同源性分析标准操作规程
临床微生物检测的基因同源性分析
临床微生物检测的基因同源性分析医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。
目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。
近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。
细菌DNA同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。
一、质粒分型(Plasmid profile assay)：1、原理：质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。
把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。
2、实验过程：a.质粒抽提；b.0.8%琼脂糖电泳；c.EB染色、凝胶成像。
3、实验方法的评价：a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。
b.在评价那些从局限的时间和地点（如一个医院中的急性爆发）分离出来的菌株非常有效。
缺点：a.实验结果的重复性不好。
b.分辨力不高。
二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析(Restriction Endonuclease Assay REA)1、原理：限制性内切核酸酶（REA）在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。
在传统的限制性内切核酸酶分析中，人们用含有相对多的限制性位点的内切核酸酶消化细菌的DNA，这样就会得到成百上千条长度在0.5-50Kb范围内的DNA片段。
利用NCBI进行同源性一级结构分析
1首先把与比对的序列输入或导入下面的query sequence序列框中
2然后点勾选上所比对的项目与显示结果在新窗口中
3在新窗口中变出现比对的结果图，从上往下依次是Graphic Summary界面，Descriptions界面，Alignments内容界面中query是自己的序列，下面很多细红线条就是库里的同源序列了，根据此可以推测自己的编码序列的大小。
4新窗口中的比对图示下部是Descriptions界面，描述的同源序列
5如果勾选上比对出的几个序列前面的方框，然后点击Alignments Download GenPept Graphics Distance tree of results Multiple alignment等选项，分别会出
现两个序列比对结果，下载所勾选的序列，对应的蛋白序列，基因图示，进化树图像和所有勾选的序列的同源性比对结果图。
标准操作规程(SOP)——分子鉴别诊断技术
标准操作规程（SOP）——一、目的在以监测禽流感病毒为主要目标的同时，对其他重要常见呼吸道感染病毒的确诊提供重要的参考依据。
国家流感中心实验室按照规定方法对不明原因呼吸道感染病例的标本进行处理和检测，使病例标本的处理和检测得到有效的控制。
保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
二、范围适用于中国国家流感中心操作人员进行不明原因呼吸道感染病例标本的检测。
三、定义（一）分子鉴别诊断技术（Molecular Differential Diagnosis, MDD）：利用急性呼吸道感染的多重分析系统，将靶序列富集多重PCR（Target enriched multiplex PCR，Tem-PCR）和Multiple Analysis Profiling（xMAP）技术有机结合，能鉴别诊断禽流感及流感等重要呼吸道病毒，包括呼吸道合胞病毒、流感甲型、流感乙型、副流感Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型、腺病毒Ⅳ、Ⅶ型，同时对感染病毒的亚型等信息进行汇报，包括人群中常见的H1， H3型和近来备受关注的H5，H7和H9型。
