2.3基因工程常用的工具酶
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第三节 工具酶
第二章 基因工程
一 限制性核酸内切酶 二 DNA连接酶
基因工程常用的工具酶
1.1 定义：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链核苷酸内切酶。这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。
一 限制性核酸内切酶
Restriction Endonuclease
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。
细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
1.2 限制性核酸内切酶的发现——
寄主控制的限制与修饰现象：
?限制修饰系统：
定义：一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，该系统主要由限制内切酶和甲基化酶组成。
有些细菌体内含有限制酶，可将双股DNA切断，因此能将入侵的外来DNA摧毁；
细菌自身的DNA为什么不被降解？
细菌自身进化出了甲基化酶，它们的DNA经过了甲基化或糖基化的修饰，可阻碍限制酶的作用。
限制修饰系统作用机理
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限制修饰系统的作用：
保护自身的DNA不受限制；
破坏外源DNA使之迅速降解
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1.3 限制性内切酶的命名
根据其来源命名。如：
属名 菌株名
E co R I
种名 编号
EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
1.4 限制性内切酶的分类
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。
分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。
Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24-26bp处切开DNA，所以它的切割位点也是没有特异性的。
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① II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复序列(回文序列，即双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列）
② II型酶的切割功能 ★平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。
Ⅱ型酶
★5’端粘性末端（cohesive end)
在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。
★ 3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。（这类酶非常少）
II型限制酶的特性
1.不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列
2.限制酶的识别序列一般都具有回文结构
3.各种限制酶的切割类型是各
式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端
II型限制酶的特性
4. 星号活性 在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。
例如 EcoR I识别学列为G^AATTC在低盐浓度、高pH值条件下，EcoR I可能切割N^AATTN序列
1.DNA的纯度
蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质。
解决办法：
a.增加核酸内切限制酶的用量，
b.扩大酶催化反应的体系（稀释），
c.延长酶催化反应的保温时间。
影响核酸内切酶活性的因素
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影响限制性核酸内切酶活性的因素
2 DNA样品的甲基化程度：
大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等
影响限制性核酸内切酶活性的因素
3 核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。EcoR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3
’
4. 酶切消化反应的温度：
大多数酶的标准反应温度 37度。
5. DNA的分子结构：
某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。
影响限制性核酸内切酶活性的因素
1.5 同切酶与同尾酶
（1）同切酶
来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同切酶或同裂酶。
如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为CCGG，切割位点均为C↓CGG。
（2）同尾酶
来源不同，识别的核苷酸序列也不同，但切割后DNA分子产生的粘性末端却相同，这种酶称为同尾酶。
SalⅠ 5’ -G↓TCGAC- 3’ 5’ -G- -TCGAG- 3’
3’ -CAGCT↑G- 5’ 3’ -CAGCT -G- 5’
和
XhoⅠ 5’ -C↓TCGAG- 3’ 5’ -C- -TCGAG- 3’
3’ -GAGCT↑C- 5’ 3’ -GAGCT -C- 5’
两个粘性末端再连接后，产生
5’ -GTCGAG- 3’
3’ -CAGCTC- 5’
该DNA既不能为SalⅠ也不能为XhoⅠ所识别。
1.6 产生相同序列的突出末端的不同片段 的三种方式
?用同一种限制酶切割；
?用同切酶切割；
?用同尾酶切割。
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基因工程常用的工具酶
一 限制性核酸内切酶
二 DNA连接酶
二 DNA连接酶
2.1 定义：催化双链DNA一端的
3’OH与另一双链DNA 5’的磷酸根
形成3’，5’-磷酸二酯键，使具
有相同粘性末端或平末端的DNA末
端连接起来。
A T G C
T A C G
P P
OH
P
A T G C
T A G
P P
OH
C
P
腺嘌呤
核糖P
A T G C
T A C G
P P P
AMP
酶
（部分细菌）
酶
酶
缺
口
2.2 功能
连接缺口
ATP 或NAD
AMP PPi 或NMN
DNA连接酶只能连接缺口（nick），
不能连接裂口（gap）。
连接多个粘性末端双链DNA分子：
5‘ … C-T-C-G-A-G… 3’
3‘ …-G-A-G-C-T-C… 5’
5‘ … C-OH P-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … G-A-G-C-T-C-P OH-C … 5’
T4-DNA连接酶
连接多个平末端双链DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C … 5’
T4-DNA连接酶
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2.3 DNA连接酶的种类
T4 DNA连接酶
大肠杆菌 DNA连接酶
以ATP提供能量
以NAD＋提供能量
可以连接平末端和粘性末端
只能连接粘性末端
2.4 粘性末端和平末端双链DNA片段的连接操作
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。
提高平头末端连接效率的方法：
?加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）
?加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会
?加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用
?加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM