酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
碱性磷酸酶km值的测定实验报告
碱性磷酸酶km值的测定实验报告篇一:碱性磷酸酶Km值得测定(1)碱性磷酸酶Km值得测定原理在适宜条件下，酶促反应的初速度随底物浓度【S】增大而增大，当底物浓度达一定时则反应趋于稳定，反应速度最大。
关系可用米氏方程表示Km是酶的特征性常数。
将米氏方程变形为双倒数方程对1/S作图可算出Km步骤，以1/V结果由y=+算出当y=0时x=，继而算出Km值=L讨论计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。
1实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。
尿蛋白定性检测原理加热可以使蛋白质变性，溶液pH等于pI时溶解度最小。
步骤1.取大试管一支，加入5ml澄清尿液。
2.用试管夹持试管上端，酒精灯加热尿液斜面至沸。
3.滴加5%乙酸2~3滴于尿液表面，轻轻混匀局部，加热。
结果未加热部分是澄清，加热部分浑浊明显讨论正常尿液中不会出现浑浊，本实验尿液加入了蛋白质。
尿液中如果出现沉淀则说明出现了病症。
分子筛层析(凝胶过滤法)原理多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应，使不同分子分离。
大分子先出，小分子后出。
步骤1.取5~8滴4mg/ml蓝色葡萄聚糖液和4滴2mg/ml重铬酸钾液混匀。
2.将层析柱出水口打开，缓放柱内液体至凝胶柱表面加入2混匀的待层析液。
3.从上口缓加蒸馏水，成2~3cm高水柱，出水口用小试管接水。
4.在上口加洗脱液洗脱。
每支小试管接1cm液体，并编号。
5.观察不同小试管的液体颜色的变化。
结果讨论分子筛层析能够大致的分离分子量不同的物质，但是分离的物质不纯有杂质，实验时间也相对较长，操作复杂。
篇二:碱性磷酸酶的Km测定篇三:酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)本科学生实验报告学号 0姓名孙永升学院实验课程名称酶工程 < 实验 >教师及职称开课学期至学年填报时间年月日云南师范大学教务处编印13234km操作流程:A稀释:原酶液底物B预热 : 各预热10minC取液 :稀释到10000倍的纤维素酶液不同浓度的底物溶液D反应50 水浴中保温30minF 测定3mLDNS反应终止沸水浴5min 定容至25ml 测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
实验五 固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定
实验五固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定一、目的了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。
二、原理纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。
在碱性、煮沸条件下，3，5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。
通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。
以此代表纤维素酶的酶活力。
酶活定义以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。
三、试剂和溶液(一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
1 DNS试剂称取3，5一二硝基水杨酸(10士0. 1)g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至I 000mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
2柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g，溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000 mL。
调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。
注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g，溶于约750 ml，水中，加入乙酸2.31 ml，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.810.05)备用3葡萄糖标准贮备溶液（4mg/ml）同实验四上述系列浓度应根据需要自行调整。
.5快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。
(二) 仪器除普通实验室仪器外，还应有:1分光光度计2酸度计精度10.01 pH 3恒温水浴(50士0.l)0C4分析天平感量0.1 mg 5磁力搅拌器6秒表或定时钟7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成) 8具塞刻度试管25 mL四、操作步骤4.1绘制标准曲线按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。
酶工程实习报告
实习报告实习单位：XX生物科技有限公司实习时间：2021年6月1日至2021年8月31日实习内容：酶工程一、实习背景及目的作为一名生物技术专业的学生，我一直对酶工程领域充满兴趣。
酶工程是一门应用生物化学、微生物学和分子生物学等知识，通过现代生物技术手段对酶进行改造和应用的学科。
本次实习旨在让我深入了解酶工程的基本原理、技术方法和实际应用，提高我的实践能力和创新能力。
二、实习内容及心得1. 酶的筛选与改造在实习过程中，我参与了酶的筛选与改造项目。
首先，我们通过文献调研和实验室现有资源，选择了适合目标反应的酶。
然后，利用PCR技术对酶的基因进行克隆，并通过基因编辑技术对酶的氨基酸序列进行改造，以提高其催化活性和稳定性。
此外，我还学会了使用各种生物信息学工具对酶的三维结构进行预测和分析，为酶的改造提供理论依据。
2. 酶的表达与纯化在酶的筛选与改造过程中，我了解了酶的表达与纯化技术。
我们选用大肠杆菌作为宿主细胞，通过优化表达载体和培养条件，实现了酶的高效表达。
