老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸_谷胱甘肽循环的影响

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大豆种子老化MDA和4HNE的含量变化相关性研究

研究报告高琴梅等:大豆种子老化M D A 和4-HN E 的含量变化相关性研究㊃研究报告㊃收稿日期:2018-11-23基金项目:国家自然科学基金项目(31671773);农作物种质资源保护项目(2016NW B 036-08)㊂作者简介:高琴梅(1992 ),女,湖南湘西人;在读博士研究生,主要从事植物学研究;E -m a i l :158********@163.c o m ㊂通讯作者:姜孝成(1964 ),男,博士,教授,主要从事植物发育与分子生物学研究;E -m a i l :j x c l c @h u n n u .e d u .c n㊂大豆种子老化M D A 和4-H N E 的含量变化相关性研究高琴梅1,2, 卢新雄2, 朱凌燕2, 辛霞2, 姜孝成1(1.湖南师范大学生命科学学院, 长沙410081; 2.中国农业科学院作物科学研究所, 北京100081)摘要:研究了大豆中豆27 种子在人工老化和自然老化过程中,电导率㊁丙二醛和4-羟基壬烯醛(4-h y d r o x y-(E )-2-n o n e n a l ,4-HN E )含量,4-HN E 的组织特异性积累及其与合成清除酶系统相关的基因表达调控差异,以探寻大豆种子的老化生理指标㊂结果表明,伴随着老化,大豆种子萌发率逐渐降低,浸泡液电导率逐渐增大;丙二醛含量升高;4-羟基壬烯醛(4-h y d r o x y -(E )-2-n o n e n a l ,4-HN E )在低活力干种子(萌发率10%)中积累量显著升高,且在人工老化和自然老化至中等活力干种子(萌发率50%~80%)和吸胀20h 的种子中,前者含量皆高于后者;免疫组化染色结果表明,老化至萌发率80%的种子中的4-HN E 积累量则是自然老化种子明显高于人工老化种子㊂同时,老化诱导4-HN E 的合成,但与4-HN E 清除相关的乙醇脱氢酶(a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e )和谷胱甘肽-S -转移酶(g l u t a t h i o n e -S -t r a n s f e r a s e )基因在人工老化下表达水平显著高于自然老化,即2种老化条件下种子中4-HN E 的清除可能存在差异㊂因此,丙二醛和4-HN E 累积与种子活力呈负相关关系,可作为种子老化程度的生理指标㊂关键词: 大豆;种子老化;脂质过氧化;M D A ;4-HN ED O I 编码: 10.16590/j .c n k i .1001-4705.2019.04.001中图分类号: Q945;S 565.1 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2019)04-0001-09C o r r e l a t i o nS t u d i e s o n MD Aa n d4-HN EC o n t e n t s i nS o y b e a nS e e dA g i n gG A O Q i n m e i 1,2,L UX i n x i o n g 2,Z H UL i n g y a n 2,X I NX i a 2,J I A N GX i a o c h e n g1(1.C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e s ,H u n a nN o r m a lU n i v e r s i t y ,C h a n gs h a 410081,C h i n a ;2.I n s t i t u t e o fC r o p S c i e n c e s ,C h i n e s eA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,B e i j i n g 100081,C h i n a )A b s t r a c t :T oe x p l o r e t h e p h y s i o l o g i c a l i n d i c a t o r s r e f l e c t i n g s o y b e a n s e e d a g i n g ,i n t h i s p a p e r ,s o y b e a nv a r i e t y Z h o n g d o u 27 w a s u s e d a sm a t e r i a l s t om e a s u r e t h e c h a n g e s o f e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y of s e e d s o a k s o l u t i o n ,t h e c o n t e n t o fM D A (m a l o n d i a l d e h y d e )a n d 4-H N E (4-h y d r o x y -(E )-2-n o n e n a l ),t i s s u e s pe c if i c a c c u m u l a t i o n o f 4-H N E ,a n d t h e d i f f e r e n c e s i n t h e e x p r e s s i o n a n d r eg u l a t i o n o f ge n e s r e l a t i v e t o 4-H N Ef o r m a t i o n a n d s c a v -e ng i n g e n z y m e s y s t e mu n d e r n a t u r a l a g i n g a n d a r t i f i c i a l a g i n g .Th e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e ge r m i n a t i o n r a t e of s e e d s o a ks o l u t i o n w a sd e c r e a s e dg r a d u a l l y ,Whi l et h ee l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y a n d M a l o n d i a l d e h yd e (M D A )c o n t e n tw e r e i n c r e a s e d .T h e a c c u m u l a t i o n o f 4-h y d r o x y -(E )-2-n o n e n a l (4-H N E )w a s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y i n l o w -a c t i v i t y d r y s e e d s (g e r m i n a t i o n r a t e 10%)d u r i n g t h e a r t i f i c i a l a n dn a t u r a l a g i n gp r o c e s s .T h e c o n t e n t o f a r t i f i c i a l a n d n a t u r a l a g i n g t om e d i u mv i g o r d r y s e e d s (ge r m i n a t i o n r a t e 50% 80%)a n d i m b i b i t i o n s e e d sf o r 20hw e r e h igh e r t h a n t h a t o f t h e l a t t e r .T h e c o n t e n t o f 4-h y d r o x y -(E )-2-n o n e n a l I m m u n o hi s t o c h e m i c a l s t a i -n i n g s h o w e d t h a t t h e a c c u m u l a t i o no f 4-H N E i n t h e s e e d s a g e d t o80%g e r m i n a t i o nr a t ew e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h a t o f t h e a r t i f i c i a l l y a g e ds e e d s .A t t h e s a m e t i m e ,a g i n g i n d u c e s t h e s yn t h e s i so f 4-H N E ,b u t g e n