化学发光分析法
化学发光法elisa
化学发光法elisaELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，通过检测化学发光信号来定量分析样品中的目标物质。
它是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
化学发光法ELISA的原理是利用酶标记抗体与待测物质结合，然后通过酶催化反应产生化学发光信号。
ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等多种类型，根据实验需要选择不同的方法。
在ELISA实验中，首先需要将待测物质固定在试验板上，然后加入酶标记抗体与待测物质结合。
接着，加入底物溶液，底物与酶催化反应产生化学发光信号。
最后，使用专用的发光仪器测量发光强度，根据发光强度的大小可以定量分析样品中的目标物质含量。
化学发光法ELISA具有许多优点。
首先，ELISA方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物质。
其次，ELISA方法具有高特异性，可以准确地区分目标物质与其他物质的结合。
此外，ELISA方法操作简单、快速，可以同时处理多个样品，提高实验效率。
最重要的是，ELISA方法可以应用于多种样品类型，包括血清、尿液、细胞培养液等，具有广泛的应用前景。
化学发光法ELISA在医学领域有着重要的应用。
例如，ELISA可以用于检测血液中的病原体抗体，如HIV、乙肝病毒等。
ELISA还可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期发现肿瘤并进行治疗。
此外，ELISA还可以用于检测药物浓度，指导药物治疗的调整。
除了医学领域，化学发光法ELISA在生物学、环境科学等领域也有广泛的应用。
例如，ELISA可以用于检测植物中的激素含量，研究植物生长发育的调控机制。
ELISA还可以用于检测环境中的污染物，如重金属、农药等，评估环境质量。
尽管化学发光法ELISA具有许多优点，但也存在一些局限性。
首先，ELISA方法对样品的处理要求较高，需要进行样品预处理、稀释等步骤，增加了实验的复杂性。
化学发光分析法
应用
➢ 直接作用：增敏和抑制作用
过渡金属：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+
维生素B6，维生素B12，维生素C，吗啡，可待 因，肾上腺素，多巴胺，细胞色素
➢ 间接作用
如 Fe2+对鲁米诺-H2O2体系有催化增敏作用，而 蛋白质却抑制此作用，据此可建立检测血清中蛋 白质含量的方法。
合成
高沸点溶剂（如二甘醇）
3-硝基邻苯二甲酸 + 肼
缩合反应
H2O + 3-硝基邻苯二甲酰肼 保险还粉原(强还原剂） 3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)
化学发光分析法
发光体系 ➢鲁米诺-H2O2体系 ➢鲁米诺-KIO4体系
化学发光分析法
鲁米诺-H2O2的反应是自身化学发光反应
在PH=11的水溶液中发光效率最大 鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化 氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定， 立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。 激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的 蓝光部分
化学发光分析法
➢基本原理 ➢常用的化学发光物质 ➢仪器装置 ➢影响化学发光的因素 ➢定性定量分析
化学发光分析法
• 化学发光（chemiluminescence）：又称为 冷光，它是在没有任何光、热或电场等激 发的情况下由化学反应而产生的光辐射。
由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂 散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。 具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方 便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工 程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等 各个领域正显示出它蓬勃的生机。
化学发光法的原理
化学发光法的原理化学发光法是一种利用化学方法产生可见光的技术，也称为化学发光分析法。
它利用发光试剂在特定条件下，通过化学反应产生光，可以被用于定量分析、生物标记和其他各种应用。
化学发光法的原理是基于某些特定的化学反应在产生产生光的过程中释放能量，这种能量通过光的形式被观测和测量，用于分析和检测目标物质。
化学发光法主要由两个部分组成：发光试剂和检测系统。
首先，发光试剂是化学发光反应的关键。
发光试剂通常由发光底物和触发剂组成。
发光底物是一种化学物质，可以与触发剂发生特定的化学反应，产生激发态粒子。
而触发剂则通常是一种促进化学反应发生的催化剂或者能量传递剂。
当发光试剂与目标物质接触时，发光试剂中的发光底物被激发，激发态的粒子释放出能量，产生光。
这种化学反应通常是一个连续的过程，发生在短时间内产生大量的光。
这种光通常具有特定的波长和强度，可以被用来计量反应物质的浓度或者进行定量分析。
在化学发光法中，检测系统是至关重要的部分。
检测系统通常由光源、光学系统和检测器组成。
光源通常是一种灯或者激光器，用于提供激发发光试剂所需的能量。
光学系统用于聚焦和收集发光产生的光，并将光信号传输到检测器中进行测量和分析。
检测器则用于测量光的强度或者其他光学特性，将信号转换成电信号，并进行信号处理和数据分析。
化学发光法可分为化学发光熄灭法和化学发光增光法两种类型。
化学发光熄灭法是指在化学发光反应中，加入其他物质导致发生化学熄灭而产生弱光信号；化学发光增光法则是指通过其他物质的增光作用，使发光反应产生的弱光信号变得更强，从而提高测定灵敏度。
这两种类型的化学发光法在分析应用中经常被使用。
化学发光法在生物分析、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在生物学研究中，化学发光法被用于检测生物分子的含量和活性，例如酶活性、DNA含量和氧化还原反应等。
在临床诊断中，化学发光法也被用于检测特定生物标志物和药物浓度，用于疾病诊断和治疗监测。
此外，化学发光法也可以用于环境中有毒物质和污染物的检测和监测，以及食品中有害物质的快速检测。
化学电发光法
化学电发光法
化学电发光法，也称为化学发光法，是一种利用化学反应产生的光来进行分析的方法。
这种方法通过将化学反应中释放的能量转化为光能，来检测物质的存在或浓度。
化学电发光法应用广泛，包括医学、生物学、环境科学和食品安全等领域。
化学电发光法首先需要一个发光体系，它通常由光源、底物和催化剂组成。
光源可以是电极、酶、放射性同位素等。
底物可以是偶氮联苯、酚类化合物、醛类化合物等。
催化剂可以是过氧化物、双氧水等。
当底物和催化剂反应时，会释放出能量。
这个能量激发光源，从而产生发光。
化学电发光法有许多种不同的应用方式，例如荧光检测、发光检测和化学发光免疫分析等。
其中化学发光免疫分析广泛应用于医学检测领域，这种方法利用化学发光反应来检测样品中的生物分子，例如蛋白质、荷尔蒙和肿瘤标志物等。
化学电发光法具有许多优点，例如灵敏度高、特异性好、操作简便等。
但它也存在一些局限性，例如容易受到外界干扰，需要严格的实验条件等。
因此，在使用化学电发光法进行分析时，需要非常谨慎地控制实验过程，以确保结果的准确性。
第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
56
5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
51
3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
化学发光分析法(现代表征方法与技术-朱昌青
Instrumental Analysis
7
c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应
范围1 ng/cm-3 ～1g/cm-3；
Instrumental Analysis
8
（2）火焰中的化学发光反应
Instrumental Analysis
19
b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 → O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h
最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；
Instrumental Analysis
6
氧原子与NO的发光反应：
pH7 - 8
复合物与氧反应，产生化学发光： AMP· 2 · + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O LH E
[氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm；
Instrumental Analysis
14
生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ： NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2
（3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 + O2
葡萄糖氧化酶 氨基酸氧化酶
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
化学发光分析法的应用
在大多数人的概念里，化学发光分析法没有多大的作用，只是一个用来研究发光不发光的方法。
但其实，化学发光分析法的应用是十分广泛的，在药物、临床、食检、水质监测中都发挥着重要的功效。
化学发光分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，从而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。
根据化学发光反应到某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法就叫做化学发光分析法。
由于化学发光分析法中没有可能产生背景信号的散射激发辐射，因此，比起其他发光分析法更为灵敏。
化学发光分析法作为一种有效的微量和痕量分析的手段，已经被广泛应用到各个领域。
特别是分析检测领域，加之化学发光分析法具有仪器设备简单，线性响应范围宽等特点，近年来特别受到人们的中式。
目前，在水质污染的检测和研究中，已经成功运用了化学发光分析法。
化学发光分析法是根据化学反应产生的辐射光的强度或辐射总量来确定其相应组分含量的分析方法。
自19世纪下半叶发现一般有机物的化学发光反应以来，化学发光分析法便被应用到分析化学领域中，特别是近十年来化学发光分析法取得了很大的进展。
随着人们对环境保护的重视，对环境监测要求也愈来愈高，化学发光分析法的众多优点使得其在环境监测分析方面的应用也逐渐增加，特别是在水和废水中对无机离子的分析监测方面有较多应用。
近年来，随着环境科学研究的深入和发展，化学发光分析法在环境监测中的应用也日益增多，并成功地应用于大气监测、水质监测以及环境污染机理的研究中。
化学发光分析法。
大气环境监测中化学发光分析方法的应用与展望
大气环境监测中化学发光分析方法的应用与展望大气监测技术是随着环境科学的发展而逐渐形成的,化学发光分析法是现代大气监测技术中应用比较多的分析方法。
19世纪下半叶发现了有机物的化学发光反映,人们将其利用到了分析化学领域中,近些年来取得了很大的进展。
随着人们对生态和环保的重视,对大气环境的监测要求也逐渐增加,化学发光分析法的优势也逐渐显示出来。
1 化学发光分析法1.1 化学发光分析法的原理化学发光分析法的原理是指在没有任何电能、光能、热能等的作用下,仅仅依靠化学反应释放的化学能量激发光的辐射的发光形式。
化学反应不同,其产生的辐射光的波长也不同,因此化学发光分析法的基础就是化学辐射光的光强度以及化学反应的速度,其中后者是取决于发生化学反应的分子的密度。
通过对化学辐射光的光强度进行检测,就能够计算出待测物质的浓度。
不论什么样的化学发光反应都要进行两个关键的程序:化学激发和辐射光。
因此,也就决定了只有满足以下三个条件才能被称之为化学发光反应:发生反应后能够提供激发光的化学能;发生化学反应后释放的化学能需要被反应产物吸收,并被激发;处于激发状态的反应产物分子,释放出光子或者转移它吸收的能量至另一个光子并激发、辐射出光子,返回基态。
1.2 化学发光分析法的特点化学发光法是由化学能量激发所产生的光辐射,因此其不需要任何外部的光、热等能量,这样就大大的避免的了瑞利散射及拉曼散射等对周围的噪音的影响,提高了信噪比。
这种方法在实际应用中,其灵敏程度相当高,对于微量的气体和金属离子等微量元素的检测、分析能够达到1×10-9级;其线性范围也很宽,能够达到6个数量级;此外,化学发光分析法还具有分析快捷,自动化方便等多重优势。
2 大气环境监测中化学发光分析法体系2.1 鲁米诺化学发光法在最早研究出的化学发光法中鲁米诺化学发光法就是其中之一,它在碱性溶液中能够被氧化而被激发至激发状态,辐射蓝光返回至基态。
这里所说的氧化剂一般都是至H2O2。
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澳大利亚奇湖夜间发出幽蓝色荧光
幽蓝荧光原来是湖中微生物被外界干扰后出现的“应激反应”
这 种 荧 光 是 由 一 种 被 称 为 “ 生 物 体 发 光”(bioluminescence) 的化学反应引起的，一旦生活在 湖水中 的 微生物 夜 光藻 (Noctiluca Scintillans) 受 到 外界 “干扰”，它们就会做出自然反应，发出亮光。
化学发光强度与反应物浓度的关系
原则上讲,对任何化学发光反应,只要反应是一级或假一
级反应,都可以通过下式进行化学发光定量分析.例如,在
化学发光反应中如果物质B保持恒定,而物质A变化且为
一级或假一级反应,则
此式表明,化学发光强度与A的浓度成正比.
化学发光分析测定对象分类
①.化学发光反应中的反应物. ②.化学发光反应中的催化剂,增敏剂或抑制剂. ③.偶合反应中的反应物,催化剂,增敏剂.
