Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用[业界研究]
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节 来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到 治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基 因表达
CRISPR-Cs9技术用于编 辑基因
病毒载体在基因敲除中的重 要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势：Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准 的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用 病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。 基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗 效果。 目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从 而开发出更安全、更有效的疫苗。
06
未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展 前景
技术改进：随着 基因编辑技术的 不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与 病毒载体的联用 技术将得到进一 步优化提高敲除 效率和应用范围。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
Creloxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究的开题报告
Creloxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究的开题报告一、研究背景和意义转基因绒山羊是一种非常有价值的动物模型，可以用于生物医学研究、基因功能分析等方面。
然而，随着生物医学研究的发展，越来越多的功能基因被发现，需要进行进一步的研究。
这些基因的研究需要建立相应的转基因绒山羊模型，但由于现有的转基因技术都存在一定的局限性，因此需要寻找新的方法来改进这一情况。
Cre-loxP重组系统是一种高效、原理简单的基因编辑技术，具有精准、可控、快速等特点，被广泛应用于哺乳动物基因工程技术中。
利用Cre-loxP重组技术可以实现基因敲除、替换等功能，为研究基因在细胞、组织、器官、器系等不同层次的生理和病理调节机制提供了强有力的工具。
二、研究内容和方法本研究将利用Cre-loxP重组技术对绒山羊进行基因敲除，主要包括以下内容：1. 构建ploxP -neomycin-loxP质粒首先设计、合成ploxP -neomycin-loxP质粒，并纯化得到高质量的DNA。
此质粒在Cre-loxP重组系统中起到重要的作用，是实现基因敲除的关键。
2. 优化Cre-loxP重组体系Cre-loxP重组体系是实现基因敲除的基础，需要建立一个高效、稳定、可重复的体系，才能实现对绒山羊基因的准确编辑。
优化Cre-loxP 重组体系，包括传递Cre重组酶，优化重组载体构建等方面。
3. 运用Cre-loxP重组技术敲除绒山羊标记基因选定目标基因进行敲除后，将构建好的质粒ploxP -neomycin-loxP导入到绒山羊胚胎细胞中，然后通过Cre酶介导基因重组，实现对目标基因的敲除。
随后利用PCR、Western印迹和T7E1等技术验证敲除效果。
三、预期结果本研究的预期结果包括：1. 成功构建Cre-loxP重组体系，实现对绒山羊基因的敲除。
2. 验证基因敲除效果，明确目标基因在绒山羊生长发育、健康状态等方面的影响。
3. 探究Cre-loxP重组体系的优缺点，为之后的研究提供参考。
基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略
基于CRISPRCas9技术的基因敲入敲除策略一、本文概述随着生物科技的飞速发展，基因编辑技术已成为现代生物医学研究的重要工具。
其中，CRISPR-Cas9技术以其高效、精确的特性，在基因敲入敲除策略中展现出了巨大的潜力。
本文旨在全面介绍基于CRISPR-Cas9技术的基因敲入敲除策略，包括其原理、应用、优缺点以及未来的发展趋势。
通过对这一技术的深入剖析，我们期望为科研人员提供一个清晰、全面的视角，以更好地理解和应用CRISPR-Cas9技术，推动生物医学领域的研究进展。
二、CRISPR-Cas9技术的基本原理CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）技术是一种强大的基因编辑工具，它源自细菌的自然防御机制，即CRISPR系统。
这一系统允许细菌存储并记忆过去遭遇过的病毒DNA片段，以便在未来遇到相同病毒时，能够识别并切割这些病毒DNA，从而抵抗病毒感染。
CRISPR-Cas9系统通过这一机制被改造为一种精确的基因编辑工具，用于在真核细胞（如人类细胞）中进行基因敲除和敲入操作。
CRISPR-Cas9技术的基本原理可以分为三个主要步骤：目标识别、DNA切割和修复。
一个由RNA和Cas9蛋白组成的复合物被设计用来识别特定的DNA序列。
这个RNA分子，通常被称为单链导向RNA（sgRNA），能够与Cas9蛋白结合，并指导Cas9蛋白在目标DNA序列上定位。
sgRNA的设计是关键，它必须能够准确地与目标DNA序列配对，以确保Cas9蛋白能够在正确的位置进行切割。
一旦Cas9蛋白在目标DNA序列上定位，它就会切割DNA双链，产生一个双链断裂（DSB）。
细胞对DSB的修复机制有两种主要方式：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
NHEJ是一种错误易发的修复方式，它通常会导致DNA序列的插入、删除或替换，从而导致基因功能的丧失，这种机制常被用于基因敲除。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
CreLoxP重组酶系统专题知识
3.Cre重组酶介导两个LoxP位点间旳重组过程
• 假如两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间旳序 列；假如两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能造成两个LoxP位点间旳序 列倒位。
• 假如两个LoxP位点分别位于两条不同旳DNA或染色体上，Cre酶能 介导两条DNA链旳互换或染色体易位。