e s o f a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e a n d g l u t a t h i o n e -St r a n s f e r a s e a s s o c i a t i n g w i t hs c a v e n g i n g 4-H N Ee x p r e s s e d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n t h e a r t i f i c i a l l y a g e d s e e d s t h a n t h a t o f n a t u r a l l y a g e d s e e d s .T h a tm e a n t t h e s c a v e n g i n g of 4-H N E i n s e e d s u n d e r t h e t w o ag i n g c o n d i t i o n sm a y be d if f e r e n t .T h e r e f o r e ,M D Aa n d 4-H N Ea c c u m u l a t i o n w e r e n eg a t i v e l y c o r r e l a t e dw i th s e e d vi g o r .I t c o u l db e u s e d a s p h y s i o l o g i c a l i n d i c a t o r s o f s e e d a g i n g.K e y w o r d s : s o y b e a n ;s e e d a g i n g ;l i p i d p e r o x i d a t i o n ;M D A ;4-H N E ㊃1㊃种子 (S e e d )第38卷第4期 2019年4月V o l .38 N o .4 A pr . 2019表1 用于检测大豆老化种子胚中4-HN E 合成及清除相关的基因转录水平的引物途径酶基因名称基因功能正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')合成15-脂氧合酶L O X 1.1种子亚油酸13S -脂氧合酶-1G G G C C G T A G T G T C T C C C T T CT G C A G A C T C T C C T G C T C C C A氢过氧化物裂解酶L O C 100810890类9二乙烯醚合酶G C G C A G G G T G G G T T A G T G A A C T G A T C C A A C G C C C G G A G A C 烯醛加氧酶L O X 1.2脂氧合酶-2A T G G A T G A C C G A T G A A G A AA A T A A C C T C C G A C T T G C T AL O X 1.3脂氧合酶-3A T T G A G G A T C C A T C G T G C C C G C A G G C T T G G A G T T C A G G A T L O X 1.4种子亚油酸9S -脂氧合酶G G C C A A G G C G T C A G C T T A G TA T C C T G C C T T G C T C C C A A C G 环化酶L O C 100802743类环化酶2G G G C A A A G C A T G G A A G T G A C A T G T G C C A C A G C T C C T T C A A L O C 100799842未标记蛋白G C T G T C C G T T G G A G G T G C T AG T G T C A C T G C C G T G T T T G C C L O C100800915可能的环化酶4A A A G G A A A A T T C T G C A C G C A A A A C T T C G C C A C C C T T G A A C A L O C 100800378可能的环化酶5G C T T C C T C T C A T G C C T C A G A A A A G G A A G C C A A G A T C C C A T T C CL O C 100306686未标记蛋白G C A A G C A T G G A A G T G A C T C T G G T G C T A G C A A G C C A T C C A G C G T A L O C 106794499可能的环化酶4C G A C A G G A A C C A C G A T G G C A G T C A A A G T A C C G G G C G G G T T L O C 100813066环化酶2T T G G C T G G G C T G C C A G T A A G T C A A A G C A A C G C C T C A C A G C 清除醇脱氢酶L O C 100783318醇脱氢酶A G G T A G C T C C A C C A C A G G C A G C A C A T G A T C A C C G G G C T T G L O C 100775490类2环化酶脱氢酶1T C A T C G T C G T G G C T T T G T G A G A A G G G T G A G A G A T G C C A C T L O C 100800668类醇脱氢酶1A C T A C A A A C C A C G C A C C G A T C A T C T C A C T C T T G C A T G C G GL O C 100783858A D H2醇脱氢酶家族蛋白质C G C A C T G A C C T T C C T T C T G TT G C A T C T G A T G G A C T C C C C TL O C 547658醇脱氢酶1T T C A G G G A T T G T G G A G A G C G C A C T C A G C A T A A C A C C C C T G T醛脱氢酶L O C 100803104醛脱氢酶家族3成员H1A C T G A G C C A C A T T A G C G T T G A T A T A T A C T A C A C G A G A G A G A C G CL O C 100811186醛脱氢酶家族7成员A1T T C C C C A T C C C A T G T G T G T CC C A A T G T T G G A G G A G C C C A A L O C 100811501醛脱氢酶家族2成员B 4A T G C G A G C A C T G A G G G T T G GA C C C T T C T C C C T G C C A A T G CL O C 100782019醛脱氢酶家族2成员B 7T G T G C T G A G C A G A G A T G T C AC C C T T T A C C C C A T T G T G A A C G 细胞色素P 450G L Y MA 11G 06381类细胞色素P 45082A3T C A A A T C G T G G T T T G T C G T C T A C C A C G G G T T T T C A C G A T C A G L Y MA 17G 01110类细胞色素P 45071D8A C T G G C A T G A T G C A G A C A G CC C C G G G C A C A T T C T C C T T C CG L Y MA 19G 32880类3,9-二羟基紫檀酸6A 单加氧酶T T C C G A G G G C T A A C C C C A T A T C T C T C T T T C A C T G G G T A T T G A T G A G L Y MA 03G 29950类细胞色素P 45093A1A C T C T G C A T G T C C G A G C T T CT G A C T C A G C G T C A T T C T G G A T G L Y MA 07G 05820细胞色素P 45078A3T G T G A A A T G G C T A A C C C G C T G G C C A T G C A C C T G C T A C T T A谷胱甘肽转移酶G L Y MA 15G 40260类3谷胱甘肽S 转移酶3T G G C A G A C G A G G T T G T T C T A G G G C A A G A T G G G A G C T T T G T G L Y MA 07G 16810可能的谷胱甘肽S 转移酶C C C T T T T G T G C A C G A A G T C C A C A G C A A T A A C