酶工程实验一的标准曲线
酶工程实验
实验一淀粉酶的提取及活力测定一、实验目的淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。
水稻萌发时淀粉酶活性最强。
水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。
本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定，学习和掌握淀粉酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。
二、原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。
以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。
如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
三、实验材料、仪器及试剂1．仪器：20ml具塞试管移液管 100ml容量瓶石英砂研钵721型分光光度计离心机恒温水箱离心管2．试剂：（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。
（临用时配制）（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。
实验材料：萌发水稻种子。
四、实验方法1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。
高中生物必修1优质课件 微专题二 关于酶的实验设计及曲线分析
3.底物浓度影响酶促反应速率曲线的分析
(1)底物浓度较低时，酶促反应速率与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而加快。 (2)当所有的酶都与底物结合后，再增加底物浓度，酶促反应速率不再加快。
4.酶浓度影响酶促反应速率曲线的分析
在有足够底物且不受其他因素影响的情况下，酶促反应速率与酶浓度成正比。 5.温度和pH共同作用对酶活性的影响
实
二 在冰水中水浴5 min 在60 ℃温水中水浴5 min 在沸水中水浴5 min
验
1与1′试管内液体混 2与2′试管内液体混合，3与3′试管内液体混合，
步三
合，摇匀
摇匀
摇匀
骤
四 在冰水中水浴数分钟 在60 ℃温水中水浴数分钟 在沸水中水浴数分钟
五
取出试管，分别滴加2滴碘液，摇匀，观察现象
实验现象
呈蓝色
无蓝色出现
呈蓝色
结论 酶发挥催化作用需要适宜的温度条件，温度过高或过低都会影响酶活性
(2)探究pH对酶活性的影响 ①实验原理：H2O2 —过—氧—化—氢—酶→ H2O＋O2。 ②实验步骤
实验步骤
实验操作内容
试管1
试管2
试管3
一 注入等量过氧化氢酶溶液
2滴
2滴
2滴
二
注入不同pH的溶液 1 mL蒸馏水 1 mL盐酸 1 mL NaOH溶液
例2 取经过编号的5支试管分别加入2 mL物质的量浓度为0.5 mol/L的过氧化氢溶液， 进行如下实验，根据实验内容，下列说法正确的是
试管编号
1
2
3
4
5
加入物质 适量唾液 锈铁钉 生土豆块 熟土豆块 生土豆块＋稀盐酸
实验结果 几乎无气泡 少量气泡 大量气泡 几乎无气泡 几乎无气泡
酶标仪标准曲线制作方法
酶标仪标准曲线制作方法
酶标仪标准曲线制作方法一般包括以下步骤：
1. 准备标准品溶液：选择适当的标准品（纯品或已知浓度的样品），按需稀释至一系列浓度的标准品溶液。
2. 准备反应试剂：根据实验需要，准备好酶底物、缓冲液和辅助试剂等反应试剂。
3. 操作酶标仪：打开酶标仪，设置光学路径和读取波长等参数，并进行预热和校准。
4. 建立曲线浓度组：按照实验要求和标准品的浓度，制定一系列浓度的曲线浓度组。
5. 加样：将标准品溶液和待测样品分别加入酶标板中的相应孔位。
6. 加入反应试剂：根据实验要求和试剂添加顺序，逐孔加入酶底物、缓冲液、辅助试剂等反应试剂。
注意控制反应液体积，并且在同一时间内添加相同试剂。
7. 反应：按照实验要求记录反应时间，并确保所有孔位具有相同的反应时间。
8. 停止反应：根据实验要求，在特定时间点上加入停止剂，停止反应。
9. 读取吸光度：将酶标板插入酶标仪，选择正确的读取波长，并读取各孔位的吸光度值。
10. 绘制标准曲线：将吸光度值绘制在纵坐标上，将标准品浓
度绘制在横坐标上，利用数据处理软件绘制标准曲线。
可以使用线性回归或其他拟合方法拟合吸光度和浓度之间的关系。
11. 分析和计算：根据标准曲线，通过读取各孔位的吸光度值，并利用标准曲线来计算待测样品的浓度或活性等参数。
这种方法通常用于酶标仪检测酶活性、浓度或其他相关分析。
具体操作步骤可能会根据实验的目的和要求有所变化，因此需要结合具体实验方案来进行操作。
酶分析方法(分光光度法)
SOD、CAT，SP ，GST& MDA测定标准(4ml检测体系) ✧酶提取液：Tris-HCl-EDTA （pH 8.0）提取液，由实验室冰箱放置的母液A、B和EDTA配制而成。
✧酶测定液：Tris-HCl（pH 8.0）提取液，由实验室冰箱放置的母液A、B按比例配制而成。
[1] SP 测定（考马斯亮蓝）✓考马斯亮蓝溶液配制：0.005g考马斯亮蓝+10 mL 95%乙醇+10 mL 磷酸，蒸馏水定容200 mL✓牛血清蛋白配制：100 μg/mL，0.01g 蛋白，蒸馏水定容到100 mL。
●SP含量测定0.5mL 酶液+0.5mL水+3.0mL考马斯亮蓝，595nm测定[2] SOD测定（邻苯三酚法）✓3mM邻苯三酚配制：0.038g 定容100 mL。
●邻苯三酚自氧化速率测定：0.2mL邻苯三酚+3.6mL 测定液每30s测A325，测定4次。
●酶测定：0.2mL邻苯三酚 3.3 mL 测定液+0.5mL酶液30s测A325，测定4次。
[3] CAT测定（钼酸铵法）✓10mM钼酸铵配制: 1.236g定容100mL✓10mM H2O2: 取50μL 30% H2O2定容50mL●酶测定：O2+0.5mL计时加入钼酸铵3.3mL（终止反0.2mL H应）[3] GST测定✓3mM GSH配制,已配制好✓1mM CDNB,已配制好备案：3.6mL 测定液+0.2mL CDNB+0.2mL GSH, 340nm测定对照：3.1mL 测定液+0.5mL酶液+0.2mL CDNB, 340nm测定+0.2mL GSH, 340nm测定2min.[4] MDA测定✓5% 三氯乙酸配制100mL0.6% TBA 溶液100mL2.0mL 测定液+1.0mL 三氯乙酸+0.5mL酶液+0.5mL TBA溶液，混合于沸水中15min，532、600和450nm波长下测定。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
葡萄糖标准曲线制作 滤纸酶活力(FPA)的测定 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定
D 3酶活定义
D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。
D 3.2滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)
A 2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1
B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)
B 2.1葡萄糖标准曲线制备：
①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于( 103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,
lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。
D 3.3羧甲基纤维素酶活力( CMCA)
D 3.3.1还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。
⑥以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
D 4.3滤纸酶活力(FPA)的测定步操作流程：如表二所示：
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5实验处理
A 5实验现象、数据及观察结果
A 5.1标准曲线的测量结果：如表四：
试管编号
0
1
2
3
4
5
OD（540nm）值
—
0.0595
0.2135
0.345
0.493
B 4.2滤纸条的准备：
①将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:
②将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为(50士05)mg的滤纸条，折成M型备用。
B4.3操作步骤:
①取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，二支样品管)。实验中分为两组：pH
4.8与pH6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。
步骤7
加入0.5mL待测酶液，
沸水浴煮沸10min
沸水浴煮沸10min9
加蒸馏水定容至25mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
（注意：OD =（A+B）/ 2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）
表二
D4.4羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定操作流程:如表三所示：
XX
XX
1、实验目的
1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；
1.2学习酶活力的测定方法；
1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；
1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
A2.1滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。