（二）平均荧光强度值（Mean fluorescence intensity，MFI）：杂交反应过程分子在颜色编码的微球表面进行反应，对于每一种病原体，靶序列特异的捕获探针与一组颜色编码的微球之间形成特异的共价结合。
在杂交悬浮体系中，标记的PCR 产物被结合有微球的探针捕获。
Luminex 200分析样品时，经过一套微流体系统检测装置，红色激光识别病原体，绿色激光检测杂交信号，即MFI值，根据MFI 值的强弱从而显示特定病原体的有无。
四、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行，并遵守BSL-3级实验室生物安全操作规程，参见“生物安全个人防护SOP”。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行，并遵守BSL-2级实验室生物安全操作规程，参见“生物安全个人防护SOP”。
序列的同源性比较及分子系统学和分子进化分析
分析过程（ 分析过程（三）
6.限制条件，我们限制 限制条件， 限制条件 在病毒里面找。 在病毒里面找。
7.其他选项保持默认值 其他选项保持默认值
打分矩阵
分析过程（ 分析过程（四）
8.输出格式选项保持 输出格式选项保持 默认值
9.点击开始搜索 点击开始搜索
分析过程（ 分析过程（五）
10.查询序列的一些 查询序列的一些 相关信息
Blast程序的选择 程序的选择
Blast 是一个序列相似性搜索的程序 其中包含了很多个独立的程序， 包，其中包含了很多个独立的程序， 这些程序是根据查询的对象和数据 库的不同来定义的。 库的不同来定义的。
主要的blast程序 程序 主要的
程序名 Blastn Blastp Blastx 查询序列 核酸 蛋白质 核酸 蛋白质 数据库 核酸 蛋白质 蛋白质 核酸 搜索方法 核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序 列 蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中 的序列 核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和 核酸序列 框翻译成蛋白质序列后和 蛋白质数据库中的序列逐一搜索。 蛋白质数据库中的序列逐一搜索。 蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序 列6框翻译后的蛋白质序列逐一比 框翻译后的蛋白质序列逐一比 对。 核酸序列6框翻译成蛋白质序列， 核酸序列 框翻译成蛋白质序列，再 框翻译成蛋白质序列 和核酸数据库中的核酸序列6框翻 和核酸数据库中的核酸序列 框翻 译成的蛋白质序列逐一进行比对。 译成的蛋白质序列逐一进行比对。
序列同源性分析： 序列同源性分析： 将待研究序列加入到一组与之同源， 将待研究序列加入到一组与之同源 ， 但来自不同物种的序列中进行多序 列同时比较， 列同时比较 ， 以确定该序列与其它 序列间的同源性大小。 序列间的同源性大小 。 这是理论分 析方法中最关键的一步。 析方法中最关键的一步 。 完成这一 工作必须使用多序列比较算法。 工作必须使用多序列比较算法 。 常 用的程序包有CLUSTAL等 用的程序包有 等
BioEdit及MEGA分析序列同源性简介
利用系统进化分析软件对序列进行同源性分析1.0目的1.1为了保持国际上各个耐药性实验室的高检验水准，进行分子进化分析是有很重要作用的。
它不仅可以保证流行病学目的顺利实现，而且有利于发现检测阶段可能产生的潜在的交叉污染。
1.2利用此软件进行分析所得的信息对于进行艾滋病毒在人群中传播的流行病学研究具有十分重要的意义。
1.3通过对实验室之前分析的数据与当前数据进行比较，可以发现在此前实验过程中由于标本处理不当所导致的潜在的实验室污染。
1.4对于确保得到高质量的实验结果并及时发现可能出现在实验室里的问题具有重要意义。
