病毒蚀斑技术
病毒分离培养的细胞培养法
第18章病毒分离培养的细胞培养法一、细胞培养用于病毒研究的优点：细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性（细胞的病理变化及包涵体的形成）。
观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，以及研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，可用于病毒的分离鉴定，抗原的制备及疫苗，干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。
近年来，可用于繁殖病毒载体以用于基因治疗。
应用细胞培养来研究病毒有下列优点：1、没有隐性感染：动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。
细胞培养一方面是来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。
2、没有免疫力：动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现在细胞抵抗力的增加，因此离体细胞无免疫力，利于病毒生长。
3、容易选择易感细胞：细胞来源方便，可供作病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒一细胞的相互关系。
4、接种量大：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，细胞不仅可以大量生产，而且还可较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。
5、培养条件易于控制：由于细胞培养可以用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。
6、提高了疫苗的产量和质量：细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应机会少。
疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于贮存，且效力均匀，易标准化。
7、加速病毒分离过程：病毒分离采用细胞培养不仅阳性率高，而且分离过程可显著加速早出结果，但应用对该病毒敏感的细胞。
二、用细胞培养分离病毒(一)接种标本的处理：1、粪便标本：用于分离肠道病毒之粪便标本放入装玻璃珠40ml沉淀管内，大约每2克粪便用15ml Hanks液稀释(其余粪便于-20℃保存备用)，用橡皮塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r/min沉淀15分钟后，按将上清用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r/min沉淀1小时再取其上清，1.8ml加入0.2ml抗菌素液进行处理(浓度为25000u/ml的双抗及250mg/L二性霉素B)剩下的悬液保存于-20℃备用。
蚀斑形成试验操作技术与方法
蚀斑形成试验操作技术与方法【操作法】1.制备CEF细胞单层培养板（24孔、12孑L、6孔），细胞量要求2x106~4x1C P/ml , 每孔可加1~3ml细胞悬液.37C温箱培养，•待形成单层后接毒.,在接毒前先用不含血清培养液淋洗一次.2•待检病毒液样品将病毒液用含2%犊牛血清（CS的缓冲液作10倍系列稀释，取其适当稀释度（10-5〜10-8），每一稀释度接种3个5厘米直径的培养皿（相当于6孔细胞培养板的3个孔），每一孔接入稀释的毒液~，同时设2个不接毒液的对照培养孔，让病毒37C温箱中吸附60~90min，再用3~5ml预热的不含血清的缓冲液轻轻淋洗一次细胞单层，然后再加入3~5ml 含2%犊牛血清的营养琼脂培养基（制备琼脂培养基，制备高压蒸汽灭菌的％琼脂（优质Agar-Noble）溶液，这可以提前准备好放在4C备用。
用前水浴融化，待冷至46C〜47C再加等体积2倍浓缩的含4%犊牛血清的预热45C的培养基）放室温停留约15min 待琼脂凝固后，再返回温箱继续培养。
此时培养皿应翻面孵育，因为此后病毒会分散于琼脂表面，从而污染同一培养物内的其它蚀斑，翻过来可以防止液体在琼脂面流动。
3.随时检查细胞单层生长状况和琼脂培养基颜色并制备染色培养基~，给含2%犊牛血清的培养基中加入1/100 体积的1%中性红水溶液（高压灭菌），然后每培养孔加入3~5ml（厚度2~3mm内），让其在培养箱中过夜。
4.将细胞培养板取出移去染色培养基再将培养板返回温箱1〜2h,然后在白色衬底上清楚地看到红色背景中不着色的蚀斑。
计出每一稀释度平均蚀斑。
注：既然中性红只染活细胞，蚀斑只出现在红色背景的清亮区，应该设置已知无关联病毒的蚀斑对照以便识别。
染色过的培养物在细胞单层溶解前还可以在温箱继续培养保持1 或2天，在此期间，每天数蚀斑两次，观察培养板孔是否出现新的蚀斑以及成双的变大的蚀斑。