T C A A C A A G A C A C A G L Y MA 07G 16830可能的谷胱甘肽S 转移酶T C A A A G C C C G C T A T G A A A G T C TA C T G A A A T G G C C A A A A C G A A A种子的老化或劣变是指随着种子贮藏时间的延长而发生的不可逆的种子活力或萌发力下降的过程㊂大量研究表明,种子老化过程中,细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸在活性氧(R O S )的作用下发生脂质过氧化,其终产物包括一些小分子醛类物质,丙二醛(M D A )和4-羟基壬烯醛(4-H N E )等,会产生细胞毒害作用,影响信号转导和正常生理活动甚至导致细胞凋亡[1]㊂大豆种子含有大约40%的蛋白质和20%的油脂,属短命种子[2],在储藏过程中容易老化或劣变,导致种子质量下降,给农业生产造成巨大损失㊂由于种子自然老化历时长,因此,通常采用人工加速老化法模拟自然老化来预测大豆种质的储藏耐性及探讨有关的生理生化机制[4-9]㊂在前期研究中发现,与未老化种子相比,自然老化的水稻种子中4-H N E 含量显著升高,可作为水稻种子老化早期的预警指标[3],但迄今鲜见对大豆中4-HN E 等小分子醛类的研究报道㊂因此,本试验比较了大豆种子在人工老化和自然老化过程中,脂质过氧化产生的M D A 和4-H N E 等的含量变化㊁4-H N E 积累的组织特异性及其合成和清除相关的基因表达调控的差异,以期为生产实践中监控大豆种子活力提供合适的生理生化指标㊂1 材料和方法1.1 实验材料及处理大豆[G l yc i n em a x (L .)M e r r .]品种中豆27 ,由中国农业科学院作物科学研究所提供㊂大豆种子置于25ħ㊁75%R H 条件下平衡1周,测得种子萌发率为99%,含水量为11.6%㊂人工老化处理:种子用铝箔袋密封包装,于40ħ老化箱中分别人工老化8,12,19d ,种子萌发率分别降至80%㊁50%和7%;自然老化处理:种子用铝箔袋密封包装,于室温条件下分别贮藏60,75,150d,种子萌发率分别降至80%㊁50%和4%㊂1.2 实验方法1.2.1 电导率检测每个处理选取大小一致且无损伤的种子10粒,5次重复㊂用去离子水冲洗3次,滤纸吸干种子表面水分后装于洁净试管中,加入25m L 去离子水,25ħ保温,用电导仪测定种子浸泡液的初始电导率(a 1),然后分别测定种子浸泡6,12,18h 和24h 的浸泡液电导率(a 2),再将装有种子连同浸泡液的试管置于100ħ水浴中15m i n ,取出冷却至25ħ,再次测定种子浸泡液电导率(a 3)㊂㊃2㊃研究报告高琴梅等:大豆种子老化M D A和4-HN E的含量变化相关性研究相对电导率(%)=[(a2-a1)/(a3-a1)]ˑ100㊂1.2.2丙二醛检测采用王爱国等[10]的T B A比色法㊂取0.1g(干重,DW)的大豆胚轴,每个处理3次重复㊂M D A含量(μm o l㊃g-1)=Cˑ(V/W)㊂1.2.34-H N E的提取及检测采用F uS Z[4]的方法㊂1.2.44-H N E免疫组化染色大豆种子吸胀20h,胚轴经脱水,透明,浸蜡,包埋后连续切片获8μm厚的薄片,切片于50ħ烘烤后经二甲苯脱蜡,70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,100%乙醇2次,逐级脱水,复水后加5%B S A封闭20m i n,加入兔抗4-HN E抗体(1ʒ150),室温孵育90m i n,滴加二抗和S A B C-A P,B C I P/N B T显色,脱水透明后封片观察㊂每个处理10次重复㊂用封闭液代替一抗作阴性对照,4-H N E处理过的切片染色结果作阳性对照㊂1.2.54-H N E基因表达分析每个处理剥取吸胀20h种子胚轴30颗,3次重复㊂送北京源宜基因科技股份有限公司进行转录组测序分析㊂A y a l a A等[11]报道的大豆的8类29个4-H N E合成及清除相关酶的基因,利用P r i m e r5 (P r e m i e rB i o s o f t,P a l oA l t o,C A,U S A)设计R T-P C R 引物(表1),由北京三博远志公司进行引物合成㊂用北京天根公司的R N A提取试剂盒和反转录试剂盒进行总R N A提取和c D N A反转录;用A B I7500f a s t R e a l T i m eP C R(A p p l i e dB i o s y s t e m s,U S A)和T i a n-g e nS u p e r R e a l P r e M i xP l u s(S Y B RG r e e n)进行q R T-P C R,以大豆a c t11.1基因为内参基因㊂P C R产物送北京源宜基因科技股份有限公司测序㊂1.2.6数据分析每个处理3次重复的平均值,用P A S W s t a t i s t i c s 18软件和O n e-w a y A N O V A软件进行数据分析㊂处理间p<0.05时视为具有显著性差异㊂免疫组化染色利用I m a g eP r oP l u s软件(版本6.0)进行半定量统计分析㊂用G r a p h p a d5软件作图㊂2结果与分析2.1种子老化过程中种子浸泡液的电导率变化种子浸泡液电导率可以表示细胞膜的完整性㊂图1结果表明,未老化大豆种子浸泡0~24h期间相对电导率保持在20%以下;老化后种子相对电导率则随老化程度而增大,说明老化处理导致细胞膜完整性下降;相同萌发率的自然老化种子浸泡24h,其相对电导率高于人工老化种子17%~23%,表明自然老化细胞膜完整性受损更严重㊂2.2种子老化过程中M D A含量的变化相比未老化种子,人工老化至萌发率为80%㊁50%和7%的种子的M D A含量分别增加了3.2%㊁20.6%和22.4%(图2a);而自然老化至萌发率为80%㊁50%和4%的种子M D A的含量分别增加了5.4%㊁18.5%和12.2%(图2c),表明人工老化和自然老化均引起M D A含量的增加㊂相关性分析结果显示,M D A含量与萌发率呈负相关关系,说明膜脂氧化越严重,种子活力越低㊂未老化种子以及人工老化和自然老化至萌发率为80%和50%的种子吸胀后, M D A含量均比未吸胀种子明显下降(图2b),说明萌发率在50%以上的种子吸胀时可部分抑制或修复脂质过氧化作用㊂但人工老化至萌发率为7%的种子吸胀后,M D A含量比未吸胀种子高,自然老化至4%的种子吸胀后的M D A含量与未吸胀种子相近(图2c㊁d),说明老化程度严重的种子吸胀时可能已失去修复能力㊂注:A A为人工老化;N A为自然老化;80%㊁50%㊁7%和4%为萌发率㊂图1大豆种子浸泡液的电导率变化2.3种子老化过程中4-H N E的含量变化相比未老化种子,人工老化至萌发率为80%㊁50%和7%的种子的4-H N E含量分别增加了19.2%㊁16.5%和88.0%(图3a),表明人工老化加剧了脂质过氧化㊂自然老化至萌发率为80%和50%的种子中, 4-H N E含量分别下降了49.6%和32.8%,而自然老化至萌发率为4%的种子的4-H N E含量上升了33.6% (图3c)㊂表明不同老化条件下种子的4-H N E的合成与代谢可能存在差别㊂对比不同老化处理至相同萌发率的种子,发现人工老化条件下4-H N E积累量更高,说明人工老化脂质过氧化程度更严重㊂老化至不同萌发率的种子吸胀后的4-H N E含量变化规律与未吸胀时不同,且自然老化和人工老化的变化模式也有差异(图3),表明4-H N E在自然老化和人工老化处理的种子中,其合成与代谢可能存在差异,㊃3㊃种子 (S e e d )第38卷第4期 2019年4月V o l .38 N o .4 A pr . 2019 注:A A 为人工老化;N A 为自然老化,0h 和20h 表示吸胀0h 和20h ㊂图中不同小写字母表示各处理间差异显著(p <0.05)㊂下同㊂图2 老化对大豆种子M D A含量的影响图3 老化对大豆种子4-HN E 含量的影响这种差异可能与4-H N E 的挥发性和不稳定性[12]有关,或者是自然老化和人工老化条件下细胞膜完整性变化不一致,也可能是检测4-H N E 时的人为误差导致,原因需要进一步分析㊂2.4 4-HN E 免疫组化染色结果以吸胀20h 的胚轴为材料,采用免疫组化染色的方法,检测老化过程中4-H N E 积累的组织表达情况㊂结果发现,随着种子活力下降,切片的染色强度加深且面积扩大(图4)㊂相比未老化种子,人工老化至萌发㊃4㊃研究报告高琴梅等:大豆种子老化M D A 和4-HN E的含量变化相关性研究图4 人工老化和自然老化的大豆种子胚4-HN E 免疫组化染色结果率为80%㊁50%和7%种子切片染色强度分别增加了50.1%㊁122.7%和212.1%;但自然老化至萌发率为80%种子的切片染色强度明显高于50%萌发率的种子(图4),也显著高于萌发率为80%的人工老化种子㊂该结果与图3的4-H N E 在不同处理之间的含量差异存在明显的非相关性,其原因有待进一步分析㊂2.5 种子老化过程中4-H N E 代谢相关基因表达分析参与4-H N E 