A
Hale Waihona Puke A+ + eA-
分子A在负电势阶跃时被还原为A-:
A + eA + + AA* + A
A+与A-反应生成激发态的A*,并产生化学发光
A*
A+h
如果体系中含有还原(R) 或氧化(O)性物质时,仅在工作电
极上施加正或负电压便可生成激发态的A*而发光:
A 或
A+ + e- A + eA+ + R A* +R,
例如,Ru(phen)32+- Ce(Ⅳ)化学发光体系检测吲哚 乙酸就属于这一类型
[Ru(phen)32+]*代表Ru(phen)32+的激发态,[R*]代表待测物 与强氧化剂Ce(Ⅳ)反应所生成的活性中间体.
④.光解化学发光 光解化学发光是指化学物质在强光源作用下分裂成 分子碎片,这些分子碎片在发生化学反应时产生的光辐 射.反应方程为:
c是具有可能产生激发分子的反应分子分数即形成化 学产物的量。 e是处于电子激发态分子的分数,与能量转移效率有关。 f是发射出光子的分子占从激发态回到基态的分子的 分数。
化学发光反应的主要类型
①.自身化学发光反应
②.敏化化学发光
③.偶合化学发光反应
④.光解化学发光
⑤.火焰化学发光
⑥.电致化学发光
FL
FL*+H2O2
FL + hv
分解
FL*
过氧草酸盐类的代表化合物(7)-双[2,4-二硝基苯基]草酸盐 (DNPO)和(8)-[2,4,6-三氯苯基]草酸盐TCPO 发光效率可达27%
过氧草酸盐类的应用
①.待测物质本身是荧光剂,可作为能量接受体和发光体.
②.待测物质参与某一反应可产生H2O2 等氧化剂而间接被测定. ③.待测物质可被衍生成荧光物质.
①.自身化学发光反应 自身化学发光反应是指被测物质作为反应物直接参加 化学反应,利用化学反应释放的能量激发产物分子产生 的光辐射.可用下式表示: A+B C* + D, C* C + hv
C*为A和B反应产物C的激发态,h为发射的光子.
②.敏化化学发光
敏化化学发光是指在某些化学反应中由于激发态 产物本身不发光或发光十分微弱,但通过加入某种能 量接受体(荧光剂)可导致发光.反应式为:
A* + Ce(III) 罗丹明6G*+ B 罗丹明6G + hv
A*+罗丹明6G 罗丹明6G*
③.偶合化学发光反应 偶合化学发光反应是指将能产生或消耗化学发 光反应中反应物的一个或一系列反应与一个化 学发光反应进行偶合.
偶合反应 化学发光发应
C+D E* + F, E* G + hv A + B C
③.过氧草酸盐类
过氧草酸盐类化学发光机理
草酸酯类化学发光机理分为三步:①.过氧化氢对草酸 酯的羰基亲核进攻,生成能产生高能量的双氧基环状中间 体二氧杂环丁二酮;
分解
H 2O 2
过氧草酸盐类化学发光机理
②.中间体分解,将能量传递给受体荧光分子,使之处于 激发态;③.这种激发态分子从激发单重态回到基态,释 放出光子即发出荧光.
A+ B
F + C* F*
C*+D, F* + C, F + hv
式中:C*为能量给予体;F为能量接受体.这是一类间 接发光,弥补了自身化学发光量子产率低的不足,具 有广泛用途.
例如,罗丹明6G-抗坏血酸-铈(Ⅳ)体系测定抗坏血 酸就属于敏化化学发光.其中罗丹明6G为发光能 量接受体.
抗坏血酸 + Ce(IV)
化学发光反应一般可表示为:
A+B
C*,
C*
C + h
该发光反应的化学发光强度取决于反应的速度dp/dt和 反应的化学发光量子效率(CL) ICL(t)= CLdp/dt 式中, CL可表示为CL= r f, 其中r为生成激发态产物分子的量子效率, f为激发态产物分子的发光量子效率, 对于一定的化学反应, CL为一定值;其反应速度可按 质量作用定律表示出与反应体系中物质浓度的关系.
