载体构建流程
载体构建流程
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。 不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修 补。
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
连接
载体构建流程
载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
载体构建流程课件
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目旳基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目旳基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确旳摇菌提质粒
导入体现宿主 测试体现情况
提取mRNA
假如可能，试验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定时进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以防止将手、 臂上旳细菌和真菌以及人体本身分泌旳RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油旳终浓度控制在10%下列，以防止出 现星号活性，可经过增长反应体系旳总体积旳措 施实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
一般此步是必要旳，能够对比未经纯化旳酶切产 物进行连接后取得旳阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步旳目旳是清除多出旳片段，得到单一纯化旳 目旳基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
谢谢！
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性旳LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞旳效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应当代分子生物学试验室批量工作 旳高效性，一般只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
切胶回收PCR产物时，防止DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
载体构建技术基本流程
载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。
重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。
后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。
P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。
连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。
连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。
如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。
引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。
酶切法构建载体的流程
酶切法构建载体的流程酶切法构建载体的那些事儿。
一、准备工作。
这就好比做饭之前得先把食材和厨具都准备好一样。
构建载体前，得把载体和目的基因这两个关键的东西准备妥当。
载体就像是一辆小货车，它能把我们的目的基因运输到我们想要的地方去。
这个载体要选择合适的，就像选车得根据货物的大小、运输的路况来选一样。
目的基因呢，那可是我们的宝贝货物，要通过各种手段把它提取出来，确保它的纯度和完整性。
另外，还得准备好各种酶，就像厨师做菜需要各种调料一样。
像限制性内切酶，这可是关键的酶，它就像一把小剪刀，能在特定的位置把载体和目的基因剪开。
还有连接酶，它的作用就是把剪开又处理好的载体和目的基因连接起来，就像胶水把东西粘在一起似的。
而且，反应缓冲液也不能少，这就像是酶发挥作用的小环境，没有合适的缓冲液，酶可能就不好好干活啦。
二、酶切过程。
这一步可重要啦。
把载体和目的基因分别放到不同的小管子里，加入适量的限制性内切酶和反应缓冲液。
然后就把这些小管子放到一个小仪器里，让它们在合适的温度下反应。
这个温度就像是酶的舒适区，不同的酶有不同的舒适温度。
在这个过程中，限制性内切酶就开始发挥它的小剪刀功能啦，在载体和目的基因上特定的位置咔嚓咔嚓地剪开。
这就像是给载体和目的基因做了一个小手术，让它们有合适的接口可以连接。
三、处理酶切产物。
酶切完了可不能就直接用。
得把酶切产物处理一下。
因为酶切之后可能会有一些小的片段或者残留的酶，这些东西可能会影响后续的连接反应。
这时候就像是给刚裁剪好的布料再整理整理，把那些多余的线头剪掉。
一般可以通过一些方法把残留的酶去掉，让酶切产物变得干干净净、利利索索的。
四、连接反应。
处理好的载体和目的基因就可以开始连接啦。
把它们放到一个管子里，加入连接酶和反应缓冲液。
然后又把这个小管子放到合适的温度下。
连接酶就开始工作啦，它把载体和目的基因的切口连接起来。
这就像是把裁剪好的布料缝成一件漂亮的衣服。
经过这个过程，一个新的带有目的基因的载体就构建好啦。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
载体构建流程pp课件
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
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回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
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连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
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酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
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挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
载体构建质粒构建步骤有哪些？
载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。
9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。
⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。
2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。
限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。
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载体构建流程
1．基因的获得
酶切回收
2．回收
A．酶切回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
B．PCR回收：一般做总体系为100-200ul的PCR量（用高保真酶：如PFU酶、KOD PLUS 酶），分成约50ul/管，然后上PCR仪。
跑电泳回收，约30ul。
酶切回收，做100ul体系，直接过回收柱回收DNA片段。
3．连接
连接体系总量一般为10-20ul。
12℃-16℃过夜。
4．转化
一般转化DH5α感受态，10-15ul 连接液转化到50ul感受态中。
冰浴1h 热休克42℃ 90 秒
冰浴5分钟加200ul LB液，37℃振摇1 h
铺相应抗性的平板。
置37℃孵箱，培养12h.
5．挑克隆
从平板上挑取数个克隆，于相应抗性的LB中，37℃培养12h.
6．抽提质粒
手工抽提质粒，一般溶于30ulTE或EB。
7．鉴定
A．酶切鉴定：一般用什么酶装上的，就用什么酶鉴定。
但原则是选用相对便
宜的酶。
选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位
点共同鉴定。
一般鉴定选择2-4组酶，来确定构建的载体是否正确。
B．PCR鉴定：一般扩增目的条带。
也可扩增载体和目的条带连接处的片段。