非无菌药品微生物限度检查指导原则
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程
非无菌产品微生物限度检查标准操作规程1 制定目的为使QC检验人员在非无菌产品微生物限度检查工作中能规范和正确地进行检验工作，特制定本操作规程。
2 适用范围本操作规程适用于非无菌产品进行微生物限度检查。
3 职责3.1 QC负责按照本操作规程进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作；3.2 QC检验员在进行非无菌产品微生物限度检查的检验工作时出现异常现象，包括微生物计数、微生物负载、控制菌检测超标和超趋势时要向QC 主管汇报，并照《微生物检查超标、超趋势调查标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-020）配合调查；3.3 QA及管理人员负责监督其实施情况。
4 规程细则4.1 实验环境：按《微生物实验室标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-002），《化验室洁净区标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-004）。
4.2 培养基的制备：按《培养基标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-019）；微生物计数用的商品化预判培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
4.3 稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解，于121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。
4.4 微生物计数法：适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数；计数方法应进行方法适用性试验；按《微生物计数方法适应性确认》（文件编号：）。
4.4.1 供试液的制备（经计数方法适用性试验确认）4.4.1.1 取样：按《取样标准管理规程》（文件编号：SMP-QC-026）；一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml。
4.4.1.2 供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃；供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.4.1.3 水溶性供试品：取供试品，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH 7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。
9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则
9202 非无菌药品微生物限度检查指导原则为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则 1105）、 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则 1106）及非无菌药品微 生物限度标准 (通则 1101)，特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低， 甚至使药品丧失疗 效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节 中，药品生产企业应严格遵循 GMP 的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、 控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非规 定无菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料 微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原 则将对微生物限度标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。
1.非无菌药品微生物限度检查中，受控的洁净环境是指不低于 GMP 现行版要 求的 D 级洁净环境。
2. 非无菌药品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和 剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处 理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性)， 因 此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株， 而应当包括产品中可能污 染的微生物。
3.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数 计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方 法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶 液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基 适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药 品检定研究院研制及分发。
5.进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的 抑菌作用而导致微生物回收的失败， 应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液 进行方法适用性试验。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
非无菌药品微生物限度检查指导原则
非无菌药品微生物限度检查指导原则微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节，尤其对于非无菌药品而言更为重要。
本文将对非无菌药品微生物限度检查的指导原则进行详细介绍，旨在提高药品的质量安全性。