5.应用将检验合格的同一批细胞毒液，逐瓶抽样等量混合于一灭菌容器内，用Hank,s 将病毒液10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个滴度分别接种细胞生长良好的CEF单层培养板上，接种量为孔，37E吸附2小时，然后吸出病毒液，淋洗一次，再覆盖含2% 犊牛血清的营养琼脂，每孔2~5ml，待凝固后，将培养板倒置，37E培养48~ 96小时；再覆盖含％中性红的营养琼脂，每孔3~5ml，待其凝固后，将瓶倒置，37°C培养24小时，再移去染色培养基,返回温箱1~2小时,在白色衬底上清楚地看到红色背景中不着色的蚀斑。
禽流感病毒的噬斑纯化方法
禽流感病毒的噬斑纯化方法实验目的用于禽流感病毒（AIV）的纯化，从混合毒中分离出禽流感病毒，病毒颗粒计数等。
实验原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒。
实验试剂。
实验材料酒精灯、酒精棉、酒精喷壶、打火机、计时器、一次性手套、试管架、镊子、塑料吸管、50ml 离心管及管架、高压灭菌后的1.5ml离心管、1000ul、100ul 枪及枪头、振荡器、PBS液、1×DMEM（无血清）、2×DMEM、2%低熔点琼脂糖、血清/胰酶。
1×DMEM（不含丙酮酸钠）、胰酶购自Life Technologies、小牛血清购自百旺公司。
操作步骤（一）噬斑纯化在6孔培养板中培养鸡胚成纤维细胞（CEF），使形成单层，细胞培养至80%左右。
用1×DMEM（无血清）对病毒作10倍倍比稀释，方法如下：（1）准备7个灭菌1.5 mL离心管，每管中加入900 uL 1×DMEM（无血清），吸待测的病毒液100 uL加入到第一管中振荡混匀后，换枪头，再吸100 uL加入到第二管中，振荡混匀后，换枪头，吸100 uL加入第三管，依次向下稀释，分别至 10-5、10-6、10-7（或10-8）。
注：若为噬斑传代，则在每孔加入20 uL原代噬斑病毒液，再加980 uL无血清的1×DMEM。
（2）取出培养好的细胞，弃去旧的培养液，用PBS洗一遍；（3）接种病毒液，从10-3到 10-7每个稀释度一孔，每孔 100ul 病毒稀释液，按从高稀释度向低稀释度的顺序加，最后一孔加100 uL 1×DMEM （无血清）作为对照；（4）摇匀后置37℃生化培养箱吸附1 h（可延长至2 h）；（5）吸附1 h后弃去病毒液，并用枪头吸干净残留的病毒液，用PBS洗一遍；（6）配2%的低熔点琼脂糖高压灭菌后，在微波炉内加热熔化，取出后和含2% FBS 的2×DMEM（若为弱毒株，则用含25 uL胰酶/板的2×DMEM，不能添加血清）等量混匀，常温下，待冷却到约30℃左右时，迅速将混合液沿侧壁滴加在细胞上，每孔2 mL；（7）凝固后用胶布封好，倒置放在37℃培养箱培养；注：待凝胶完全凝固后再放入生化培养箱。
病毒中和试验-病毒蚀斑技术-分子生物学技术
单层法主要步骤：
（1）先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层
（2）倾弃或吸弃营养液加入Earle氏洗液冲洗单层细胞
或者加入不含血清的维持液（pH7.4-7.6）的0.5％乳白蛋白水
解物Earle氏液，37℃浸泡1 h后倾弃，洗去脱落的死亡细胞，
并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出，以减少血清对某些
基因组DNA探针、cDNA探针、RNA
探针和人工合成的寡核苷酸探针
① 按标记物划分
放射性标记和非放射性标记（生物素
和地高辛）
➢ DNA探针（DNA probe） 技术
基本原理
✓ DNA探针是带有标记物的已知序列的DNA片段
✓ DNA探针技术的基本原理是碱基配对
✓ 在变性而成为单链的被检DNA中加入变性的探
1. 病毒中和试验
2. 病毒蚀斑技术
3. 分子生物学技术
1. 病毒中和试验
1.1 中和试验概念、方法和应用
概念：
病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去
对易感动物的致病力，谓之中和试验
以测定病毒感染力为基础，以病毒受免
疫血清中和后的残存感染力为依据在，
来判定免疫血清中和病毒的能力
方法：
① 固定血清－稀释病毒法（病毒中和试验）
1先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层2倾弃或吸弃营养液加入earle氏洗液冲洗单层细胞或者加入不含血清的维持液ph7476的05乳白蛋白水解物earle氏液37浸泡1h后倾弃洗去脱落的死亡细胞并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出以减少血清对某些病毒可能有的非特异性抑制作用3接种病毒以不含血清的维持液将病毒作连续的10倍稀释选择适当稀释度的病毒悬液接种培养瓶或孔内的单层细胞接种量约为原营养液的110120每个稀释度至少接种3瓶或孔置37感作12小时使病毒充分吸附4中性红营养琼脂覆盖平放3060min待其凝固置37培养黑纸或黑布盖住中性红是光动力活性染料遇光时产生对病毒呈现毒性作用的物质分子生物学技术31核酸探针技术32单克抗体隆技术33核酸扩增34核酸电泳