合成的代谢途径有4类酶12个基因,参与其清除的代谢途径有4类酶17个基因㊂转录组测序发现,与未老化的种子相比,随着老化时间的延长,差异表达的基因数量逐渐增加(表2)㊂对4-H N E代谢途径相关基因的分析发现,相同基因在不同老化方式老化至相同萌发率水平的种子中表达模式不同(表3),说明不同老化方式处理的种子中4-H N E 的代谢可能存在差异㊂为了验证转录组结果,结合N C B I 数据库设计引物,检测了4-H N E 的合成和代谢相关的29个基因的表达量㊂结果发现,老化诱导了4-H N E 的合成,同时启动清除机制的加强,说明老化影响了4-H N E 合成和清除的酶系统㊂表2 大豆种子中4-HN E 合成和清除相关的差异表达基因转录本的比较G r o u p 1_V S _G r o u p 2基因数/个差异基因数/个上调数/个下调节数/个C K _V S _A A8059000C K _V S _A A5055312C K _V S_A A764251312C K _V S _N A8054523C K _V S _N A5053943C K _V S _N A45918108 注:C K 为未老化的种子;A A 为人工老化;N A 为自然老化;萌发率分别为80%㊁50%㊁7%㊁4%㊂对比2种老化方式种子发现,4-H N E 合成途径中萌发率为80%和50%的种子表达显著上升的基因,在人工老化中分别有5个和7个,在自然老化中分别有4个和7个㊂L O C 100800915和L O C 106794499基因在人工老化至种子萌发率为7%时,在自然老化老化至种子萌发率为80%时表达量显著上升;L O X 1.2,L O X 1.3和L O C 100813066基因在人工老化至种子萌发率7%时,㊃5㊃种子(S e e d)第38卷第4期2019年4月V o l.38N o.4 A p r.2019㊃6㊃研究报告高琴梅等:大豆种子老化M D A和4-HN E的含量变化相关性研究㊃7㊃种子 (S e e d )第38卷第4期 2019年4月V o l .38 N o .4 A pr . 2019表3 与4-HN E 合成和清除代谢相关的调控基因途径酶基因I D 基因名称基因功能变化模式人工老化自然老化合成15-脂氧合酶g l ym a 13g 347600L O X1.1种子亚油酸13S -脂氧合酶-1ˌʏ氢过氧化物裂解酶g l ym a 11g 122700L O C 100810890类9二乙烯醚合酶ˌʏ烯醛加氧酶g l ym a 15g 026300L O X1.3脂氧合酶-3ʏˌʏˌ环化酶g l ym a 09g 124200L O C 100800915可能的环化酶4ˌˌg l ym a 09g 124700L O C 106794499可能的环化酶4ʏˌˌg l ym a 19g 247500L O C 100813066脂氧合酶-2ʏˌ清除醇脱氢酶g l ym a 14g 121200L O C 100800668类醇脱氢酶1ʏˌˌg l ym a 04g 240800L O C 100783858A D H2醇脱氢酶家族蛋白质ˌʏ醛脱氢酶g l ym a 15g 178400L O C 100811186家族7成员A1ˌʏ细胞色素P 450g l ym a 17g 007200G L Y MA17G 01110类细胞色素P 45071D8ʏˌʏˌg l ym a 19g 146800G L Y MA19G 32880类3,9-二羟基紫檀酸6A 单加氧酶ʏʏˌg l ym a 03g 143700G L Y MA03G 29950类细胞色素P 45093A1ˌ g l ym a 07g 052300G L Y MA07G 05820细胞色素P 45078A3ˌʏ谷胱甘肽转移酶g l ym a 07g 139700G L Y MA07G 16810可能的谷胱甘肽S 转移酶ʏˌˌg l ym a 07g 139800G L Y MA07G 16830可能的谷胱甘肽S 转移酶ʏ 注: ʏ ,上调; ˌ ,下调;ʏˌ,上调和下调; ,没有差异㊂自然老化至种子萌发率50%表达量显著上升(图5A 和图6A )㊂4-H N E 清除代谢途径中L O C 100800668㊁L O C 100783858㊁L O C 100811186㊁L O C 100782019㊁G L Y -M A 11G 06381㊁G L Y M A 17G 01110㊁G L Y M A 19G 32880㊁G L Y M A 15G 40260和G L Y M A 07G 16830等9个基因在人工老化种子至萌发率80%时表达显著上升,L O C 100783318㊁L O C 100800668㊁L O C 100811501㊁L O C 10072019㊁G L Y M A 19G 32880㊁G L Y M A 03G 29950和G L Y M A 07G 16830等7个基因在自然老化种子至萌发率80%时表达显著上升,其中L O C 100800668㊁L O C 100782019㊁G L Y M A 19G 32880和G L Y M A 07G 16830等4个基因在人工老化和自然老化种子中表达模式相近,人工老化比自然老化表达量大约2倍有3个,人工老化比自然老化表达量大约3倍有4个;人工老化种子中有16个基因在萌发率为50%时表达显著上升,自然老化只有14个,其中人工老化比自然老化表达量大约2倍有3个,说明自然老化萌发率为80%和50%种子4-H N E 清除能力比人工老化弱㊂清除相关酶的差异更明显,萌发率为80%和50%时,a l c o h o l -d e h y-d r o ge n a s e 和g l u t a t h i o n e s -t r a n sf e r a s e 在人工老化种子表达大于自然老化,尤其是g l u t a thi o n e s -t r a n s f e r a s e 在人工老化种子表达是自然老化约2倍㊂c y t o c h r o m e P 450在人工老化萌发率80%种子表达是自然老化约2倍㊂a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e 在自然老化中略高(图5B 和图6B )㊂说明老化方式影响了4-HN E 合成和清除的酶系统(见图5和图6)㊂3 讨论3.1 老化处理加剧了大豆脂质过氧化和基因表达差异大豆是高蛋白㊁高油分种子,膜脂中高含量脂肪酸很容易发生过氧化作用产生活跃的自由基而造成膜的损伤,使细胞正常生理活动受到抑制[13-14]㊂本研究的结果表明,随着种子老化,其浸泡液相对电导率逐渐增加(图1),表明老化破坏了大豆胚轴细胞膜结构,这与董发才[15]的结果一致㊂M D A 是衡量种子老化过程中脂质过氧化程度的一个重要指标[16],4-H N E 则是生物活性最高的脂质过氧化产物[3]㊂研究表明,老化导致M D A 和4-H N E 的含量上升,但M D A 含量变化不如4-HN E 显著,说明可能4-H N E 与种子老化和脂质过氧化损伤关系更为密切[4]㊂转录组表明,随着老化时间的延长,4-H N E 代谢相关基因表达差异越大㊂L O X 1.4,L O C 100306686基因在人工老化和自然老化种子中的表达均随种子活力下降而下降,说明老化后这2个基因的表达可能被抑制;另一方面,种子老化后4-HN E 合成和清除大多数基因均随萌发率降低而表达量上升,老化影响了4-H N E 合成和清除的酶系统㊂3.2 人工老化和自然老化对大豆种子中M D A 和4-HN E 含量的影响存在差异研究表明,人工老化与自然条件下老化的机制是一致的,只是劣变的速度大大提高了[14,17-24]㊂本研究结果发现,浸泡24h 的自然老化种子比相同萌发率的㊃8㊃研究报告高琴梅等:大豆种子老化M D A和4-HN E的含量变化相关性研究人工老化种子的相对电导率高,表明自然老化细胞膜完整性受损更严重,与李稳香等[25]的研究结果不同㊂相同萌发率的人工老化种子和自然老化种子中M D A 含量没明显差异;但4-H N E含量在萌发率为50%和80%的人工老化种子高于自然老化种子,说明人工老化与自然老化种子中4-H N E的形成和清除机制可能存在差异㊂4结论大豆-种子老化过程中发生脂质过氧化,导致M D A和4-H N E等小分子醛类物质积累,膜完整性破坏,相对电导率上升,这些皆可作为大豆种子老化的指标㊂人工老化引起的脂质过氧化损伤程度大于自然老化,自然老化种子的吸胀修复能力小于人工老化种子㊂老化和不同老化方式都对4-H N E合成和清除酶系统产生影响,导致4-H N E在老化至不同萌发率水平和不同老化处理至同一萌发率水平的种子中积累存在差异㊂参考文献:[1]M c D o n a l dM B.S e e d d e t e r i o r a t i o n:p h y s i o l o g y,r e p a i r a n d a s-s e s s m e n t[J].S e e dS c iT e c h n o l,1999,27(1):177-237. 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三种人工老化方法对大豆种子活力和生理生化的影响的开题报告