2.0仪器设备2.1计算机一台。
2.2Windows 95以上的操作系统。
2.3BioEdit 以及MEGA 4 分析软件。
2.3.1均为免费软件，可以从互联网上下载，在计算机上进行安装。
3.0操作过程3.1局限及要求3.1.1经过序列编辑软件拼接处理后的txt文件或fasta文件均可，例如ChromasPro软件。
3.1.2可以在MEGA上分析的分子序列或距离矩阵数据。
3.1.3Mega 4软件只能将长度相等的序列转换为MEGA输出文件，因此，任何多序列文件必须通过BioEdit软件进行对齐修剪，然后才能进入通过Mega软件转换成*.meg格式进行分析。
3.1.4该数据集的大小受限于计算机上可用的物理（RAM）和虚拟内存。
3.1.5分析的序列必须包括两个或两个以上长度相同的序列，所有序列分析之前必须用MEGA软件对齐。
3.1.6核苷酸和氨基酸序列应该用英文字母连续书写，不区分大小写。
一些特殊的特殊符号，例如表示对齐缺口，碱基缺失等的符号也可以包含在序列中。
3.1.7空格和制表符经常用于数据文件中，因此会被MEGA忽略。
ASCII字符，如（.）（- ）（？），一般都作为特殊符号来表示序列中的不同碱基，分别表示第一个序列，对齐缺口及碱基缺失。
3.1.8BioEdit 软件进行序列比对3.1.9双击BioEdit图标打开BioEdit 序列对比编辑器窗口。
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析猪2型圆环病毒（PDCoV）是一种对猪群健康产生严重影响的病毒，它引起了猪产业的巨大损失。
PCR（聚合酶链反应）是一种常用的病毒检测方法，可以快速、准确地检测出PDCoV的存在。
本文将介绍PDCoV的PCR检测方法以及对甘肃株的同源性分析。
首先，我们需要准备样品。
为了进行PDCoV的PCR检测，我们需要收集猪粪便等样品，并将其保存在适当的条件下，以确保样品中病毒的完整性和稳定性。
收集的样品应当来源于不同地点和不同时间的猪场，以保证样本的多样性。
接下来，我们需要提取样品中的病毒RNA。
病毒RNA提取是PCR检测的前提，它可以通过商业化的RNA提取试剂盒或自制方法来实现。
重点在于保证提取的RNA质量和纯度，以确保PCR反应的准确性和可靠性。
完成RNA提取后，我们可以进行PDCoV的PCR检测。
PCR反应是一种基于DNA聚合酶的体外扩增方法，可以将目标DNA的特定片段放大到可检测的浓度。
在这里，我们需要选择合适的引物和探针，以扩增并检测PDCoV的特定基因区域。
在PCR反应中，我们首先需要将提取的RNA反转录为cDNA，以便使用DNA聚合酶进行扩增。
接着，我们将cDNA与引物和探针一起放入PCR反应管中，进行PCR扩增。
PCR反应通常包含一个热启动步骤，用于激活DNA聚合酶，并一系列的循环步骤，包括变性、退火和延伸，以完成DNA片段的扩增。
扩增结束后，我们可以使用凝胶电泳等方法，检测PCR产物的存在与否。
通过凝胶电泳，我们可以观察到特定大小的PCR产物，从而确定猪样品中是否存在PDCoV。
在对PDCoV进行PCR检测后，我们可以进一步对甘肃株的同源性进行分析。
同源性分析可以帮助我们了解不同样品中PDCoV的遗传相似度，并揭示其传播途径和流行规律。
同源性分析通常使用序列比对和系统进化分析等方法。
首先，我们需要提取PDCoV阳性样品中的RNA，并通过逆转录为cDNA。
临床微生物检测的基因同源性分析方法
临床微生物检测的基因同源性分析方法临床微生物检测的基因同源性分析医院感染的流行病学研究是临床微生物学工作者的重要课题，在医院感染监测的研究中，一个很重要的问题就是如何确定感染途径和传播途径，以采取有效预防和控制措施，从而防止医院感染或者暴发流行，因此对微生物鉴定和菌株同源性分析提出了更高的要求。
目前，传统的细菌鉴定和同源性分析技术已不能很好地满足医院感染诊断和流行病学调查的需要，从型、亚型、株，甚至分子水平上去认识细菌变得愈来愈重要了。
