结核病实验室诊断技术进展
摘要:早期确诊和提高治愈率是控制结核病的现实目标。
结核病患者的发现率基本反映结核病发病趋势，而诊断技术决定了结核病患者的发现率水平。
当前对结核病的诊断主要依赖于患者的临床表现、影像学、病原学、血清抗体检测等技术。
近年来，结核病实验室诊断技术发展突飞猛进，然而，目前很多实验室对于结核病的诊断仍停留在痰涂片镜检、痰结核菌培养及PPD皮试等传统方法。
本文现将具有代表性的几项结核病实验室诊断新技术的进展进行综述。
关键词:结核分枝杆菌；实验室；诊断中图分类号R378.91+1，R52文献标识码A文章编号1674-1129(2012)06-0570-03doi:10.3969/j.issn.1674-1129.2012.06.017·综述·结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的结核病是常见的人类传染病之一。
约三分之一的世界人口曾经感染MTB，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。
据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，中国是全球22个结核病高发国之一，发病人数130万，居世界第2位，仅次于印度[1，2]。
结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，长期以来，结核病的实验室诊断主要依赖细菌学涂片和培养检查。
由于方法所限，严重影响了结核病的及时诊断，因此建立检测快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病防治工作具有重要意义[3]。
现将近年来结核病实验室检测技术的进展综述如下。
１结核病病原菌检测技术1.1抗酸杆菌涂片镜检1.1.1萋-尼氏抗酸染色涂片萋-尼抗酸染色涂片镜检是经典的结核分枝杆菌检测方法，目前很多实验室仍然依靠此方法进行结核检测，但其灵敏度较低，仅20%~30%，而且此方法繁琐，假阳性和假阴性较高。
张立群对比了4种不同结核分枝杆菌检测方法，显示萋-尼抗酸染色涂片的阳性率为11.6%，灵敏度仅为26.3%[4]。
1.1.2荧光染色法以金胺-罗丹明为代表的荧光染色法提高了镜检的灵敏度，并使读片时间大大缩短，假阳性和假阴性也明显降低[5]。
但荧光显微镜昂贵的价格，限制了其在基层的应用。
1.1.3LED显微镜将显微镜与发光二极管相结合研发的LED显微镜，具有低价格，长寿命，强可靠性等优点，诊断性能优于标准荧光显微镜。
多项研究显示：LED检查的敏感性比传统镜检方法高约10%[6]。
同时具备荧光染色的优点，且花费低、可实施性强，可更广泛地常规使用。
1.2分枝杆菌培养技术1.2.1传统结核菌培养结核菌培养仍是目前诊断MTB的金标准，尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用[7]，是鉴定是否为活菌的可靠方法，但传统的罗氏培养需要4~6周才能检测到结核菌的生长，而且阳性率也只有30%~40%；特异性差，各种分枝杆菌均可生长，要确定是否为结核菌，需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。
1.2.2结核菌快速检测系统BD公司推出的BACTEC-MGIT960全自动分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统，操作简便，阳性标本检出时间平均为9d；鉴定、药敏试验时间平均为4d；阳性标本检出率比传统培养方法提高10.77%，比BACTEC-460法提高4.97%。
1.2.3液体变色培养基测定法此方法具有培养和药物敏感性检测的双重功能。
其原理是应用含有氧化还原显示剂无色四氮唑盐的液体培养基进行培养，当有分枝杆菌生长时，氧化还原系统将培养基中的无色四氮唑盐还原成不溶于水的紫红色物质，并以颗粒形式分泌至细胞表面，从而使结核分枝杆菌菌落变成肉眼可观察到的红色或紫色菌落。
本法阳性结果报告时间平均为10d左右，与L-J培养基比较提高阳性率约为10%~15%，且操作结核病实验室诊断技术进展杨淑华综述，张月香审校(天津市中心妇产科医院检验科，天津300100)作者简介：杨淑华，女，生于1979年9月，毕业于天津医科大学，生化与分子生物学专业简便，不需要昂贵大型仪器设备，适于在发展中国家和贫困地区推广应用[8]。