三种人工老化方法对大豆种子活力和生理生化的影响的开
题报告
一、研究背景
大豆是我国重要的粮食作物之一，其种子的质量直接影响种子发芽和作物产量。

人工老化方法是一种模拟种子储藏过程，加速种子老化的方法，这种方法可以用于评价种子质量和寿命，并研究种子老化机理。

目前，人工老化方法主要包括干燥法、高温处理法和化学老化法等，对于大豆种子的影响还需要进行深入探究。

二、研究目的
本研究旨在探究不同人工老化方法对大豆种子生理生化和活力的影响，为种子管理和育种提供参考。

三、研究内容
1. 选取品种：选择适合人工老化的大豆品种。

2. 人工老化处理：选择三种人工老化方法（干燥法、高温处理法和化学老化法）进行处理。

3. 取样分析：在不同老化时间点分别取样分析种子形态特征、发芽率、活力指标、代谢物含量等生理生化参数，并比较分析不同处理之间的差异。

四、预期结果
通过本研究，可以得到以下预期结果：
1.不同人工老化方法会对大豆种子的生理生化和活力产生不同程度的影响。

2. 可以确定适合于大豆种子人工老化方法和老化时期，以便在种子贮藏和育种工作中使用。

3.为了提高大豆种子质量和产量，可以根据人工老化的结果为种子管理和育种提供指导。

五、研究意义
本研究可以为大豆种子质量评价和寿命研究提供一定的理论依据，并为种子管理和育种提供相应的措施。

同时，本研究对于推进粮食作物的生产安全提供积极的帮助。

超干处理对大豆种子抗老化能力及抗氧化代谢的影响

超干处理对大豆种子抗老化能力及抗氧化代谢的影响赵鹂;陆开形;朱诚【期刊名称】《大豆科学》【年(卷),期】2009(28)3【摘要】通过控制超干处理时间获得不同含水量的大豆种子(8.1%、4.0%和2.4%),对这些不同超干种子进行老化及回水处理,同时测定其抗老化能力及抗氧化酶等生理指标。

结果发现:超干处理能提高大豆种子的抗老化能力,延长种子的贮藏寿命。

超干种子(MC4.0%和2.4%)内氧自由基水平高于未超干种子(MC8.1%),但与老化前相比,未超干老化种子内氧自由基和丙二醛含量(MDA)的增加幅度均明显大于超干老化的种子,经超干老化种子的氧自由基清除能力要高于未超干老化的种子。

超干种子的较强的抗老化能力还与其相对较高的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)系统有关,发现老化导致超干种子的种胚和子叶中SOD、POD和CAT活性的下降要小于未超干种子的下降幅度。

结果认为抗膜脂过氧化能力的保持是超干种子耐贮藏性的生理原因之一。

【总页数】6页(P450-455)【关键词】大豆;种子超干;人工老化;抗氧化代谢【作者】赵鹂;陆开形;朱诚【作者单位】丽水学院;浙江大学生命科学学院;宁波大学生命科学与生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】S565.1;S330.31【相关文献】1.种子超干对大豆种子活力的影响初探 [J], 刘刚;刘亚琼;郝爱花;宋强;李沙弥;于月华;张佩玲;王芳2.超干绿豆种子耐贮藏性与抗氧化代谢的变化 [J], 陆开形;任晓米;朱诚3.NaCl 胁迫对菜用大豆种子膨大、抗氧化酶活性和活性氧代谢的影响 [J], 王聪;朱月林;杨立飞;刘正鲁;陈磊4.超干处理对沙芥属蔬菜种子活力及抗氧化代谢的影响 [J], 赵鹏;张轶婷;郝丽珍;庞杰;杨忠仁;张凤兰5.氮素不同形态配比对菜用大豆生长、种子抗氧化酶活性及活性氧代谢的影响 [J], 陈磊;朱月林;杨立飞;王聪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人工加速老化对大豆种子活力的影响

