种饲养层之间EG集落形成率没有显著性差异，提示以1×105/mL浓度种植的胚胎生殖嵴细胞浓度大，细胞生长过快，尤其是胚胎生殖嵴中的其它细胞生长快，容易和饲养层细胞一起卷折，不利于胚胎生殖细胞集落的形成. 还由于胚胎生殖细胞集落培养体系的营养供给不足，造成部分集落分化. 而种植浓度太低，也不利于集落的形成. 因此以1×104/mL作为最佳的种植浓度，且最有利集落的形成.以STO细胞和hELF细胞作为饲养层分离、培养人EG细胞，hELF饲养层有以下优点：① hELF与人EG细胞相同种属，不会引入异种蛋白和动物源性病原微生物，更有利今后临床应用；②经过丝裂霉素C处理后，能在体外培养达14 d依然维持较好的生长状态. ③hELF能体外连续传代50代以上，较鼠胚胎成纤维细胞、成人骨髓基质细胞等明显长，且经过多次传代后细胞均一，同质性高，有利于对其培养体系的精确分析. 不足的是，迄今为止，没有利用hELF细胞饲养层建立人EG细胞系的报道.【参考文献】［1］ Thomson JA, ItskovitzEldor J, Shapiro SS, et al. 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