存在的问题是阳性率不高，结果判断易带主观性，且变色存留时间较短，仅2~3d紫色即消失，需及时观察结果[9]。
1.2.4噬菌体裂解试验检测原理是分枝杆菌噬菌体可进入活的分枝杆菌使其感染，随后加入杀毒剂灭活未进入感染菌体内的噬菌体。
进入菌体内的噬菌体在感染菌体内大量增殖，并裂解菌体，释放出的子代噬菌体可感染并裂解随后加入的指示细胞，从而在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。
因此，只要根据噬菌斑的有无及其多少就可判断待检标本中是否存在活的MTB。
由于噬菌体及敏感细胞均能快速增殖，本法从标本采集处理到结果判定只需18~24h，并具有较高的敏感性和特异性，诊断肺结核的总敏感度75.0%，特异度为95. 2%，阳性检出率为75.0%，该方法敏感性高、特异性强、操作简便，对结核病临床诊断有较高的应用价值[10]。
但其测定结果可受许多测定因素的影响，如噬菌体浓度、结核分枝杆菌活性的保持、指示细胞的配置以及杀毒剂灭活时间等[11]。
２免疫学检测技术2.1结核菌素试验包括旧结核菌素(old tuber culin，OT)试验和结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)试验。
优点是快速、简便、低成本，但假阳性率高，标准化难，且难以与卡介苗接种引起的免疫反应相鉴别。
2.2血清学检测技术从20世纪70年代建立了酶联免疫吸附法后，形成了很多以检测结核抗体或结核抗原为主的免疫血清学检测方法，在现代结核病的快速诊断中发挥着重要作用。
2.2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)2.2.1.1结核抗体测定主要应用ELISA方法检测结核病人血清中的特异性抗体。
然而结核病患者经常因免疫应答低下，导致体液免疫检测或细胞免疫检测假阴性。
且由于种属间共同抗原决定簇的存在，导致结核抗原检测的特异性和敏感性低下，致使此法难以取得实质性的进展。
2.2.1.2结核抗原测定检测结核病患者血清结核杆菌抗原可以作为结核杆菌存在的直接证据,也可以避免结核病患者因免疫应答低下导致的假阴性结果。
近年来由于单克隆抗体制备技术的提高，可以制备高效价的特异性抗体，从而使得检测结核病患者血清中的结核杆菌抗原成为结核诊断的新方法。
张周云等[12]利用基因工程方法在体外表达结核分枝杆菌的desA蛋白抗原制备成单克隆抗体，利用该抗体采用ELISA双抗体夹心法检测了139例临床已确诊的活动性肺结核患者血清中结核抗原，结果表明，其敏感性为84.17%特异性为92.19%。
2.2.2酶联免疫斑点(ELI Spot)技术是检测结核抗原致敏的特异性效应T淋巴细胞。
本法可区分结核感染者和接种BCG的健康人群。
优点是灵敏、特异、快速，12h获得结果，有利于结核感染者和活动性结核病人的早期诊断，将成为基础和临床实验研究的标准技术[13]。
缺点是操作较复杂，需特殊仪器设备，试剂费用较贵。
2.2.3斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)该法比ELISA更为简便、快速，全程只需3~5min，并可单人份测定，由于操作简单，检测迅速，检出率高，不需要贵重仪器设备，能快速测定抗结核抗体，是一种较为理想的临床结核病辅助诊断方法[14]，因此深受欢迎。
2.2.4免疫印迹技术(Western blot)结核抗体免疫印迹法检测试剂盒选取的抗原来自于结核分枝杆菌全菌，并筛选出最具免疫原性及特异性高的蛋白成份做为诊断抗原，具有很高的敏感性和特异性，用于检测痰菌阳性结核患者、痰菌阴性结核患者、肺外结核病的敏感性分别为93%、86%、89%，特异性超过95%。
由于大幅度提高了诊断准确性，可做为结核病诊断的确证实验。
但该法较上述几种测定方法繁琐，临床常规检测应用相对较少，主要广泛用于科研实验。
2.3细胞因子检测结核分枝杆菌感染人体后，刺激免疫细胞产生保护性细胞因子，其中最主要的是T细胞亚群、IFN-γ、IL-2及SIL-2R。
通过检测细胞因子水平可对结核分枝杆菌感染及结核病的诊断提供参考。
目前这项技术应用也极为广泛[15-17]。
３分子生物学检测技术近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。
研究、应用报道较多的结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。