中图分类号：￥３．３０３
ＳｕｙｏｅｄＶｉｏｆｔｅＡｒｉｉｉｌＡｇｄＳｅｓｉｏｂａｔｄｎＳｅｇｒｏｈｔｆｃａｅｅｄｎＳｙｅｎ
ＸＩａＣＨＥＮｅｚｅＱＩＪａｙｅＬＩＫｕＹＡＮＧｕＷＡＮＧｉｎｌＮＡＮｈｎ－ｉＥＨｏ，Ｘｕ —ｈｎ，ｉ— ｕ，Ｕｎ，Ｌｉ，Ｊａ－ｉ，ＺａｇＪｅ
（．ｐｒｍｅｔｆＰｌｎｃｅｃｎｃｎｌｇ，ｅｊｇＡｇｉｕｔｒｌｌｇ，Ｂｉｎ０２，ｉａ；１ＤｅａｔｎａｔＳｉｎｅａｄＴｅｈｏｏｙＢｉｎｒｌｕａｌｅｅｊｇ１２０６ＣｈｎｏｉｃＣｏｅｉ
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第２１卷
第３期
北
京
Ｖｏ．２。ＮＯＩ１．３
２００６年７月
Ｊ０ＵＲＮＡＬＯＦＢＥＩＩＪＮＧＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＣｏＬＬＥＧＥ
Ｊ１ｕ．，２００６
人工加速老化对大豆种子活力的影响
的影响。结果表明：加速老化法测定大豆活力时，适宜的老化时间为７～９。加速老化法与发芽速率测定法２６ｈ
或电导率法结合使用效果更好。关键词：大豆；种子活力；加速老化测定；电导率测定文献标识码：Ａ文章编号：１０ — １６２０）３０１ — ３０２３８（０６０ —０５０

渗控强化种子活力过程中抗坏血酸代谢的变化的开题报告

渗控强化种子活力过程中抗坏血酸代谢的变化的开题报告【摘要】渗控强化种子活力是种子技术中的一种新方法，可以通过增强种子内部抗氧化系统，提高其抗逆性能和生长速度。

然而，目前对于这种方法下种子内部代谢变化的研究尚不清楚。

本研究通过测定渗控强化的黄豆种子抗坏血酸代谢酶活性、抗氧化酶活性、膜脂过氧化物含量和可溶性糖含量，探讨了其抗坏血酸代谢的变化规律。

结果发现，渗控强化的黄豆种子的抗坏血酸含量和抗氧化酶活性均有所增加，同时膜脂过氧化物含量和可溶性糖含量也有所变化，提示渗控强化可以改变种子抗坏血酸代谢过程中的相关酶活性和代谢产物的含量，从而提高种子的生长速度和逆境适应能力。

【关键词】渗控强化；种子活力；抗坏血酸；代谢变化【引言】种子是植物繁殖的基础，其生长发育和产量质量的影响巨大。

而种子活力则是种子发芽和生长的关键指标，也是影响农作物产量和品质的重要因素。

为了提高种子的生长速度和逆境适应能力，近年来发展出了一种新的种子技术--渗控强化，这种技术通过改变种子中的水分和渗透压等物理和生化参数，增强种子内部抗氧化系统和代谢活性，从而提高种子活力。

但是，目前对于这种方法下种子内部代谢变化的研究尚不清楚。

因此，本研究旨在研究渗控强化黄豆种子活力过程中抗坏血酸代谢的变化规律，为渗控强化技术的进一步优化提供科学依据。

【材料与方法】1. 实验材料黄豆种子2. 实验设计将黄豆种子分为两组，其中一组按照传统的播种方式进行处理，另一组进行渗控强化。

分别在处理前和处理后检测种子抗坏血酸酶和相关代谢产物的含量，分析种子的抗氧化酶活性、膜脂过氧化物含量和可溶性糖含量等指标的变化。

3. 抗坏血酸代谢的测定采用高效液相色谱法测定种子中抗坏血酸含量及抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性。

同时还检测种子中ASC（抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸）和DHA（脱氢抗坏血酸）的含量。

4. 抗氧化酶活性测定通过测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性来评估种子抗氧化能力。

PEG引发对老化大豆种子发芽及活力的影响

山西农业科学2011，39（7）：650-654Journal of Shanxi Agricultural SciencesPEG 引发对老化大豆种子发芽及活力的影响王炜1，史雨刚2，王曙光2（1.山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）摘要：选取晋豆19号、晋大53号和晋大74号3个大豆品种种子为试材，在高温（（45±1）℃）、高湿（100%相对湿度）、密闭条件下，对大豆种子进行老化处理；再对老化种子用10%，20%和30%PEG 进行引发处理；然后对各处理种子的发芽指标、种子活力的变化进行了研究。

结果表明，随着老化处理时间的延长，3个大豆品种种子测试的4项发芽指标都呈现出逐渐降低的趋势；种子活力先下降而后又逐渐上升。

不同浓度PEG 引发3个品种种子后，提高了种子活力，增强了种子抗性；但10%PEG 引发效果不是很好；而用20%，30%PEG 引发后，当老化程度不是很严重时，可显著提高大豆种子的多项发芽及活力指标，有效提高大豆种子的抗老化能力；同时20%PEG 对晋大53号种子的引发效应较好，而30%PEG 可能更有利于对晋豆19号和晋大74号种子的引发。

关键词：大豆；种子；老化；活力；发芽指标；PEG 引发中图分类号：S565.1文献标识码：A文章编号：1002-2481（2011）07-0650-05Effect of PEG Priming on Germination and Seed Vigor of Aging SoybeanWANG Wei 1，SHI Yu-gang 2，WANG Shu-guang 2（1.Institute of Cotton ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Yuncheng 044000，China ；2.College of Agronomy ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：Variation with seed germination index and seed vigor of three soybean varieties Jindou 19,Jinda 53and Jinda 74were studied through the approach of artificial acceleration of aging under the air tight condition of high temperature（（45±1）℃）and high humidity （100%relative humidity ）,then the aging seed were treated in 10%，20%and 30%PEG.The results showed that germination index of the three soybean varieties gradually decreased with extension of aging treatment time,the seed vigor of the three varieties showed a variation trend of decreasing firstly,then increased with the prolonged aging process.After priming treatments with different concentrations PEG,the seed vigor of the three soybean varieties were raised and seed resistance were en-hanced.But it was found that the priming effect was not so good with the 10%PEG;and the abilities to aging resistance of the three soybeans were enhanced with 20%and 30%PEG when the degree of aging wasn't severe.At the mean time,it was noticed that the priming effect of the seed of Jinda 53did very well with 30%PEG,while the priming effect benefited from the seed of Jindou19and Jinda 74with 20%PEG.Key words ：soybean;seed;aging ；vigor;germination index;PEG priming收稿日期：2011-03-29基金项目：山西省科技攻关项目（20100311001-6）作者简介：王炜（1982-），男，山西运城人，研究实习员，硕士，主要从事油料育种研究工作。

大豆幼苗中抗坏血酸和谷胱甘肽对干旱胁迫的生理响应

大豆幼苗中抗坏血酸和谷胱甘肽对干旱胁迫的生理响应作者：王华华等来源：《江苏农业科学》2014年第05期摘要：以抗旱的大豆品种豫豆24、对照品种周豆11为试验材料，以聚乙二醇（PEG）模拟干旱胁迫条件，探讨了不同干旱胁迫下抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量的动态变化及其在清除活性氧过程中的作用。

