实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
逆转录RT-PCR实验操作方法
逆转录RT-PCR实验操作方法RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
以RNA为模板，首先在依赖于RNA的DNA聚合酶的催化作用下体外合成cDNA的第一条链，以此条cDNA 链为模板，又可继续进行PCR。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，要得到理想的结果，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
而确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染，关键是要做好实验前的准备，注意实验操作的一些细节。
1.实验前的准备1.1实验器具的准备：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用进口的，因为进口EP管、移液器吸嘴已经去除了RNasin，也已经灭菌处理过，可以直接用。
实验前用干净的镊子夹取出EP管、移液器吸嘴插好备用，注意镊子不要碰到EP管内壁和吸嘴的尖部。
如果用国产500μl和200μlEP管和移液器吸嘴，则要提前配制0.05%——0.1%的DEPC水，将EP管、移液器吸嘴和吸嘴盒都浸泡在DEPC水中过夜后再用蒸馏水反复冲洗掉粘附的DEPC，再高压灭菌后60℃烤干备用。
注意DEPC有毒，在配制及使用时应在通风橱进行，应全程带手套、口罩。
1.2试剂的准备：做RT-PCR的试剂应提前确定储备量，如试剂量不能满足一次完整的RT-PCR操作，应马上订购试剂，等试剂到了以后再做。
因为RNA易降解，提取之后就应立即反转录，或在-80℃冰箱中保存，但是反复冻溶也容易使RNA降解，所以一旦RNA提取或溶解就应立即进行反转录。
RT-PCR的试剂都应在冰上溶解。
1.3仪器：高速冷冻离心机、PCR仪、核酸检测仪、凝胶成相系统都应提前检查是否处于正常状态。
特别是PCR仪对环境温度有要求时，应提前保证环境温度。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
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实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA（complement DNA）合成（即RNA的反转录（RT，reversetranscription）），同cDNA 的PCR结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理（图4.1）。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成 cDNA，即总RNA中的mRNA在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择（表4.1) 。
用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。
在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。
而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。
还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。
对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。
由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。
引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。
这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。
为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。
随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。
因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。
它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。
因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。
因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。
建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。
oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。
基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。
GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。
用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。
GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。
已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当的接头(Linker)，接头可以是在PCR引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经PCR扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。
本实验是要从小鼠肝脏组织中获取Fas配体基因，Fas配体(FasL)是一分子量约为40u的II 型跨膜糖蛋白，属TNF家族成员。
活化的T细胞可表达Fas和FasL，并通过Fas/FasL系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。
近年研究发现在部分癌细胞中FasL表达增强，并与肿瘤的复发转移有关。
我们采用RT-PCR方法克隆FasL全长cDNA并构建其表达载体，可以为进一步研究FasL 的功能提供条件。
在上下游引物的5’端分别加上了限制酶切位点及其保护碱基（即Hind III和BamH I），以便可以通过双酶切将目的片段定向的克隆到原核表达载体pGFPUv上（附录图4.3）。
为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白，我们改造了pGFPUv，在其上加了6×His标签。
【试剂与器材】（一）试剂1.总RNA（或mRNA）2.RNA酶抑制蛋白（RNase Inhibitor）：40 U/mL3.dNTP 混合物 (各10 mM)4.oligo(dT)12-18：2.5 mol/L5.10*逆转录合成缓冲液（10RT buffer）：250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl26.AMV逆转录酶 5u/L7.基因特异性5’和3’引物各20 mol/L8.Tap DNA聚合酶 5u/L9.10*PCR缓冲液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris•Cl，在25℃下，pH9.0，1.0% Triton X-100，15mmol/L MgCl2。
（二）器材1）PCR仪，2）PCR管，3）微量移液器【操作方法】（一）逆转录：1)建立RT反应体系：2)涡旋混匀，42℃反应1小时，95℃加热5分钟，然后置于冰上。
（二）PCR扩增：1)建立PCR反应体系：2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环：step2-4运行30个循环，其中复性温度主要依据引物的不同而不同。
（三）取10-20uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，余下的PCR产物-20℃保存。
【注意事项与提示】1.逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。
2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。
使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。
因此在进行PCR 反应时应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA 还是cDNA。
在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。
3.RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA，都可以检测到扩增结果（如下图）。
另外，分离mRNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。
然而，当分析稀有基因时，使用mRNA会增加检测的灵敏度。
4.在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的长度和产量。
RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。
RNA酶抑制蛋白仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。
5.较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。
对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。
然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。
对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，如：Invitrogen 公司的ThermoScript逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。
而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR的特异性。
6.建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。
7.PCR反应的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。
复性温度的计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm =2（A+T）+4（G+C）。
适当提高复性温度可提高PCR 扩增的特异性。
8.不管是反转录反应还是PCR反应都应先调制试剂的Master Mix (包括RNase Free dH2O、缓冲液、dNTP Mixture等)，然后分装到每个反应管中。
这样可使所取的试剂的体积更准确，减少试剂的损失，避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作造成的误差。
而且分装试剂时务必用新Tip，以防止样品间的污染。
9.AMV、RNase Inhibitor、Taq等酶类，要轻轻地混匀，避免起泡。
分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因其粘度高，所以要慢慢地分取。
酶类务必在实验前从-20℃取出，使用后立即放回-20℃保存。
10.最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先做Control反应，以确定最佳的PCR条件。
为延长PCR仪的使用寿命，应尽可能缩短PCR仪4℃保存的时间，尽量避免4℃过夜的情况。
Lane 1：总RNA 的 RT-PCR 产物（人细胞调亡因子TF15基因）Lane 2： mRNA 的 RT-PCR 产物，人细胞调亡因子TF15基因Lane 3： 100bp marker【实验安排】1．第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1%DEPC浸泡或高温干烤）。
2．第二天：进行（一）逆转录和（二）PCR扩增。
3．第三天：进行（三）琼脂糖凝胶电泳检测。
4．为了保证实验质量，最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。