3.1核酸检测技术聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)、核酸探针技术(DNA probe)、DNA 指纹技术等分子生物学技术的特点是检测敏感性高、特异性强、简便、快速，在灵敏性上显著优于培养法和涂片法等传统方法，可以反映结核菌的真实感染情况，对于临床诊断和疗效考察有一定的指导意义[18]。
但因需要专门的仪器设备和复杂的技术支撑，在应用范围上受到了极大限制[19-21]。
3.2基因芯片技术基因芯片始创于90年代初，又称DNA芯片，是分子生物学前沿的高新技术。
其原理是在支持物(玻璃、硅片等)上将探针分子固定，然后与待检标本进行分子杂交，通过检测杂交信号强度从而得出样品分子的数量和序列信息。
此方法可一次性对样品大量序列进行检测和分析，具有自动化程度高，操作序列数量多，检测效率高等优点，可用于MTB菌种的鉴定、耐药性的监测、基因组比较分析等方面的研究。
黄明翔等[22]应用DNA芯片技术对分枝杆菌阳性培养物进行菌种鉴定，并以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为对照，结果两种方法鉴定吻合率为83.6%(112/134)，提示DNA芯片检测技术可以简便、快速、灵敏、特异地进行分枝杆菌的鉴定，但有待进一步完善。
3.3蛋白芯片技术此技术是一高特异性、高通量、高灵敏度且微型化的蛋白质分析技术，是蛋白组学研究近年来新兴起的一种方法。
其原理是以微孔滤膜作为载体，将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白相对分子质量16×103(rTPA16)和38×103(rTPA38)等3种抗原利用微阵列技术固相于同一膜片上，并利用微孔滤膜的渗滤、浓缩凝集作用，在固相膜上快速进行抗原-抗体反应，最后在膜上以免疫金作为标记物直接显色。
显色后将芯片放入芯片阅读仪，用专门软件对不同抗原点阵的灰度值进行分析，整个过程不超过30min。
本法诊断结核病的特异性96.3%，灵敏度为72.0%[23]。
其与酶联免疫吸附法(ELISA)相比，特异性高、敏感性相当。
且金标记物比酶稳定，冻干后可在室温下保存，优于ELISA法。
因此，可用于结核病的快速诊断，特别是肺外结核及菌阴肺结核病的快速诊断，该技术为临床诊断结核病起到了积极的作用[24]。
综上所述，由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，滞后于临床诊断和治疗，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。
结核实验室诊断技术研究进展
结核实验室诊断技术研究进展何珍综述，王璞△审校（重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016）【关键词】基因；分枝杆菌，结核；耐药性；实验室诊断；综述DOI：10.3969/j.issn.1009⁃5519.2018.21.021文献标识码：A文章编号：1009⁃5519（2018）21⁃3336⁃04结核病是结核分枝杆菌感染引起的呼吸道传染病，是全球单一病原体感染导致死亡的第九大原因，位于人类免疫缺陷病毒（HIV）/艾滋病之前。
2016年，全球新发结核病例近1040万例，其中56%在印度、印度尼西亚、中国、菲律宾、巴基斯坦。
约60万新发结核病例对利福平耐药，其中49万例为耐多药结核（MDR⁃TB）。
47%的患者主要分布在印度、中国和俄罗斯；估计有近170万例患者死于结核病[1]。
早期、准确、快速诊断结核是防治的关键。
近年来，结核实验室诊断技术通过不断创新取得了新的进展。
2017年11月新发布的《WS288⁃2017肺结核诊断标准》更对肺结核诊断标准做出重大调整，本文就近年来结核实验室诊断技术的进展作一综述。
1细菌学检测1.1涂片镜检1.1.1改良抗酸染色分枝杆菌抗酸染色法快速、简易、价廉，仍为目前应用最广的结核检测方法。
该方法主要分为7个步骤：玻片处理、标本收集、标本固定、复红染色、酒精脱色、美兰染色、镜检观察。
对任一步骤改进均可提高检测效率。
CHEN等[2]采用粟氏FMMU6型拨片离心沉淀仪处理脑脊液，再用多聚赖酸处理过的玻片收集其中的白细胞并用TritonX⁃100处理，增加了细胞壁对染色剂的通透性，使胞内菌着色更好，显著提高了检出率及敏感性。
邹月丽等[3]采用改良抗酸染色对脑脊液进行检测，将阳性率由10.00%提高至88.57%。