然后，采用凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等方法对酶进行纯化，以获得高纯度的酶制剂。
在此过程中，我掌握了各种层析技术的原理和操作技巧，并学会了使用相关设备进行实验操作。
3. 酶的应用与评价在酶的应用与评价方面，我参与了多个实际项目的研发。
例如，我们将筛选到的酶应用于生物制药、食品加工和环境保护等领域，评估其催化效果和实用性。
此外，我还参与了酶的动力学实验，通过测定酶的米氏常数（Km）和最大催化速率（Vmax），评估酶的催化性能。
这些实验让我深刻认识到酶在实际应用中的重要性和潜力。
4. 实习收获通过本次实习，我不仅掌握了酶工程的基本原理和技术方法，还提高了自己的实践能力和创新能力。
在实习过程中，我学会了查阅文献、分析实验数据和撰写实验报告。
同时，与导师和同事们的交流与合作，使我更加熟悉了实验室的运作方式和团队协作的重要性。
总之，本次实习让我在酶工程领域取得了丰硕的成果，为今后的学术研究和职业生涯奠定了基础。
【米氏常数】 米氏常数测定实验的报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验的报告.docx米氏常数是一个经验参数，它是用于测量基质和溶质之间相互作用的重要参数。
米氏常数的测定涉及到溶质和基质的相互作用，主要是通过溶解度进行测定。
下面就是本实验的报告。
实验背景米氏常数是用来描述溶质在溶液中浓度度量的非线性关系的参数。
米氏方程如下：Ksp = [A+]^m [B-]^n其中Ksp是溶解度积常数，[A+]和[B-]分别表示电离度为1的正离子和负离子的浓度，m和n分别为正离子和负离子在配位物中的摩尔数。
溶解度积（或离解平衡常数）是可以直接从溶解度数据中获得的参数，这些参数是根据溶解度测量推导出来的，通常采用天平法或者滴定法进行测量。
实验目的本实验的目的是测定铅酸盐的米氏常数，用溶解度法测定铅酸盐的溶度积常数，并根据米氏方程计算米氏常数。
实验原理铅酸盐在水溶液中的离解方程式：PbSO4(s) ⇆ Pb2+(aq) + SO42-(aq)溶解度积常数是根据溶解度求出的：对于低溶度度超取6.5，我们软件系统一压根对孔直接忽略其离子反应方程中的y。
实验流程1. 准备1 L的稀铅酸溶液（2 × 10-5 mol/L）2. 取0.2 mL的稀铅酸热解，目测重量大概是0.03 g左右。
3. 将稀铅酸加入100 mL的无铅纯水溶液中，然后调整pH值，使稀铅酸与水达到最大的平衡浓度。
4. 记录溶解度数值，并计算铅酸盐的溶解度积常数。
实验结果1. 初始重量为0.03 g的铅酸盐溶解后，其溶解度为5.5 × 10-5 mol/L。
2. 根据铅酸盐的溶解度计算溶解度积常数Ksp为3.025 × 10-9。
3. 根据米氏方程Ksp = [Pb2+][SO42-]，计算出米氏常数为1.79。
km测定实验报告
km测定实验报告KM测定实验报告引言：KM测定是一种常用的酶动力学实验方法，用于测定酶的催化活性。
本实验旨在通过对酶催化反应速率的测定，探索KM值对酶活性的影响，并深入理解酶催化过程的基本原理。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 酶溶液：选择一种适合的酶作为实验对象，如过氧化氢酶。
- 底物溶液：选择一种合适的底物，如过氧化氢。
- 缓冲液：根据实验需要选择适当的缓冲液，如磷酸盐缓冲液。
- 辅助试剂：如辅酶、金属离子等。
- 试剂盒：包括所需的试管、移液管、离心管等。
2. 实验方法：- 步骤一：制备酶溶液。
按照实验要求，将酶粉末溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的酶溶液。
- 步骤二：制备底物溶液。
按照实验要求，将底物溶解于适量的缓冲液中，制备所需浓度的底物溶液。
- 步骤三：实验组设置。
根据实验要求，设置不同浓度的底物溶液，配制不同的实验组。
- 步骤四：开始实验。
将实验组中的底物溶液分别加入试管中，并在恒温条件下加入相应浓度的酶溶液，开始反应。
- 步骤五：反应停止。
根据实验要求，选择适当方法停止反应，如加入某种试剂或调整pH值。
- 步骤六：测定反应产物。
使用合适的测定方法，如分光光度法或比色法，测定反应产物的浓度。
- 步骤七：数据处理。
根据实验结果，计算不同实验组的反应速率，并绘制相关曲线。
实验结果与讨论：通过实验，我们得到了不同浓度底物溶液在酶催化下的反应速率数据，并绘制了相关的酶动力学曲线。
根据实验结果，我们可以得出以下结论：1. KM值的影响：- KM值是酶底物结合的亲和力指标，表示酶与底物结合的紧密程度。
KM值越小，表示酶与底物结合越紧密，酶对底物的亲和力越高。
- 实验结果显示，随着底物浓度的增加，反应速率逐渐增加，但增速逐渐减缓。
当底物浓度接近KM值时，反应速率趋于饱和，增速几乎为零。
- 这表明KM值对酶催化速率有重要影响，较小的KM值意味着酶对底物的亲和力更高，反应速率更快。
2. 酶活性与酶浓度的关系：- 实验结果还显示，随着酶浓度的增加，反应速率也随之增加。
米氏常数测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。
2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。
3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。
二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。
在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。
当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。
本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。
实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。
三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。
2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。
3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。
b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。
c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。