一、检验项目及标准非无菌药品微生物限度检查的主要检验项目包括总生菌数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
每一项检验项目都有相应的标准来衡量合格与否。
以下是常用的标准：1. 总生菌数：根据药典要求，大部分非无菌药品每克不得超过1000 CFU（菌落形成单位）。
2. 大肠菌群：大肠菌群是肠道中的常见菌种，其存在可能暗示有肠源性污染。
检验结果一般要求不得检出大肠菌群。
3. 霉菌和酵母菌：霉菌和酵母菌是环境中广泛存在的微生物，在非无菌药品中的存在可能引发变质，甚至导致严重的药品质量问题。
一般情况下，每克药品中不得检出霉菌和酵母菌。
二、样品的选择和采集在进行微生物限度检查前，需选择合适的样品，并采取正确的样品采集方式。
以下是一些常用的样品选择和采集方法：1. 样品选择：根据药品的特性，选择代表性的样品进行检测。
选取多个批次的不同规格的样品进行检验更有利于全面评估该药品的微生物污染水平。
2. 样品采集：在采集样品前，先进行适当的表面消毒，以避免外源性污染。
采集时应遵循严格的无菌操作，确保样品的真实性和可靠性。
常用的样品采集方法包括划线法、切割法、稀释法等。
三、检验方法和操作流程微生物限度检查需要使用一系列严格的操作流程和检验方法，以保证结果的准确性和可比性。
以下是一般的操作流程：1. 样品预处理：根据药品的特性，选择适当的预处理方法，如溶解、稀释、震荡等，以提高微生物的检出率。
2. 培养基选择：根据不同的菌种需求，选择适宜的培养基进行菌落的培养。
常用的培养基有营养琼脂平板、大肠埃希菌选择平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板等。
3. 培养条件：根据菌种的生长特性和检验项目的要求，设定适当的温度、时间和培养条件，以促进菌落的生长。
4. 菌落计数：通过目视或自动计数法，对培养基上的菌落进行计数。
非无菌药品微生物限度标准
或
cfu/10cm2）
霉菌和酵母菌总数 （cfu/g、cfu/ml 或 cfu/10cm2）
控制菌
口服给药★
固体制剂
103
液体制剂
102
不得检出大肠埃希菌（1g 或 1ml）；含脏器提取物的制剂 102 还不得检出沙门菌（10g 或 101 10ml）
口腔黏膜给药制剂
齿龈给药制剂
102
鼻用制剂
不得检出大肠埃希菌、金黄
或 cfu/10cm2）
或 cfu/10cm2）
固体口服给药制剂
不得检出大肠埃希菌（1g）；
不含豆豉、神曲 104（丸剂 3×104）
102
不得检出沙门菌（10g）；耐
等发酵原粉
胆盐革兰阴性菌应小于
含豆豉、神曲等
105
5×102不得检出大肠埃希菌（1ml）；
102
铜 绿 假 单 胞 菌 （ 1g 或
10cm2）；阴道、尿道给药制
102
剂还不得白色念珠菌、梭菌
（1g 或 10cm2）
不得检出金黄色葡萄球菌、
102
铜绿假单胞菌（1ml）；阴道、
尿道给药制剂还不得白色
102
念珠菌、梭菌（1ml）
5. 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表 3）
表 3 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准
10cm2）
化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还
不得检出沙门菌（10g 或 10ml）。
4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表 2）
表 2 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准
给药途径
需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数
控制菌
清洁验证中有关微生物限度检查的确定原则
清洁验证中有关微生物限度检查的确定原则一、2010版GMP有关清洁验证内容如下：（一）清洁操作规程通常应当进行验证。
清洁验证一般应当针对污染物、所用物料对原料药质量有最大风险的状况及工艺步骤。
（二）清洁操作规程的验证应当反映设备实际的使用情况。
如果多个原料药或中间产品共用同一设备生产，且采用同一操作规程进行清洁的，则可选择有代表性的中间产品或原料药作为清洁验证的参照物。
应当根据溶解度、难以清洁的程度以及残留物的限度来选择清洁参照物，而残留物的限度则需根据活性、毒性和稳定性确定。
（三）清洁验证方案应当详细描述需清洁的对象、清洁操作规程、选用的清洁剂、可接受限度、需监控的参数以及检验方法。
该方案还应当说明样品类型（化学或微生物）、取样位置、取样方法和样品标识。
专用生产设备且产品质量稳定的，可采用目检法确定可接受限度。
（四）取样方法包括擦拭法、淋冼法或其它方法（如直接萃取法），以对不溶性和可溶性残留物进行检验。
（五）应当采用经验证的灵敏度高的分析方法检测残留物或污染物。
每种分析方法的检测限必须足够灵敏，能检测残留物或污染物的限度标准。
应当确定分析方法可达到的回收率。
残留物的限度标准应当切实可行，并根据最有害的残留物来确定，可根据原料药的药理、毒理或生理活性来确定，也可根据原料药生产中最有害的组分来确定。
（六）对需控制热原或细菌内毒素污染水平的生产工艺，应当在设备清洁验证文件中有详细阐述。
（七）清洁操作规程经验证后应当按验证中设定的检验方法定期进行监测，保证日常生产中操作规程的有效性。
二、关于清洁验证中的微生物限度，大多数企业在做清洁验证时都不把此作为重点关注项目。
对于无菌产品，清洁验证中的微生物限度自然是必不可少的，甚至还会根据实际需要增加内毒素、热原等项目。
但是对于非无菌产品，清洁验证中的微生物限度如何来确定呢？在2010版GMP实施指南中清洁验证中是这样描述这个问题“企业制定清洁验证的微生物限度时可以考虑产品、剂型、清洁方法的特点以及环境级别等因素。
2020年版《中国药典》通则 —“非无菌药品微生物限度标准”
2020年版《中国药典》通则“非无菌药品微生物限度标准”（蓝色字体表示新增内容，红色字体表示删减内容）非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及、中药提取物及中药饮片的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的及标示无菌的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定。
2.用于手术、严重烧伤、严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定。