张继萍等[4]采用传统及改良抗酸染色法对菌阴结核支气管肺泡灌洗液进行检测，阳性率分别为38%、82%。
1.1.2荧光染色利用结核分枝杆菌的嗜酸性及对荧光染料的亲和性，以石炭酸为媒染剂加入染色液中，使分枝杆菌染上荧光。
结核病实验室诊断技术研发进展
结核杆 菌培养是诊 断结核病 的金标 准 ， 但传 统 的罗 氏培 养需要 ４～ ６周 的培养方能 检测 到结 核菌 的生长 。 目前 正在
推广 的液体培养系统 仅需 １ —３周 ， 更加敏 感 、 快速 。早 期 的
Ｂ Ｃ Ｅ －６ 由于具有 放射 性 而 限制 了其应 用 。Ｍ Ｉ Ａ Ｔ Ｃ４ ０法 Ｇ Ｔ为 ｍ ｃｂｃ ｒ ｌ ｒ ｔ ｉｄｃｔ ｂ ｙｏａｔ ｉ ｏ ｈ ｎ ｉ ｏ ｔ ｅ的简称 ， ｅａ ｇ ｗ ａ ｒｕ 其原 理是 Ｊ试 管 ： 底部的荧光复合物与氧气结 合时处 于淬灭状 态 ， 当结核 菌生 长时 ， 氧气逐渐减少 ， 荧光 复合 物就发出荧光 而被 检测 到。 自 动化的 ＭＧＴ还可 加入 临 界浓 度 的抗 结核 药物 进 行药 敏 分 Ｉ 析。Ｂ Ｄ公 司 推 出的 Ｂ Ｃ Ｅ － Ｉ ６ Ａ Ｔ Ｃ ＭＧＴ ９０全 自动分 枝杆 菌 培 养／ 鉴定／ 药敏系统操作简便 ； 阳性标本检出时间平均为 ９天 ；
诊断性能优于标准荧光显微镜。多项研究经 ｍ ｔ ｅ ａ分析显示 ： Ｌ Ｄ检查 的敏感 性 比传 统镜 检方法 高约 １ ％… 。同时具 备 Ｅ ０ 荧光染色的优点 ， 且花 费低 、 可实施性 强 ， 可更广泛 的常规 使 用。中国卫 生部 一 茨基金会 和中国卫 生部 一 国梅 里埃 基 盖 法 金会结核病防治项 目已准备将 Ｌ Ｄ显微 镜在 我 国基 层实 验 Ｅ
室推广。 二 、 枝 杆 菌 培 养 技 术 研 发 进 展 分
扩增反应在 等温条 件下进行 ， 不需 要专 门的 Ｐ Ｒ仪 ， Ｃ 只需一 个水浴 锅或 简单 的保 温桶 和温度计 ； 其结果可以肉眼读值 ： 通 过 生成 的焦磷 酸盐置换锰 离子 ， 使与之结 合的钙黄绿素 （ ａ— Ｃｌ ｃｉ） ｅ 游离 而发 出荧光 Ｊ也可通过 加人 核酸燃料 Ｓ Ｂ ｒｅ ｎ ， Ｙ ＲＧ ｅｎ Ｉ 或产生 白色混浊焦磷酸镁沉淀进行 肉眼观察或实时浊度计 观察 。其对于发展 中国家而言是一项分子检测结核杆菌的很 有前景 的方法 。 文献报 道 Ｌ ＭＰ的 总 特 异 性 为 ９ ％ Ｊ 总 敏 感 性 为 Ａ ９ ， ８ ．％ ， 中在痰涂 片 阴性 、 ８２ 其 培养 阳性 病 例 中 的敏 感性 只 有 ４ ． ％ ， 在 痰 涂 片 阳性 、 养 阳 性 病 例 中 的 敏 感 性 达 ８８ 但 培 ９ ． ％ 。中国卫生部 一盖茨基金会和 中国卫生部 一法 国梅里 ７７ 埃基金会结核病防治项 目已将 Ｌ Ｍ Ａ Ｐ列 入我国基层实验室推
结核病实验室检测技术研究进展
结核病实验室检测技术研究进展发布时间：2021-01-06T15:55:35.297Z 来源：《航空军医》2020年11期作者：赫利丹[导读] 结核病是由肺部吸入结核分枝杆菌造成感染引起的疾病,由于结核分枝杆菌喜欢在相对血液充沛含氧量高的环境中生活繁殖,所以,大多表现为肺结核疾病,具有较强的传染性。
赫利丹陕西咸阳市疾病预防控制中心 712000摘要：结核病是由肺部吸入结核分枝杆菌造成感染引起的疾病,由于结核分枝杆菌喜欢在相对血液充沛含氧量高的环境中生活繁殖,所以,大多表现为肺结核疾病,具有较强的传染性。
通过血液散播到身体其他部位的称为:肺外部结核病。
关键词：结核病；实验室检测技术引言结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，我国结核病的疫情尤为严重。
根据世界卫生组织的统计，全世界近三分之一的人口感染了结核病。
目前，全球有2,000万结核病患者，每年新增近870万结核病病人，且死亡人数多达200万例[1]。
我国是世界上二十多个结核病流行严重的国家之一，在最近十年的传染病统计中，结核病的死亡率仅次于艾滋病。
而且，随着结核病的症状变得越来越不典型，肺外结核感染的隐匿性给结核病的诊断和治疗带来了障碍。
因此，早期准确诊断和治疗结核病是控制结核病流行的关键措施之一。
尽管存在多种结核病诊断方法，例如确诊性细菌学检查、分子生物学检测和结核菌素皮肤试验等，但各种诊断方法的局限性和不足使得结核病的诊断更加困难[2]。
因此，为了对结核病进行早期诊断，以及通过判断治疗效果以便于更好地控制结核病，临床上需要一种准确、简单又快速、灵敏的诊断方法。
除此之外，治疗结核病还应具备充足的药物资金和便利的购药渠道。