35免疫印迹技术311核酸探针种类31核酸探针技术按来源及性质划分基因组dna探针cdna探针rna探针和人工合成的寡核苷酸探针按标记物划分放射性标记和非放射性标记生物素和地高辛dna探针dnaprobe技术基本原理在变性而成为单链的被检dna中加入变性的探针随着温度的降低探针便可与被检dna中的互补序列形成双链这一过程称杂交通过捕捉探针标记物释放出的信号便可知被检dna中有无与探针序列相同的dna每一种病原体都具有独特的dna片段通过分离和标记这些片段就可制备出探针用于疾病的诊断等研究dna探针的标记物及标记用于dna探针标记的有效射性同位素和非放射性标记物常用的放射性同位素有32非放射性标记法可将生物素地高辛连接在dntp上然后象放射性标记一样掺入到核酸链中制备标记探针dna杂交固相杂交技术目前较为常用先将待测核酸结合到一定的固相支持物上再与液相中的标记探针进行杂交固相支持物常用硝酸纤维素膜nitrocellulosefiltermembrane简称nc膜或尼龙膜nylonmembrane通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上ii
【求助】什么叫病毒滴定？
【求助】什么叫病毒滴定？
病毒滴定是将病毒原液作10倍系列稀释后，可对病毒的量进行滴定。
常用表达的方式为TCID50（50％tissuecultureinfectivedose）,即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变（cytopathiceffect,CPE）的病毒量。
病毒蚀斑(又叫空斑)如同噬菌体的噬斑，一个蚀班为一个病毒体的繁殖后代品系。
在细胞培养中做蚀斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法，将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1小时后，在单层细胞上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。
但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区，经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化不着色，形成不染色区域。
凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。
2006-09-23 01:51
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病毒滴定实际为测定病毒效价，通常有两种方法：
1.空斑抑制法：方法如楼上所述，但是需计数空斑，较为繁琐，病毒效价表示为PFU/ml, PFU表示空斑形成单位。
2.TCID50法：表示使半数培养细胞收到感染并发生病变的病毒计量。
培养方法相同，待细胞病变达CPE+++~++++时，用中性红，结晶紫或MTT方法，根据染料摄入法计算出抑制率，进而通过REED-Muench法计算出TCID50,避免了人工计数空斑的繁琐和误差。
流感病毒滴定,噬斑和血凝抑制
流感病毒滴定，噬斑和血凝抑制实验血凝滴定法在血凝试验中，将连续的病毒稀释液与恒定量的RBC混合。
如果病毒浓度足够高，RBC包含许多血细胞凝集素受体，就会发生凝集。
如果添加血清，流感病毒对红细胞的凝集将被阻止；这是HAI分析的基础。
每种HAI分析中均应包括对照抗血清和抗原，以验证测试的特异性。
实验材料：1，96孔微滴定板：V底板用于鸟类红细胞RBC（erythrocyte/red blood cell），U底板用于哺乳动物RBCs。
2，0.01M的磷酸盐buffer：Ph7.2-7.4.3,标准的RBCs：禽类0.5%，哺乳动物0.75%，通过无菌纱布过滤RBCs，200g在4-8℃离心10min，吸出血浆，加入PBS离心重复两次，用PBS重悬RBCs 和调整到需要的浓度，储存在4-8℃。
鸡红细胞1000rpm/5min。
看是否有沉淀，如果有，就说明这个变质不能用，用PBS洗一次，1000rpm/5min。
用PBS稀释到10mL，滴定板中先加入PBS，再加入病毒，最后加红细胞。
如果对照组有纽扣形成，看实验组。
，在HA测试期间将病毒库存保存在冰上，以保持病毒的感染性。
实验方法：1，将在组织培养或鸡胚鸡蛋中分离的每种流感病毒的等分试样（100μL）放在96孔微量滴定板第一行的孔中。
在第2行至第12行中加入50 μL PBS。
在96孔板上向下进行一系列2倍稀释，将50 μL从第1行转移到第2行，依此类推。
从最后一个孔中取出最后的50 μL。
向所有孔中添加50μL标准RBC。
轻轻拍打板以混合或使用机械摇板。
在室温（20–25°C）下孵育平板30min。
2，培养期后，观察到HAU的凝集终点（图2）。
在阴性样品中，RBC将沉降到V孔微量滴定板的底部，而在阳性样品中，它们将凝集。
第8列中的孔不包含病毒。
凝集的RBC将均匀地分布在孔中，而不凝集的RBC将在V孔底部形成一个纽扣。