结果表明，干旱胁迫增加了2个大豆品种中AsA 和GSH含量，两者均在10% PEG处理48 h时达到最大值，抗旱品种豫豆24比对照品种周豆11增加幅度大，表明AsA和GSH可能参与了大豆的抗旱响应；干旱胁迫显著增加了2个大豆品种中过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子 O-2·含量，抗旱品种豫豆24的增幅低于对照品种周豆11；AsA和GSH抑制剂处理进一步增加了干旱胁迫下大豆根中活性氧和丙二醛含量。

表明干旱胁迫下AsA和GSH在清除活性氧从而增强大豆抗旱性中起着重要的作用。

关键词：大豆；干旱胁迫；活性氧；抗坏血酸；还原型谷胱甘肽；抗旱性中图分类号： S565.101；Q945.78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）05-0086-03干旱是限制作物产量和质量的主要逆境因子。

研究表明，全世界由于干旱造成的作物减产超过了其他逆境因子危害的总和[1]。

干旱胁迫能干扰植物细胞中活性氧（ROS）产生与清除之间的平衡，导致植物细胞遭受氧化胁迫。

在正常条件下，植物细胞中产生的ROS与其清除系统保持平衡，而当植物遭受环境胁迫使体内产生的ROS超出其清除系统的能力范围时，就会引起ROS累积产生氧化伤害，导致生物膜脂过氧化、蛋白质变性、DNA链断裂及光合受阻等多种有害的细胞学效应，使细胞功能失常，机体出现各种自由基综合征[2]。

增强抗氧化系统能力是植物适应干旱逆境的重要生理机制。

植物体内除了酶促抗氧化机制外，还存在非酶促抗氧化机制。

抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）是植物体内高丰度的小分子抗氧化物质，是抗氧化系统的重要组成部分，在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用[3]。

人工老化对大豆种子活力和生理生化特性的影响

ＷＵＪｕ一１ＺＯｉｍｅ，Ａｉｇｊａａ，ＨＵＸａｎｏ— ｌＦＮＬｎ — ｕｎ，
ＬｕＩＪｎ—ｉｎ，ＨＡｉＺＮＧｉａＸｎ—ｘｎ，ＨＡｉＺＮＧｉｈｎＨａ —ｓｅｇ
（．ｒｓＲｓａｃｎｔｕｅＳａｘＡａｅｙｏｇｉｌｒｌｃｎｅ，Ｔｉａ３０１ｈｎ１ＣｏｅｒＩｓｔ，ｈｎｉｃｄｍｐｅｈｉｔｆＡｒｕｕａｉｃｓａｕｎ００３，ＣｉｃｔＳｅｙａ；
ｔｎａｄａｔｘｄｎｎｙｒｓｅｎｅ０（ａｄ１０ｉｎｎｉｉａｔｚｍｅｗｅｅｔｔｄｕｄｒ￣ｎ０％ｒｌｔｅｈｍｉｉｒｆｉｌａｉｇｃｎｉｏｓｈｅｏｏｅｅ４２ｅａｉｕｄｔａｔｃａｇｎｏｄｔｎ．Ｔｅｒ — ｖｙｉｉｉ
ｓｇｒＭＤＣ／ｎａｄｔａｓｐｒｘｄｉｔｅ（Ｏｕａ，Ａ，ｕＺｎｔｕｅｏｉｅｄｓａＳＤ）ｌｖｌｉｃｅｓｄｗｔａｉｇｈｒｇｌｅｄｅｅｏｌｍｕｓｅｅｓｎｒａｅｉｇ．Ｔｅｉｅｕｔｎｓｒｈｎｒａｒｒｗ
ａｉｇｔｈｎｓｅｓｗｒｘｏｅｏｔｅａｉｇｔｅｔｎｓＯｈｔｅａｄ，ｅｅｔｃｌｃｎｕｔｉ，ｓｌｂｅｇｎｍｅｗｅｅｄｅｅｅｐｓｄｔｈｇｎｒａｍｅｔ．ｎｔｅｏｈｒｈｎｉｌｃｒａｏｄｃｉｔｉｖｙｏｕｌ

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植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (4): 543–550 doi: 10.13592/ki.ppj.2015.0689543收稿 2015-12-22 修定 2016-02-28资助山东省现代农业产业技术体系杂粮产业创新团队建设项目(SDARS-15-01)、公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303007)、“十二五”国家科技支撑计划课题(2013BAD01B0106)和山东省农业科学院青年科研基金(2016YQN19)。

*通讯作者(E-mail: dinghf2005@)。

老化处理对大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响田茜, 王栋, 张文兰, 段乃彬, 李群, 颜廷进, 戴双, 丁汉凤*山东省农作物种质资源中心, 济南250100摘要: 以大豆‘中黄13’为材料, 研究人工老化后大豆种子活力及线粒体抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)循环的变化。

结果表明, 随老化时间的延长, 大豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著下降; 老化种子的相对电导率和丙二醛(MDA)含量随着老化时间的延长逐渐增大, 超氧阴离子(O 2·−)产生速率和过氧化氢(H 2O 2)含量呈现先升高后降低的趋势; 与对照相比, 老化种子中线粒体细胞色素c 氧化酶(COX)和苹果酸脱氢酶(MDH)活性显著下降, 呼吸速率和呼吸控制率(RCR)显著降低; 老化种子中线粒体超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性以及总ASC 和GSH 含量显著降低, 说明老化导致活性氧(ROS)代谢异常, 线粒体呼吸功能及ASC-GSH 循环紊乱。

ROS 的过量积累可能是导致种子活力丧失的主要原因。

关键词: 大豆; 人工老化; 线粒体; 活性氧; 抗坏血酸-谷胱甘肽循环低温、低含水量是抑制种子老化的常用方法, 低温库是保存种质资源的理想场所(Lu 等2005)。

然而, 许多研究表明, 即使在低温种质库中保存, 种子仍然会缓慢衰老, 遭受一系列生化裂变, 包括膜透性增加、酶活性降低、贮藏物质减少等(Mc-Donald 1999; Walters 等2005; Bellani 等2012)。

种子老化不仅影响种子萌发, 也会降低种子的质量和品质, 对农业生产造成巨大的经济损失。

在研究种子老化机制时, 通常采用人工老化模拟种子老化, 判断种子活力(Goel 等2003)。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累是导致种子老化的主要原因之一(Møller 2001), 细胞中ROS 的过量积累能够导致脂质过氧化、抗氧化酶活性降低、蛋白质和RNA 的合成受阻以及DNA 的降解(McDonald 1999; Chen 等2013), 最终导致种子活力的丧失, 这已在大豆(Sung1996)、棉花 (Goel 等2003)、向日葵(Kibinza 等2006)、豌豆(Yao 等2012)和燕麦(Xia 等2015)等种子的老化研究中证实。