为此，需要进行结核病诊断治疗的临床分析与经济学评价。
1结核病诊断过程分析在进行结核病的诊断时，首先需要制定检测方案，该方案需要通过具备质量保证的实验室提供药物敏感试验结果和当地耐药检测资料，以此作为药物选择的依据。
与此同时，还需收集该地区获得质量保证实验室提供的药物敏感性测试结果和区域耐药性测试数据，作为制定方案和选择药物的基础。
结核病实验室诊断方法的现状与进展
结核病是 由结核杆 菌引起 的疾病 ， 该 致病菌 可侵
犯肺 组织 、 淋 巴 系统 。结 核病 患者 可 出现 胸部 疼 痛 、
咳痰 、 咳血等 临床症 状 ， 并 且男 性发 病 率 明显 高 于女 性 … 。近年结核病 的发病率 越来越 高 ， 每 年新发病 人
数约 １ ０ ０ ０万 ， 防治工 作十分 严峻 。国外研 究认 为 ，
・
５ｌ ７・
结核病实验室诊断 方法 的现状 与进展
袁 方
【 关键词】 结核病 ； 实验室诊断； 发展 【 中圈分类号】 Ｒ ５ ２ 【 文献标识码】 Ａ
【 文章编号】 １ ０ ０ ４ － ５ ５ １ １ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ５ － ０ ５ １ ７ － ０ ４ 取标本 ， 滴入含有 ２ ０ ０ ｐ ． １ 双 蒸水 的离心 管 内 ， 并进 行 高温灭活 。 。提取 结 核分 支 杆 菌 Ｄ Ｎ Ａ， 再 通 过 使 用 Ｄ Ｎ Ａ扩增反应 、 反 向杂交膜显 色方 法进行诊 断。涂 片
方法检测 时间较 长 ， 患 者需要 等待 较 久方 知结 果 。
对于菌株的耐药性检测 ， 只要将 探针 固定 在基 因芯片 上， 即可进行观察和分析耐药情 况。
２ ． ４ Ｐ Ｃ Ｒ检测法 Ｐ Ｃ Ｒ检测法 又可称为 聚合酶链 反 应检测法 ， 其 为通过 体 外酶 合成 特异 性 Ｄ Ｎ Ａ片段 的 பைடு நூலகம்
实验室诊 断技术是结核病诊 断 中极 为重要 的手段 ， 随
着基 因芯 片 、 一干 扰素 释放 试验 等诊 断技 术 的成熟
运用 ， 极大地促进 结核 病诊断技术的发展 。 １ 传统结核病病原 学诊 断方法
度快 ， 准确度 高 。但线 性探 针 法也 有不 足之 处 ， 不 能
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诊 断 Diagnosis
标准 4. 所有胸部影象学检查可疑肺结核的病人，应该对其痰标本进行微生 物学检查。 Standard 4. All persons with chest radiographic findings suggestive of tuberculosis should have sputum specimens submitted for microbiological examination.
15人/年 • 如果不给予治疗涂阳病人更容易死亡
Rouillon A. Tubercle 1976;57:275-99
结核病变在体内的演变和播散
TB和HIV 双重感染 TB and HIV co-infection
• 在没有HIV感染的人群中，结核杆菌感染者在其一生中 大约有10%的人会发病
In the absence of HIV, about 10% of people infected with TB will develop TB disease. • 在TB/HIV双重感染者中约50%的感染者会成为结核病患者
In people co-infected with HIV and TB, about 50 % may develop TB disease • TB 加速和恶化 HIV/AIDS的疾病进展 TB accelerates the progression of HIV disease
TB和HIV 双重感染 TB and HIV co-infection (cont’)
卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA VNTR 2. 散在重复序列 Interpersed Repeats
GC富含重复序列和主要的串联重复序列 Polymorphic GC-Rich Repetitive Sequence & Major
结核病实验室新型检测技术及其发展方向
结核病实验室新型检测技术及其发展方向中国疾病预防控制中心欧喜超教师简介现就职于中国疾控中心国家结核病参比实验室，中国防痨协会基础专业分会副秘书长，中国防痨协会基础专业分会青委会副主任委员兼秘书长。