HA滴度是显示完全血凝活性的最后稀释液以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
病毒感染力的滴定
二、病毒蚀斑技术 病毒蚀斑（plaque) 又称空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形
成的局限性病灶。
原理：适当稀释的病毒悬液接种经长成单层的敏感
细胞后，在覆盖的固体或半固体介质（琼脂糖、甲基 纤维素）的作用下，病毒在最初感染的细胞内增殖后， 只能进而感染并破坏临近的细胞，经过几个增殖周期 后，形成一个局限性的肉眼可见的病变细胞区，即局
每毫升病毒悬液中所含的蚀斑数，即病毒悬液
中的感染性病毒浓度。 计算方法： 如用PRV接种PK-15细胞，每孔接种了0.4ml，结 果10-5孔形成了208个空斑，而10-6孔形成了22个空斑，
则该病毒在PK-15细胞上的空斑形成单位（PFU）为：
22×106/0.4ml=5.5×107个/ml。
一、病毒TCID50的测定 操作步骤
在青霉素瓶中将病毒作连续 10倍的稀释，从10-1-
10-10。
将稀释好的病毒接种到 96孔微量培养板中，每一
稀释度作8孔，每孔接种100µ l。
在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到3×105 个/ml。
设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
将培养板臵37℃ 5% CO2培养箱吸附1h，吸弃病毒液， 用含钙、镁的PBS（pH7.4）洗3次。 取1.6%-2%的低熔点琼脂糖，融化后降温至38-42℃，
与等量预热至38-42℃含6%-10%犊牛血清的无酚红
DMEM混合，注入细胞培养板中。
室温放臵直至琼脂糖凝固，或于4℃冰箱放臵几
分钟至琼脂糖凝固，然后于37℃ 5% CO2培养箱
获得高滴度的病毒，扩大培养后作种用。
• 筛选重组病毒：收集病变的细胞或病毒悬液，
通过PCR或其它方法进行鉴定，取阳性者再作下 一轮空斑纯化。如此3-5轮空斑纯化后即可得到 纯化的病毒粒子。
病毒蚀斑技术
病毒蚀斑技术1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。
(一) 原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。
经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。
从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。
但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。
对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。
固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。
小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。
为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。
因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。
病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。
例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为，病毒的稀释度为×103 ，则病毒原液的滴度为：58÷××103 ＝×105 (PFU/ml)(二) 技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。
1.病毒生物学纯化 (Virus biological purification) 在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。
这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。
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病毒蚀斑技术病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。
将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。
经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。
某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。
因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。