3.非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表 1。
表 1 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准给药途径需氧菌总数（cf u/g、cf u/m l或cf u/10c m2）霉菌和酵母菌总数（cf u/g、c fu/m l或cfu/10cm2）控制菌口服给药①固体制剂液体及半固体制剂103102102101不得检出大肠埃希菌（1g 或1ml）；含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌（10g 或10ml）口腔黏膜给药制剂齿龈给药制剂鼻用制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml 或 10cm2）耳用制剂皮肤给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g、1ml 或10cm2）呼吸道吸入给药制剂102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、或 10ml ） 阴道、尿道给药制剂102101不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌（1g 、1ml 或 10cm 2）；中药制剂还不得检出梭菌（1g 、 1ml 或 10cm 2）直肠给药 固体制剂103102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g 或 1ml ）其他局部给药制剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（1g 、1ml 或 10cm 2）注 ①化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还不得检出沙门菌（10g 或 10ml ）。
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附录×××非无菌药品微生物限度检查指导原则
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（附录×××）、
非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（附录×××）及非无菌药品
微生物限度标准(附录×××)，特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非规定无菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。
1.非无菌药品微生物限度检查中，受控的洁净环境是指不低于GMP现行版要求的D级洁净环境。
2. 非无菌药品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性)，因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
3.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法,同时,所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
5.进行微生物计数方法适用性试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,
最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是1g细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1∶10-3。
若采用允许的最高稀释级供试液进行验证试验还存在1株或多株试验菌的回收率达不到要求,那么应选择回收情况最接近要求的方法进行供试品的检测。
如某种产品对某试验菌有较强的抑菌性能，采用薄膜过滤法的回收率为40％，而采用培养基稀释法的回收率为30％，那么应选择薄膜过滤法进行该供试品的检测。
在此情况下，生产单位或研制单位应根据原辅料的微生物质量、生产工艺及产品特性进行产品的风险评估，以保证检验方法的可靠性，从而保证产品质量。
6.控制菌检查法没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。
若供试品检出疑似致病菌，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法,如细菌鉴定一般依据《伯杰氏细菌鉴定手册》。
7. 药品微生物检查过程中，如果药典规定的微生物计数方法不能对微生物在规定限度标准的水平上进行有效的计数，那么应选择经过验证的、且检测限尽可能接近其微生物限度标准的方法对样品进行检测。
8.用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法要求。
对用于创伤程度难以判断的局部给药制剂，若没有证据证明药品不存在安全性风险,那么该药品应符合无菌检查法要求。
9. 药品微生物限度标准中，药用原料、辅料及中药提取物仅规定检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。
因此，在制定其微生物限度标准时，应根据原辅料的微生物污染特性、用途、相应制剂的生产工艺及特性等因素，还需控制具有潜在危害的致病菌。
10.对于《中国药典》2010年版制剂通则项下有微生物限度要求的制剂，微生物限度为必检项目；对于只有原则性要求的制剂（如化学药品的：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂），应对其被微生物污染的风险进行评估。
在保证产品对患者安全的前提下，通过回顾性验证或在线验证积累的微生物污染数据表明每批均符合微生物限度标准的要求，那么可不进行批批检验，但必须保证每批最终产品均符合微生物限度标准规定。
上述固体制剂若因制剂本身及工艺的原因导致产品易受微生物污染，应在品种项下列出微生物限度检查项及微生物限度标准，如生化类制剂。
11.制定药品的微生物限度标准时，除了依据“非无菌药品微生物限度标准”（附录×××）外，还应综合考虑原料来源、性质、生产工艺条件、给药途径及微生物污染对患者的潜在危险等因素，提出合理安全的微生物限度标准，如特殊品种以最小包装单位规定限度标准。
必要时，某些药品为保证其疗效、稳定性及避免对患者的潜在危害性，应制定更严格的微生物限度标准，并在品种项下规定。