主要从事结核病流行病学和新诊断技术推广应用研究，负责全国结核病分子生物学检测技术质量控制工作在国家核心期刊及英文杂志以第一作者发表论文20余篇，其中SCI 论文8篇。
同时，参与多项国家级科研课题和国际项目的组织实施。
作为副主编参与编写《结核病实验室诊断技术培训教程》和《结核病实验室质量保证手册》等多部论著欧喜超副研究员学习目标掌握传统结核病实验室检测技术的优缺点了解结核病实验室新型检测技术发展方向熟悉结核病分子生物学检测技术研究现状01 02 03内容概况/ contents 结核病实验室检测的应用现状结核病新型检测技术发展方向结核病分子检测技术研发进展d i y i z h a n g j i e第一章节结核病实验室检测的应用现状结核病现有实验室诊断技术敏感快捷技术要求高检测成本高分子诊断不能区分潜伏感染和活动性结核TST/IGR A 假阴性假阳性率均较高WHO 不推荐血清学诊断简单快捷敏感性低不能区分MTBC 和NTM 痰涂片镜检金标准耗时长操作繁琐不能区分MTBC 和NTM 培养细胞免疫体液免疫结核杆菌菌体结核杆菌活菌结核杆菌核酸通过研发商品化试剂盒、改进仪器可降低技术门槛可检测耐药未来结核病实验室诊断的主要抓手MTBC ：结核分枝杆菌复合群；NTM ：非结核分枝杆菌肺结核诊断⏹2017年全球登记的551万新发和复发肺结核患者中，有56%经细菌学证实⏹2017年，我国确诊肺结核患者的病原学阳性率仅为32%国家“十三五”规划-患者及早发现⏹所有地市级定点医疗机构具备开展药敏试验、菌种鉴定和分子生物学诊断的能力⏹所有县级定点医疗机构具备痰涂片和痰培养检测能力⏹东中部地区和西部地区分别有80%和70%的县（市、区）具备开展分子诊断的能力患者及早发现●报告和疑似肺结核患者总体到位率95%以上●病原学阳性肺结核密切接触者筛查率达到95%●耐多药肺结核高危人群筛查率达到95%以上●肺结核患者的病原学阳性率达到50%以上结核病实验室检验流程d ie r z h a n g j i e第二章节结核病新型检测技术发展方向结核病新型检测技术目标简介(WHO)1 2 3 4 5 6灵敏度和特异度较高能够用于检测所有类型肺结核患者的样本简易，安全，快速，廉价具备评价治疗效果的能力能快速检测一线或二线抗结核药物的耐药性能诊断潜伏结核感染和病情发展风险结核病未来检测的方向分子诊断将是未来结核诊断市场的主力军即时诊断将是未来结核病诊断的主要趋势0102何为分子诊断技术？分子诊断(狭义)是利用标/样本中的病原菌核酸为检测靶标，对感染性疾病肿瘤、遗传性疾病等进行诊断的方法DNA RNA分子诊断技术发展历史01020504核酸分子杂交技术聚合酶链式反应（PCR ）和核酸恒温扩增技术基因芯片技术基因测序技术即时诊断（POCT ）技术03何为即时诊断(Point of Care, POC )？01“Near Patient Testing”：为患者就近提供诊断服务02检测时间短、检测空间灵活、检测操作者可以是非专业人员03真正实现“样品进，结果出”04数据上传到达医疗机构，可为被检人员提供远程医疗服务结核病分子诊断技术临床标本培养菌株分子操作(扩增, 杂交等)MTB 检测菌种鉴定耐药检测DNA/RNA 核酸提取方法？分子操作步骤：是否包括杂交？检测和鉴定结核病分子诊断技术⏹结核分枝杆菌分子生物学检测：特有保守的管家基因•IS6110•16S rRNA、gyrB、rpoB、MPB64、Rv0069c、Rv3133c、hsp65 ……⏹分枝杆菌分子菌种鉴定：管家基因•16S rRNA•16S～23S间隔区、rpoB及hsp65⏹结核分枝杆菌基因型药敏试验：耐药相关基因•利福平（RFP）：rpoB•异烟肼（INH）：KatG、inhA、ahpC耐药相关基因汇总结核病分子生物学诊断技术类型GeneXpert线性探针基因芯片熔解曲线反向点杂交环介导等温扩增交叉引物恒温扩增DNA实时荧光恒温扩增RNA实时荧光恒温扩增实时荧光定量PCRd i s a n z h a n g j i e第三章节结核病分子检测技术的研究进展结核病实验室检测技术进展概述Global Tuberculosis Report, 2018分子检测技术在结核病诊断中的作用TUBERCULOSIS Diagnostics Technology Landscape 5th Edition目录自动化结核分枝杆菌及其耐药性检测平台用于开放系统的核酸扩增检测试剂盒线性探针检测技术基因芯片检测平台模块化、反应盒为基础的全自动核酸扩增技术用于基层实验室的半自动核酸扩增技术全基因组测序技术自动化结核分枝杆菌及其耐药性检测平台Abbott 