化学发光及其光物理过程
碰撞去活化
化学激发 1.化学法应能(Φc) 150-300kJ/mol 2.能量转移(Φc)
磷光
光激发
荧光
化学发光反应的基本条件
①.该反应必须提供足够的激发能(对于蓝光
发射约需300kJ●mol-1,红光发射约需150
kJ●mol-1).导致电子从基态跃迁至激发态,
这一电子跃迁常常伴随有分子的振动和转动
快反应
K3Fe(CN)6氧化鲁米诺化学发光反应机理
辣根过氧化物酶催化反应机理
HRP与过氧化氢反应生成一氧化HRP(HRPⅠ),它 同鲁米诺阴离子反应生成半还原酶(HRPⅡ)和鲁米诺自 由基.再与第二个分子鲁米诺反应,酶回到还原形式.
鲁米诺*
鲁米诺-
鲁米诺-
鲁米诺*
②.丫啶衍生物
丫啶衍生物的一般发光机理
A+hv B*+C
B*+C, A*
A*
A+hv
例如,二氧化氮的光解化学发光机理可表示为
NO2+hv1 NO*+O NO2*
NO*+O, NO2*
NO2 +hv2
⑤.火焰化学发光
一般化合物在高温下成为气态分子碎片,这些气态
分子碎片间发生化学反应时所产生的化学发光称为火
焰化学发光. 分子碎片
A+B
C + hv
常是芳香族化合物和羰基化合物.
③.处于激发态的分子或原子必须具有一定的化学发光 量子效率使其能释放出光子,或者能够转移它的能量给 另一个分子使之处于激发态,在从激发态回到基态的过 程中释放出光子.
化学发光量子效率
能发射光子回到基态的分子数占溶液中该分子总数 的百分比称为发光量子产率(CL),它是由三方面的因素 决定的:
④.二氧杂环丁烷类
⑤.贵金属络合物发光试剂
贵金属络合物发光试剂的发光动力学曲线
贵金属络合物发光机理
贵金属络合物发光机理
化学发光分析法的应用
①.无机物的分析 ②.有机物和药物分析 ③.生物体内活性氧的化学发光研究
④.化学发光在核酸杂交分析中的应用
化学发光定义
定义:
由化学反应产生能量,吸收了化学反应能的原子或分子
由激发态回到基态时产生的这一光辐射现象叫化学发光.
化学发光简史
公元前300年,人们观察到天然的生物发光. 1877年,Redziszewski 首次报道洛吩碱(Lophine,2,4,5-三苯基咪 唑)在碱性介质中与氧反应发出金黄色的光--"人为的"化学发光. 1928年,Albrecht报道了鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)在碱性介质 中的化学发光行为. 1929年,Harvey在电解碱性鲁米诺发现电极附近有发光现象,即 文献记载的最早的电致化学发光. 1935年,Gleu和Petsch第一个报道了光泽精(Lucigenin,N,N-二甲 基二丫啶硝酸盐)与过氧化氢反应产生的化学发光-绿光. 1964年,Mccapra提出基于一个二噁烷酮环形成机理来解释丫啶 酯的化学发光. 1966年,Lytle和 Hercules发现在强酸性或强碱性的钌(Ⅱ) [Ru(bipy)32+]溶液中加入芳香胺时发出橘红色的光(595nm).
AA* + O A* A + h
或 A- + O
电致化学发光测定草酸
Ru(bipy)32+在铂电极或碳电极上被氧化: Ru(bpy)32+ Ru(bpy)33+ + e-
随后在电极表面的扩散层发生下列反应: Ru(bpy)33+ + C2O42C2O4-· Ru(bpy)32+ + C2O4-· CO2 + CO2-·
当Ru(bipy)32+从激发态回到基态时,发射出橘红色的光 (595nm).
Ru(bpy)32+*
Ru(bpy)32+ + hv
化学发光强度与反应物浓度的关系
化学发光反应所以能用于分析测定,是因为化学发光强
度(ICL)与化学反应速度(dp/dt)相关联,而一切影响反应
速度的因素又都可以作为建立测定方法的依据.
CO2-· (自由基阴离子)是强还原剂,在与Ru(bipy)33+的电极 反应中能产生激发态的Ru(bipy)32+*. CO2-· +Ru(bpy)33+ CO2 + Ru(bpy)32+* CO2-· Ru(bpy)32+ + Ru(bpy)3+ +Ru(bpy)33+ CO2 +Ru(bpy)3+ Ru(bpy)32+ +Ru(bpy)32+*