线粒体是种子萌发过程中产生和清除ROS 的主要细胞器(Møller 2001; Navrot 等2007), 同时线粒体又是进行氧化磷酸化和产生ATP 的主要场所, 为细胞的生物合成提供能量和中间物质(Macherel 等2007; Taylor 等2010; Carrie 等2013)。

线粒体不仅是内源ROS 的主要来源, 也是ROS 攻击的首要目标, 过量的ROS 能够导致线粒体蛋白质、脂类和核酸的氧化损伤(Bartoli 等2004)。

同时, 线粒体中也存在着多条抗氧化途径, 包括酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统, 线粒体抗氧化系统对于线粒体ROS 的清除和减少线粒体氧化损伤具有重要作用(Navrot 等2007)。

Jimenez 等(1997)最早证明了豌豆叶片的线粒体中存在完整的抗坏血酸-谷胱甘肽(ASC-GSH)循环, 并且ASC-GSH 循环在ROS 的清除中发挥重要作用。

从此线粒体ASC-GSH 循环成为植物逆境研究的难点和热点。

目前, 有关线粒体ASC-GSH 循环的研究已在豌豆(Jiménez 等1997)、番茄(Mittova 等2004)、黄瓜(Song 等2009)、玉米(Wu 等2009)、马铃薯(王芳等2014)、大豆(Xin 等2014)和花生(Zhan 等2014)等植物中普遍开展。

然而, 人工老化对种子线粒体ASC-GSH 循环影响的报道还不多。

本文以大豆品种‘中黄13’为实验材料, 通过研究人工老化对种子活力、细胞ROS 积累、脂质过氧化、线粒体呼吸速率、抗氧化酶活性以及抗氧化剂含量的影响, 探讨线粒体在种子老化和ROS 代谢中的作用机理, 为从亚细胞水平揭示种子的衰老机理提供参考。

材料与方法1 材料与处理实验材料为大豆[Glycine max (L.) Merr.]品种‘中黄13’, 种子初始发芽率为98%, 初始含水量为植物生理学报54412.5%。

将大豆种子密封于铝箔袋中, 置于40°C 人工老化箱中分别老化0、14、21和42 d, 然后将种子置于−20°C 冰箱内保存。

2 发芽指标的测定种子发芽试验参照国际种子检验协会(1996)进行, 随机选取100粒种子置于发芽床, 4次重复, 在25°C 恒温培养箱中培养7 d, 逐日检查发芽种子数。

各指标按以下公式计算:发芽势(%)=第3天发芽数/种子总数×100% (1)发芽率(%)=第7天发芽数/种子总数×100% (2)发芽指数(GI)=∑(G t /D t ) (3)活力指数(VI)=GI×DW (4)式中, G t 为第t 天发芽数, D t 为相应发芽天数, DW 为幼苗干重。

3 电导率、丙二醛(MDA)及ROS 含量测定选取10粒完整的种子用去离子水冲洗3次, 用滤纸吸干种子表面水分, 加入25 mL 去离子水, 25°C 保温24 h 。

用Mettler-Toledo Delta 326电导率仪测定浸出液电导率(a 1), 然后将种子及其浸出液置于100°C 水浴中煮沸15 min, 取出冷却至25°C, 测定煮沸后种子浸出液的电导率(a 2)。

计算出浸出液的相对电导率。

相对电导率(%)=a 1/a 2×100% (5)吸胀24 h 大豆胚轴中MDA 含量的测定参照王爱国等(1986)的方法, 即硫代巴比妥酸(TBA)比色法; 吸胀24 h 大豆胚轴中超氧阴离子(O 2·−)产生速率的测定参照王爱国等(1990)的方法; 过氧化氢(H 2O 2)含量的测定参照林植芳等(1988)的方法。

4 线粒体提取及生理生化指标测定4.1 线粒体提取参照Yin 等(2009)的方法进行大豆胚轴线粒体的提取。

取150粒吸胀24 h 的大豆胚轴加入30 mL 预冷的研磨液[50 mmol·L -1磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、0.3 mol·L -1蔗糖、0.5% (m /V )牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、0.5% (m /V )聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone-40, PVP-40)、2.0 mmol·L -1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)和20 mmol·L -1半胱氨酸]。

匀浆液经4层纱布过滤后于2 000×g 离心15 min, 所得上清于12 000×g 离心15 min, 沉淀用30 mL 洗涤介质[0.3 mol·L -1蔗糖、1.0 mmol·L -1 EDTA 和50 mmol·L -1KOH, pH 7.2]悬浮, 经12 000×g 离心15 min, 收集沉淀再用上述介质洗涤1次, 沉淀即为粗制线粒体, 并悬浮于少量洗涤介质中。

然后将粗制线粒体悬浮液铺在不连续Percoll 梯度上, Percoll 溶液浓度自下而上为21% (m /V )和40% (m /V ), Percoll 溶液由上述洗涤介质配制, 二者比例为1:1, 40 000×g 离心1 h 。

收集21%和40% Percoll 界面间的线粒体, 用洗涤介质[0.3 mol·L -1蔗糖、0.5% (m /V ) BSA 和10 mmol·L -1三乙氧基硅烷(triethoxysilane, TES; pH 7.5)]洗涤3次(最后一次不含BSA), 18 000×g 离心15 min, 沉淀即为纯化的线粒体, 悬浮于少量洗涤介质中(不含BSA)。

所有的操作步骤都在0~4°C 下进行。

4.2 线粒体呼吸活性的测定用氧电极(Chlorolab 2, Hansateach, UK)在25°C 下测定线粒体耗氧量(Yin 等2009)。

取约100 μg 线粒体蛋白加入总体积为1 mL 的反应介质[0.3 mol·L -1蔗糖、10 mmol·L -1 TES –KOH (pH 7.5)、5 mmol·L -1 KH 2PO 4、10 mmol·L -1 NaCl 、2 mmol·L -1 MgSO 4以及0.1% (m /V ) BSA]中。

以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-ade-nine dinucleotide, NADH)、琥珀酸和ADP 为呼吸底物和辅助因子, 终浓度为10 mmol·L -1琥珀酸、1 mmol·L -1 NADH 和0.8 mmol·L -1 ADP 。

呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR)为加入ADP 后的呼吸(即III 态呼吸)速率与ADP 耗尽后的呼吸(即IV 态呼吸)速率之比。

线粒体中细胞色素c 氧化酶(cytochrome c oxi-dase, COX)活性测定参考Neuburger 等(1985)的方法, 通过测定由于还原性细胞色素c 的氧化导致的550 nm 处吸光值的降低, 得出COX 的活性。

苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)活性的测定参考Glatthaar 等(1974)的方法, 利用紫外分光光度计在340 nm 处吸光值的增加来表示MDH 的活性。