分子检测平台：自动化样本准备系统(m2000sp)和实时PCR分析系统(m2000rt)•Abbott m2000sp利用液体处理器和机械臂全自动提取样本核酸，并制备PCR反应板•检测结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼的耐药性，从样本制备到获得结果只需7小时Roche 分子检测平台：COBAS®8800检测平台和COBAS®TaqMan®检测试剂盒•8小时内可完成960份样本的检测，用户只需干预三次，每次运行无人值守时间长达4小时•仪器自带冷藏箱，可极大延长试剂的保存时间，并减少试剂的装卸次数2015 Tuberculosis Diagnostics Technology and Market Landscape2015 Tuberculosis Diagnostics Technology and Market Landscape•FluoroType MTB ，用于检测结核分枝杆菌。
结核病实验室诊断技术的研究进展
天 ， 本法 仪 器 和培 养 基 、 营养 添 Ｊ Ｊ 『 Ｊ 剂、 杂 菌抑 制 刹儒
进 口， 价格 昂贵 ， 污染 率也 较普 通 培养 法 高 ， 难 以 攮
层 医院常 规应用 ． 、 １ ． ２ ． ５ 快 速 变 色 培 养 基 测定 法 陔方 法 的 原 是 心
用 含有 显 示剂 无 色 四氮唑 盐 的液 体培 养基进 行培 养 ， 有 分枝 杆 菌生 长 时 ， 氧 化还 原 系统将 培 养 堪 ｝ Ｉ １ ｆ 尢 色 四氮 唑盐 还原 成不 溶 于水 的 紫红 包物 质 ， 从 使 分 枝 菌 菌落 变 成 肉 眼 可观 察 到 的 红 色 或 紫 色 闲 落
黎秋 菊 综述， 钟 利 审校
［ 关键 词 ］ 结核病 ； 实验 室 ； 诊 断 ［ 中图分 类 号 ］ Ｒ ５ ２
［ 文 章编 号 ］ １ ６ ７ ２ ． ７ １ ９ ３ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ — ０ ２ １ ８ — ０ ４ 结 核 病 （ｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｃ ｕ ｌ ｏ ｓ ｉ ｓ ， Ｔ Ｂ） 是 由结 核 分 枝 杆 菌 （ ［ 文 献标 识码 ］ Ａ
氏抗 酸 染 色 涂 片 、 荧 光染 色 法 。萋 一 尼 氏抗 酸 染 色 涂
耗时， 使 原 先被 Ｏ： 抑 制 的荧 光得 以释 放 ， 培 养 管 就发
荧光， 经 荧 光强度 记忆 探 测 裕 测 定， 实现 『 ｌ １ 功化 榆
测， 数 据处 理后 …结果 √ 匕足 口前全球 最怏 的分枝 卡 ｒ 菌培养 、 鉴定 和 药敏 测 定 系统 ， 陔 系统 分 卡 史 朴菌 卡 Ｊ ｊ 代 分 离 率达 到 ８ ８ ． ０ ％～ ９ ８ ． １ ％， 平 均报 告 时 问为 ｌ ５ ． ３ ～ｌ ７ ． ４
2004-10-10175903结核病实验室诊断技术进展
6、分子生物学检测技术
⑴核酸探针：用于测定待检菌核酸同源性序列 的标记核酸片断或序列。结核菌和非结核分枝 杆菌的核酸探针有C-DNA探针；全染色体核酸 探针；克隆核酸探针和寡核苷酸探针。主要用 于分离株的快速鉴定（经培养分离得的菌株）， 其特异性与敏感性均达到100％，有助于结核 病的诊断和鉴别诊断。但核酸探针技术存在检 测灵敏度低，在临床技术中有104－105菌体细 胞/ml才能呈现杂交阳性反应。
结核病实验室诊断技术进展
一、细菌学方面
1、
荧光镜检法检查抗酸杆菌：
可提高工作效率；提高检出率
镜检观察视野以60视野为宜，避免造成 假阴性且可提高工作效率3－5倍，荧光 镜检（直接涂片）法优于抗酸镜检（直 接涂片及集菌）法。
2、BACTEC460自动检测系统
利用分枝杆菌在液体培养基中能早 期微量生长的原理，采用放射技术，在 含有14CO2，仪器能自动测定其脉冲数， 即结核菌生长指数以GI表示，当GI达到 50－100时进行涂片抗酸染色证实是否抗 酸杆菌并观察是否呈索状生长。并以 NAP培养基进行结核菌和非结核分枝杆 菌鉴定。