• 新霉素抗性基因 (neo) 和单纯疱疹病毒旳胸腺嘧啶激酶基因 (HSV-tK ) 为正负选择 (positive and negative selection) 系统，是筛选和富集同源重组细胞广泛应用旳措施；该措施虽然使 基因打靶技术可合用于任何外源目旳基因，但也有一种严重旳缺陷，即发生同源重组旳细 胞基因组中总留有外源旳选择标识(neo) 基因；该基因可能影响相邻基因旳体现，不利于对 突变表型旳精确分析。
病毒依赖旳Cre-loxp系统旳优点
• 更强旳区域特异性：因为病毒能够经过局部注射旳方式确保区域特异性感染，再加上驱动 Cre基因旳特异性开启子，能够实现更强旳区域和细胞特异性旳基因重组。
• 更少旳花费：购置转基因动物旳费用一般是比较昂贵旳，而且转基因动物旳喂养、基因型 鉴定都需要不少旳人力、物力，而病毒旳制备、保存和注射所花旳费用相对来说是比较少 旳。
老式基因敲除技术旳缺陷
• knockout 小鼠旳全部细胞基因组上都存在基因旳缺失／突变 ，往往引起严重旳发育缺陷或 胎儿死亡，不利于在发育后期阶段基因功能旳分析。
• 虽然发育完整旳突变体小鼠，对于 knockout 表型旳解释常遇到两个困难问题：一是全部体 细胞基因旳剔除，极难将异常旳表型归于哪一类细胞或组织；二是极难排除在成熟动物上 因为发育缺陷所引起旳异常表型。
0425-cre-loxp、crispr-cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
2.1 CRISPR-Cas9技术
2.2 CRISPR-Cas9系统
DNA、RNA和蛋白质聚合物
2.3 CRISPR-Cas9技术
2.4 CRISPR-Cas9技术
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理 CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而TALEN和 到一个可用位点；
1.1 Cre-loxP技术基本原
1.2 Cre-loxP技术应用
1.2 Cre-loxP技术应用—
与组织特异性启动子结合应用，
启动子
albumin insulin adipose protein 2
1.2 Cre-合应用，对
启动子
Mx1 CMV-tTA
4 组合应用示例——Cr
4.1 Cre-loxP与病毒工具
“条件性基因激活”模式
4.1 Cre-loxP与病毒工具
4.2 Cas9系统与病毒工具
4.2 Cas9系统与病毒工具
4.3 Cre-loxP、CRISPR-C
Cre-dependent Cas9 mice
思考
阐述Cre-LoxP技术的基本 CRISPR-Cas9技术与ZFN
诱导物
IFN tetracycl
1.3 Cre-loxP技术仍有不
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因 代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极 费用也比较高。
新3代基因组编辑工具
均由自然界存在的核酸酶系统 均具有识别核酸碱基特异性的 作用机制：均通过在细胞基因
Cre-loxP、CRI 与病毒载体在基因
Content
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Ca
《2024年利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》范文
《利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系》篇一一、引言在生物学研究中，基因敲除是一种重要的技术手段，能够精确地操控特定基因的表达，进而研究基因在生物体中的功能。
近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是CRISPR-Cas9系统的广泛应用，基因敲除技术得到了极大的推进。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统构建DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的方法和步骤，为进一步研究DUSP9基因的功能提供技术支持。
二、CRISPR-Cas9系统简介CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，具有高效、精确的基因编辑能力。
该系统通过设计特定的RNA 引导序列与Cas9蛋白结合，形成复合物，识别并切割靶点DNA 序列，从而实现基因的敲入、敲除或替换等操作。
三、DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系的构建1. 靶点设计：首先需要确定DUSP9基因的敲除靶点，设计相应的sgRNA和Cas9蛋白序列。
通过分析DUSP9基因的序列，找到合适的位置作为靶点。
2. 胚胎干细胞系的获取：选取适合的小鼠胚胎干细胞系，确保其处于稳定的生长状态。
3. CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑：将设计好的sgRNA和Cas9蛋白通过特定的方式（如质粒转染、病毒载体等）引入小鼠胚胎干细胞中。
在细胞内，sgRNA和Cas9蛋白形成复合物，识别并切割DUSP9基因的靶点。
4. 克隆筛选和鉴定：经过一段时间的培养和筛选，挑选出发生基因突变的小鼠胚胎干细胞克隆。
通过PCR、测序等分子生物学手段，鉴定克隆中DUSP9基因的敲除情况。
5. 细胞系建立：将鉴定成功的DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞进行传代培养，建立稳定的细胞系。
四、实验结果与讨论通过上述步骤，我们成功构建了DUSP9基因敲除小鼠胚胎干细胞系。
在实验过程中，我们观察到CRISPR-Cas9系统对DUSP9基因的切割效率较高，成功获得了多株基因敲除克隆。
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启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
专业倾力
1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
10
专业倾力
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替
11
代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、 费用也比较高。
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
专业倾力
新3代基因组编辑工具
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均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
19
专业倾力
3.2 病毒载体应用
20 组成型启动子-感染特性决定表达分布
专业倾力
3.2 病毒载体应用
21 特异性启动子-空间和时间精细表达