近年来分子生物学的理论和技术在细菌感染诊断中的渗透和广泛应用，使得细菌鉴定、耐药基因的检测、分子流行病学调查变得更加准确、简洁和快速。
细菌DNA 同源性分析技术如脉冲场凝胶电泳、聚合酶链反应、DNA 探针杂交以及序列分析等方法是目前在分子水平上分析细菌的主要手段，它在鉴定细菌感染的爆发、确定院内交叉感染、感染病原菌之间的基因同源性等方面有着重要的作用，本文将对常用基因同源性分析方法的机理和过程做简要综述。
一、质粒分型(Plasmid profile assay):1、原理:质粒是可移动的染色体外元件，可以自发丢失或者被宿主稳定地获得，因此流行病学上相关的分离菌株有可能表现出不同的质粒图谱。
把质粒提取出来，进行常规的琼脂糖电泳分析，就可以知道分离菌株携带质粒的大小和数目。
2、实验过程:a.质粒抽提;b.0.8%琼脂糖电泳;c.EB染色、凝胶成像。
3、实验方法的评价: 优势:a.步骤比较简单，对实验仪器要求不高。
b.在评价那些从局限的时间和地点(如一个医院中的急性爆发)分离出来的菌株非常有效。
缺点:a.实验结果的重复性不好。
b.分辨力不高。
二、染色体DNA的限制性内切核酸酶分析(Restriction Endonuclease Assay REA)1、原理:限制性内切核酸酶(REA)在特异的核酸识别序列切割DNA，DNA被消化后，所得到的限制性片段的数目和大小是由酶的识别位点和DNA的组成共同决定的。
基因组同源性
基因组同源性
基因组同源性是指两个相比较的序列之间的匹配程度，衡量基因与基因之间的相似关系。
同源性是指在分子生物学和遗传学中，从某一共同祖先经过趋异进化而形成的不同的基因序列。
两个序列同源，也就是说明它们是同一来源，来自同一祖先。
当两条序列同源时,它们的核苷酸序列通常有显著的一致性。
同源性目前都是通过全基因组测序技术来完成的。
全基因组测序是对未知基因组序列进行个体的基因组测序。
全基因组测序技术主要包括第二代测序技术和第三代测序技术，一般能在24小时之内报告结果。
检测出的基因序列通过一定的算法和分析，和计算机库中已有的基因序列进行比较，可以得出同源性与否的判断，并计算出相似性达到的百分数。
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同源性分析标准操作规程
持有部门：检验科
制定部门：丰都县人民医院医院感染管理科执行时间： 2013年11月1日
一、同源性分析的应用
包括感染暴发的判断，感染病原菌的确定及感染源的寻找。
二、基本方法
1．细菌的表型特征分型技术(如血清型、耐药表型等)。
2．基因分型技术(如．PFGE、Rep—PCR、AFLP等)。
三、操作步骤
(一)表型分型(血清型、耐药表型)
1．标本孵育：从患者感染部位采集标本，并接种于相应培养基(培养瓶)中孵育。
2．分离菌种：分离病原菌(细菌或真菌)，并鉴定细菌(真菌)种类。
3．血清分型：如可能则对同种细菌进行血清分型，如军团菌等。
4．药敏试验：根据细菌(真菌)种类选择药敏卡(纸片)，进行药敏试验。
5．结果分析：分析血清型和药敏谱，如结果相同或药敏相差不大则提示有同源性。
(二)基因分型(PFGE)
1．菌栓制备：将细菌悬液与2％低熔点琼脂糖凝胶混合，制备菌栓。
2．细菌消化：分别用含溶菌酶和(或)蛋白酶K的裂解液对菌栓进行消化。
3．洗涤菌栓：可用无菌水反复清洗或PMSF中和多余的蛋白酶K。
4．酶切：按照各种不同限制性内切酶的说明进行酶切。
5．制胶：用PF(讵电泳凝胶模具制备：PF(逼级琼脂糖凝胶。
6．电泳：根据不同细菌酶切片段的大小选择适当的脉冲参数，进行电泳。
7．凝胶成像：胶块染色后在凝胶成像仪下成像。
8．结果分析：根据Tenover等制定的标准对凝胶图像进行分析，判断菌株之间的同源性。
四、注意事项
1．不同的分型方法，在分型能力、重复性、分辨能力、操作和成本等方面都不尽相同，可根据情况进行选择。
2．表型分型方法的分辨能力普遍比基因分型方法低，但简便、快速，适用于对感染暴发的初筛。
3．基因分型方法需要特殊实验器材，操作较繁琐且耗时，但为感染暴发同源性分析的“金标准”。
检验科要创作条件，开展该项业务。