d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。
4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。
b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告背景酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率。
酶的活性常常通过测定其米氏常数来评估，米氏常数也被称为酶的催化效能常数。
米氏常数能够反映出酶与底物之间的亲和力以及酶对底物的催化速率。
米氏常数（Km）表示在酶浓度不变的情况下，酶对底物的亲和力。
它是底物浓度达到一半时的酶活性的浓度。
Km值越小，说明酶与底物结合的亲和力越大，反之亦然。
在本次实验中，我们选择使用酸性磷酸酯酶作为模型酶，它催化对硫酸酚酸酯的水解反应。
通过测定酶的活性随底物浓度变化的情况，来确定酶的米氏常数。
实验设计实验材料•酸性磷酸酯酶提取物•磷酸二氢钠溶液•氯化亚铁(III)溶液•硫酸酚酸酯溶液•无水醋酸溶液•pH 7缓冲溶液实验步骤1.准备一系列不同浓度的硫酸酚酸酯溶液（如0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM等），并标记每个溶液的浓度。
2.分别向多个试管中加入相同体积的pH 7缓冲溶液、酸性磷酸酯酶提取物和不同浓度的硫酸酚酸酯溶液，混合均匀。
3.将试管放入恒温水浴中，保持温度稳定。
4.在0、5、10、15等不同时间点，取出一部分反应液，立即加入冰冷的无水醋酸溶液停止反应。
5.加入氯化亚铁(III)溶液以生成可检测的产物。
6.使用分光光度计测定反应液的吸光度，根据吸光度与产物浓度的线性关系，得到各个时间点的反应速率。
7.根据浓度和时间的关系，绘制酶活性随底物浓度变化的图谱。
8.根据实验数据，计算出酶的米氏常数。
分析通过实验数据的收集和处理，我们得到了酶活性随底物浓度变化的曲线图。
根据实验结果，我们可以进行如下分析：1.绘制酶活性随底物浓度变化的图谱，可以观察到反应速率随着底物浓度的增加而增加，但当底物浓度达到一定水平时，反应速率趋于饱和，不再显著增加。
这可能是由于酶与底物结合的位点有限，或者由于酶的饱和度导致的。
2.根据实验数据，我们可以使用米氏方程来计算酶的米氏常数。
米氏方程可以表示为：其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率，[S]是底物浓度，Km是米氏常数。
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v = Km + [S ]
v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)
V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)
[S]：底物浓度（mol/L)
Km：米氏常数（mol/L)
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
3.4 双倒数作图法测定Km值：
1 Km 1 1
v V [S] V
1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。
若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。
本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。
再根据林贝法作图求出Km值。
3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其
3mLDNS反应终止→
沸水浴5min →
定容至25ml→
测定OD540吸光值
G 作双倒数图求Km
4.3 实验注意事项
本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。
严格控制准确的酶促反应时间。
反应温度准确，酶液准确稀释。
不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释
试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。
6、分析与讨论：
米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。
Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。
因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。
有的酶可作用于几种底物，因此就有几个Km 值，其中Km 值最小的底物就是该酶的最适底物也就是天然底物，最适底物对酶的亲和力最大。
Km 值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并且有助于研究酶的活性中心部位。
本次实验中测定结果误差较大，结果不可靠。
因此作图中只选取了其中三个连续变
化的点，若用10个测定结果作图后线性关系非：y=kx+b 的直线方程型[3]。
徐桦（1999）,等对酵母蔗糖酶Km值的测定采用6个稀释浓度的底物结果如图二：作图
求Km和本次实验相同, 相比较一次函数线性关系比较好，结果更准
确。
图二酵母蔗糖酶的Km 值
图二 7、实验小结：
掌握纤维素酶Km测定方法，意义。
稀释底物做到准确，量取固体酶液时精确，溶解稀释做到准确无误，减少实验操作
误差，增加结果可信度。
测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。
改进：为使结果准确，可信尽可能减少操作人为的、系统的不必要误差做到：每个小组做实验中尽可能完成1～10各个浓度准确，这样可以减少由于每组测定结
果的差异，使最后做双倒数图时线性程度高。
Km更可靠。
8、实验思考题：
Km值意义?
答：Km是酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。
9、参考文献：
[1] 罗侃, 崔有宏,王绪明. 脉酶Km值的比色测定法及其评价[J]. 兰后卫生, 1995, 1(16):1~4.
[2] 徐桦, 陆珊华, 孙爱民. 酵母蔗糖酶Km值的测定[J]. 南京医科大学学报, 1999,4(19):329~330.
[3] 李彦华. 对米氏常数求法的一点补充[J]. 辽宁工程技术大学学报, 2006, 6(25):335~336.
指导老师评语及得分：。