专业倾力
4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合
22
专业倾力
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
23
“条件性基因激活”模式
专业倾力
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对 Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的 染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白， 从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；
3. CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步 就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，因此省时省力；
Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、
环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP
的方向，如下所示： 13bp
8bp
13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT
4. Cas9载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理，
进行重组效率的检测。
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2.4 CRISPR-Cas9技术优势
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1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而 TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个 可用位点；
是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成
熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
3. Cas9载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对
表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段
连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定；
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2.3 CRISPR-Cas9技术流程
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1. 靶基因分析：明确CDS外显子部分；
2. sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要
结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确
定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果
专业倾力
1.1 Cre-loxP技术基本原理
6
专业倾力
1.2 Cre-loxP技术应用
7
专业倾力
1.2 Cre-loxP技术应用——组织特异性应用
8 与组织特异性启动子结合应用，实现Cre转基因的空间控制
启动子
albumin insulin adipose protein 2 b-lactoglobin keratin 5 muscle creatine kinase
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
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2.1 CRISPR-Cas9技术来源
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专业倾力
2.2 CRISPR-Cas9系统组成
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DNA、RNA和蛋白质聚合物
Guide RNA:
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）
通过碱基配对与 tracrRNA （trans-
activating crRNA ）结合形成
tracrRNA/crRNA 复合物。通过人
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术 与病毒载体在基因敲除中的联用
2016-04-25
2
专业倾力
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第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
专业倾力
基因操作技术一览
4专Leabharlann 倾力1. Cre-loxP技术简介
myosin protamine-1
CD19 proximal lck Wnt-1 or engrailed-2
靶组织或细胞
肝脏 胰岛b细胞 脂肪细胞
乳腺 皮肤 骨骼肌
心脏 精子 B淋巴细胞 T淋巴细胞 专业倾力神经系统
1.2 Cre-loxP技术应用——可诱导性应用
9 与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制
4. 可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则 难以实现这种效果。
5. 多种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，发挥人们预 期的功能。
专业倾力
3. 病毒载体
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专业倾力
3.1 病毒载体比较
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专业倾力
3.1 病毒载体比较
5
Cyclization recombinase
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。
Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点
间发生基因重组。