混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。
为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。
这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。
中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。
这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。
在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。
某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。
从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。
反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。
但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。
根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。
因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。
病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。
例如在接种02ml病毒悬液的细胞瓶中出现36个蚀斑，则每ml病毒悬液的蚀斑形成单位就是1/02×36=180个，亦即180PFU/ml，当然也可写成36PFU/02ml。
蚀斑技术主要用于病毒纯化，亦即挑选病毒克隆株(Clone)。
由于病毒的遗传变异，一般所用的病毒悬液或所谓的病毒株，实际上都是由许多在特性上不尽一致的病毒粒子组成的混杂群体。
应用蚀斑技术，也就是根据蚀斑的不同的性状、产斑条件和产斑时间等进行挑斑，可以从这类混杂群体中挑选出各个不同的纯化病毒，亦即克隆株。
近年来，许多弱毒疫苗株就是通过蚀斑技术选育而成。
我们实验室应用蚀斑技术从狂犬病弱毒株中，分离获得了免疫性显著优于其亲本株的SRV9克隆株。
而在弱毒疫苗的生产中，也需经常地通过蚀斑技术选出克隆株，借以保证疫苗株稳定的免疫原性和弱毒特性。
蚀斑技术还是测定病毒悬液中感染病毒含量的一个准确方法。
因为组织培养细胞的敏感性比较一致，培养条件也易统一，所以蚀斑技术已在许多动物病毒的滴定中取代了实验动物滴定法。
由于特异性抗体能够抑制病毒产生蚀斑，故可应用蚀斑技术测定动物血清或其他体液内的中和抗体，亦即所谓的蚀斑抑制试验和蚀斑减数试验，详见本书第十四章。
目前应用的蚀斑技术，主要有单层法和悬浮法，现分别介绍如下。
〖HT4SS〗〖JZ〗(一)单层法〖HT〗单层法是目前最常应用的一种方法，多用于病毒克隆化(挑斑)以及病毒毒力的滴定。
此外，病毒遗传变异研究以及蚀斑抑制或蚀斑减数试验等血清学技术亦在此基础上进行。
主要步骤如下：(1)先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层。
如果有CO2温箱，使用24孔培养板更为方便，当然也可使用平皿。
蚀斑试验时的细胞接种量要大，通常为每ml200～400万个细胞。
(2)倾弃或吸弃营养液，加入Earle氏洗液冲洗单层细胞，或者加入不含血清的维持液——pH74～76的05％乳白蛋白水解物Earle氏液，37℃浸泡一小时后倾弃，洗去脱落的死亡细胞，并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出，以减少血清对某些病毒可能有的非特异性抑制作用。
(3)以不含血清的维持液(脑炎类病毒可用灭菌的10％脱脂牛乳生理盐水)将病毒作连续的10倍稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养瓶或孔内的单层细胞，接种量约为原营养液的1／10～1／20，每个稀释度至少接种3瓶(或孔)。
置37℃感作1～2小时，使病毒充分吸附。
某些病毒的吸附较慢，可将感作时间延长到2小时以上。
吸附完毕后，吸出病毒液。
有人建议再用Earle氏液或无血清维持液洗涤细胞一次，作者认为并不十分必要，特别是对抵抗力低的病毒，因为未吸附的病毒将在37℃培养期间自行灭活。
(4)取含中性红的营养琼脂糖(配制法见本节附录)，融化后降温至43～45℃,注入细胞培养瓶内无细胞的一面，再将培养瓶缓慢翻转，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，厚度约2mm，以不超过3mm为宜。
平放30～60分钟，待琼脂糖凝固,随后置37℃继续培养。
由于中性红是光动力活性染料，遇光时产生对病毒呈现毒性作用的物质。
故将中性红营养琼脂糖注入细胞培养瓶后，应立即用黑纸或黑布盖住，置37℃培养时也要放在暗匣内避光，此后逐日观察一次细胞形态以及出斑情况,见图11-2。