耐药SM菌株中70－85％有核糖体蛋白S12编码基 因核S16γ RNA编码基因突变所致。耐INH株50－ 76.2％的过氧化氢酶－过氧化物酶编码基因突 变有关，12％在烯酸基还原酶基因，16.6％有 烷基过氧化氢酶编码基因突变。72％的耐PZA 菌株有PZA编码基因突变，69％耐EMB结核菌有 阿拉伯糖基转移酶编码基因B突变，89％发生 306位氨基酸密码子。耐奎诺酮类时由DNA回旋 酶A单位核B亚单位基因突变所致，集中在A亚 单位基因的保守区。
与常规方法的符合率为95－100％，但此法存
在放射性环境污染，费用昂贵，不易普及。
浅谈结核病实验诊断技术的新进展
ＴＳ Ｏ ．Ｂ试验是 以特异性抗 原为刺激 源 ， ．Ｐ ＴＴ 应用 酶联免
疫斑点技术诊 断结核感染 的新方法。结核感染后体 内长期存
在抗原特异性 的记忆性 Ｔ细胞 ， 当再次遇到抗原刺激时 ， 能迅 速活化增值 ， 释放 干扰素 。综合上述 原理 ，ａｖｎ 建立了 Ｌｌａｉ 。 以Ｒ Ｉ Ｄ 编码 的结核特异性抗原 ６ｋ Ｄ早期分泌 靶向抗原 （ Ｓ Ｅ— Ａ －） １ Ｋ Ｔ６ 和 ０ ｄ培养滤过蛋 白（ Ｆ 一０ 肽段库为刺激原 ， Ｃ Ｐ１ ） 检测 外周血中结核特异性释放 干 扰素 的 Ｔ淋 巴细胞 ， 从而诊 断 结 核杆菌感染 。其优点 为 ： 实验结 果清晰 ， 于判断。Ｐ ｉ 易 ａ 等 对 近 ３年的 １ ３项研究 进行 Ｍｅ ｔ ａ分析 ， 明 ＴＳ Ｏ —Ｂ的综 表 —Ｐ ＴＴ 合 敏感性为 ９ ％ ， ０ 在免疫力 低下 的人群 中 ， 然能够 维持较 依 高的敏感性 ” 。在肺外结 核 的诊 断中 ，—Ｐ ＴＴ ＴＳ Ｏ —Ｂ也具有较 高的敏感性 。Ｆ ｒ ｒ ｅｒ ａ和 Ｌｅ等报道 的 ２个前 瞻性研究 中 ， ａ ｅ 共 包括 １ ８例 肺 外结 核 患者 ， －Ｐ ＴＴ 阳性率 为 １０ ［９。 Ｔ Ｓ Ｏ —Ｂ ０ ％ ８ｊ ， 同时以 ＴＳ Ｏ —Ｂ为标 准能够 更加准 确地 锁定 需要 预防性 ．Ｐ ＴＴ
酸扩增法。
抗结核治疗 的感染者 。其斑点 数越多 ， 发生活动性 结核 的可
能性越大 ， 时间内斑点数显著增 加 ， 短 则强烈提示体 内结核活 动 ， 时给 予预防性 的治疗 十分必要 。Ｔ Ｓ Ｏ ・Ｂ在 现有结 此 —Ｐ ＴＴ 核诊断方法存在诸多缺陷 的今 天 ， 以给临床 医生 提供有力 可
速、 特异、操作简单 、 无须 昂 贵仪器 等优点 。但 其可 与少数
结核病实验室诊断技术进展
结核病实验室诊断技术进展结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。
结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。
世界卫生组织的统计资料显示，约三分之一的世界人口曾经感染结核菌，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。
据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。
目前我国三分之一左右的人口已感染了结核菌，受感染人数超过4亿。
据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。
我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群；每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。
如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。
历年来全国结核病流行病学调查结果显示，全国肺结核患病率继续呈现下降趋势。
特别是传染性肺结核患病率下降尤为明显，由2000年的122/10万下降到66/10万，十年降幅近50%。
结核分枝杆菌从分类上看是分枝杆菌科、分枝杆菌属中引起人类患病最多的致病菌。
结核病实验室检查，尤其是细菌学检查是结核病诊断的最主要和最基本技术，也是选择治疗方案、考核疗效、评价防治效果的主要指标。
目前结核病实验室检查技术包括：全菌体为基础的病原微生物学检测、细菌核酸为靶标的分子生物学检测和机体免疫相关反应及其产物的检测。
一、全菌体为基础的病原微生物学检查技术与其它传染性疾病相同，从检测原理和临床检验目的上，结核病的病原微生物学检查，分为基于形态学的显微镜镜检、基于微生物表型的分离培养、药物敏感性实验和菌种鉴定实验。
1. 分枝杆菌形态学检查——抗酸染色镜检：是结核病临床诊断最基本的方法之一，简单快速，在不考虑生物安全防护的前提下，２-４小时即可发报告，对于结核病的诊断、指导和评价临床用药具有重要意义。