〖JZ〗图11-2狂犬病毒Flury株在BHK〖DK〗21细胞上的蚀斑(左),右为健康对照〖JY,8〗自岳军明某些病毒的出斑时间较晚，例如马传染性贫血病毒的蚀斑实验，可以采用双层琼脂糖法，即在给单层细胞接种病毒后，先覆盖第一层不含中性红的营养琼脂糖，5～6天后，再加入内含中性红的第二层营养琼脂糖层，继续培养(避光)，并逐日观察细胞形态和出斑情况。
作者等的具体方法是：取已长成单层的驴胎继代细胞，倾弃营养液，接种适当稀释的病毒液(细胞培养毒)，例如10-3、10-4、10-5，每个培养瓶接种05ml(10ml培养瓶)，37℃感作2小时，吸弃残留的病毒液，加入融化并冷却至43～45℃的第一层琼脂糖8ml(见本节附录)，逐日观察细胞。
于第6～7天，当细胞开始出现粗糙现象时，加入内含中性红的第二层琼脂糖(见本节附录)，每瓶3～4ml,置暗匣内继续培养，第2～3天后即可出斑。
出斑数与病毒液的浓度基本相符。
对出斑时间较迟和中性红敏感的病毒，覆盖层中不加中性红，而根据病毒的出斑时间，在培养后的适当时机，单独应用中性红溶液染色，同样能获得轮廓清晰、形态规整的蚀斑。
〖HT4SS〗〖JZ〗(二)悬浮法〖HT〗悬浮法主要用于不能增殖的细胞，例如血液或腹腔巨噬细胞等等，但也有人用于其它可以分裂增殖的细胞。
悬浮法不宜用于大型病毒，因为这类病毒在琼脂糖中不易扩散。
(1)先在培养瓶或平皿底部覆盖一层营养琼脂糖，使其形成2mm厚的底层，待其凝固；(2)根据细胞种类，用无血清维持液稀释成适当浓度的细胞悬液，例如Vero细胞和BHK细胞可用每ml600万个细胞的浓度，原代仓鼠肾、鸡胚细胞和巨噬细胞可用每ml1000万个细胞的浓度；(3)吸取上述细胞悬液，置灭菌试管中，每管16ml，再加入无血清维持液稀释的(例如10-3～10-8)病毒悬液04ml，每个稀释度最少接种3管；(4)充分振荡混合后置37℃温箱内感作30分钟，并定期振荡；(5)每管加入等量(2ml)的43～45℃营养琼脂糖，迅速混匀后倒入培养瓶(10ml培养瓶)内的底层琼脂上，平放待其凝固；(6)根据各种病毒可能的出斑时间，于3～4天或更长一些时间后加入4～5ml001%中性红溶液(见本节附录)，37℃感作一小时；(7)吸弃多余的中性红溶液，观察蚀斑。
如果还未出斑，可将培养瓶继续置暗匣内培养，直至出现清晰的蚀斑。
利用悬浮法挑斑，同样也可在24孔细胞培养板上进行。
〖HT4SS〗〖JZ〗(三)挑斑法〖HT〗为了分离病毒克隆株，在培养瓶内出现清晰的蚀斑时，即可进行挑斑。
最好选择蚀斑数较少，各斑间的距离不小于10mm的培养瓶。
先在选定的蚀斑部位的瓶壁上做好标志，随后应用带有橡皮乳头的弯头吸管直接吸取选定的蚀斑——连同琼脂糖一起。
如系平皿内的蚀斑，则可直接用吸管吸取之。
将吸取的蚀斑琼脂糖洗入05～1ml营养液内，反复冻融三次，使病毒充分释放，用之接种敏感细胞,待其充分增殖以后，考虑再作下一轮的蚀斑纯化，并挑斑。
如此操作三次，一般可达到纯化目的。
〖JZ〗〖HT4H〗附录1.琼脂糖〖HT〗是从琼脂中去除对细胞有毒性作用的琼脂胶后,精制出的一种线性多糖。
它对细胞既无毒性,又能形成透明的半固体状态,有利于挑斑,所以是蚀斑技术常用的覆盖物。
以各厂家生产的琼脂糖配制的凝胶硬度不尽相同,实践中可以适当调整其含量。
此外,甲基纤维素也很好,但由于它制备的覆盖层呈半液体状态,虽适于病毒的毒力滴定和中和抗体检测,但用于病毒克隆则比较困难,不好挑斑。
〖HT5H〗2.中性红〖HT〗各厂家生产的中性红的质量明显不同,即使同一厂家生产的不同批号的中性红,质量也不一致。
因此必须通过对比试验,慎重选用同一批号的产品。
保存时还应避光、避热、避潮。
保存多年的中性红,质量下降,似乎还增高毒性。
配制1∶1000或1∶10000中性红溶液时,可将中性红粉直接溶于去离子水配制的085%NaCl液中。
8磅高压灭菌,使其彻底溶解,无菌分装于褐色瓶内,置4℃冰箱保存备用。
营养琼脂糖内中性红的最后浓度以1/28000～1/36000为宜。
3营养琼脂糖〖HT〗根据细胞和病毒种类的不同,选择下列某一种营养琼脂糖。
鸡胚原代细胞一般用05%乳白蛋白水解物-犊牛血清营养琼脂糖,作痘病毒和脑炎病毒的蚀斑试验,常能取得满意结果。
哺乳动物肾细胞、二倍体细胞和传代细胞则常应用以199或E〖CD*2〗MEM等配制的营养琼脂糖。
(1)05%乳白蛋白水解物-犊牛血清营养琼脂糖:首先配制乳白蛋白水解物琼脂糖,取:〖WX(!31KG5,3YQ〗Earle氏液(10倍浓缩,不含酚红和碳酸氢钠)〖〗18ml〖〗乳白蛋白水解物〖〗09g〖〗琼脂糖〖〗12g〖〗去离子水〖〗140ml〖WX)〗将上述各成分混合,煮沸溶解,然后分装小瓶,8磅高压灭菌15分钟,4℃保存备用。
用前将其置于沸水浴中加热融化,待温度降至43～45℃时按下列比例配成营养琼脂糖:〖WX(!31KG5,3YQ〗乳白蛋白水解物琼脂糖〖〗80ml〖〗犊牛血清〖〗45ml〖〗1:1000中性红溶液〖〗25ml〖〗75%碳酸氢钠溶液〖〗25ml〖〗青、链霉素溶液(每ml分别含青、链霉素1000单位)〖〗08ml〖WX)〗配好后,振摇混合,置43～45℃水浴中保温备用。
如此配制的营养琼脂糖的pH为72～74,应呈红黄色,必要时适当调整pH。