BioEdit及MEGA分析序列同源性简介
利用系统进化分析软件对序列进行同源性分析
1.0目的
1.1为了保持国际上各个耐药性实验室的高检验水准，进行分子进化分
析是有很重要作用的。
它不仅可以保证流行病学目的顺利实现，而
且有利于发现检测阶段可能产生的潜在的交叉污染。
1.2利用此软件进行分析所得的信息对于进行艾滋病毒在人群中传播
的流行病学研究具有十分重要的意义。
1.3通过对实验室之前分析的数据与当前数据进行比较，可以发现在此
前实验过程中由于标本处理不当所导致的潜在的实验室污染。
1.4对于确保得到高质量的实验结果并及时发现可能出现在实验室里
的问题具有重要意义。
2.0仪器设备
2.1计算机一台。
2.2Windows 95以上的操作系统。
2.3BioEdit 以及MEGA 4 分析软件。
2.3.1均为免费软件，可以从互联网上下载，在计算机上进行安装。
3.0操作过程
3.1局限及要求
3.1.1经过序列编辑软件拼接处理后的txt文件或fasta文件均可，
例如ChromasPro软件。
3.1.2可以在MEGA上分析的分子序列或距离矩阵数据。
3.1.3Mega 4软件只能将长度相等的序列转换为MEGA输出文
件，因此，任何多序列文件必须通过BioEdit软件进行对齐
修剪，然后才能进入通过Mega软件转换成*.meg格式进行
分析。
3.1.4该数据集的大小受限于计算机上可用的物理（RAM）和虚
拟内存。
3.1.5分析的序列必须包括两个或两个以上长度相同的序列，所有
序列分析之前必须用MEGA软件对齐。
3.1.6核苷酸和氨基酸序列应该用英文字母连续书写，不区分大小
写。
一些特殊的特殊符号，例如表示对齐缺口，碱基缺失等
的符号也可以包含在序列中。
3.1.7空格和制表符经常用于数据文件中，因此会被MEGA忽略。
ASCII字符，如（.）（- ）（？），一般都作为特殊符号
来表示序列中的不同碱基，分别表示第一个序列，对齐缺口
及碱基缺失。
3.1.8BioEdit 软件进行序列比对
3.1.9双击BioEdit图标打开BioEdit 序列对比编辑器窗口。
3.1.10从工具栏上，单击new alignment图标打开一个新窗口。
3.1.11点击File菜单, 选择import and sequence alignment file
3.1.12出现一个新窗口, 选择要导入的文件存储地址及文件名, 点
击open. 所有需要的序列都会在导入窗口中呈现。
3.1.13点击Edit并选择Select All Sequences，现在可以准备对所
有的序列进行比对。
3.1.14点击Accessory Application并选择ClustalW Multiple
alignment ，打开一个新窗口。
3.1.15点击窗口下方的Run ClustalW，将打开一个新窗口，点
击下方的OK.
3.1.16序列比对将进行，进行的时间取决于所要比对的序列的长度
及数量。
3.1.17比对结束后，经过比对的序列将呈现在一个新窗口中。
3.1.18将模式（Mode）栏中改为edit，即可对序列进行剪切，使其
长度一致。
3.2 比对及编辑结束后，点击File并选择Save保存比对后的文件.
3.3用MEGA软件分析进行距离和系统进化分析
3.3.1双击MEGA4 图标打开MEGA
4.
3.3.2序列比对格式转换:
3.3.2.1从File菜单中, 选择Convert To Mega Format,
打开Text File Editor and Format Converter 窗口。
3.3.2.2选择屏幕中间的File and Format对话框。
3.3.2.3选择要导入的文件存储地址及文件名，点击OK，
在Text File Editor and Format Converter窗口中出
现mega 格式的文件。
3.3.2.4保存文件，关掉此页面返回MEGA
4.主界面。
3.3.3打开mega 文件
3.3.3.1从File菜单中打开mega文件, 选择open data, 或
从窗口中打开Click me to active a data file.
3.3.3.2打开文件后, Input Data 对话框将出现. 在左侧一
栏选择Nucleotide Sequences,默认右侧当前选择，点
击OK.
3.3.3.3出现一个Confirm对话框, 点击Yes.
3.3.3.4Select Genetic Code box opens被打开,通常默认所有
选项，点击OK .
3.3.3.5文件名及信息将会出现在窗口下方。
3.3.4打开Mega文件后
3.3.
4.1File 菜单中, 进行编辑, 导出或转换文件。
3.3.5Data菜单中, 可以用不同形式浏览文件，例如转换成氨基
酸形式。
3.3.6距离分析
3.3.6.1Distances菜单中, 选择Compute Pairwise. 出现
Analysis Preferences 窗口。
3.3.6.2在Distance options列表中, 选择Nucleotide:
Kimura 2-parameter for Models, 选择Distances
only for Comput, 并选择d: Transitions +
transversions for Substitutions to include.
3.3.6.3Include Sites list, 选择Complete Deletion for
Handling Gap/Missing Data, 选择1st, 2nd, 3rd for
Codon Positions/Sites Included, 点击OK.
3.3.6.4Pairwise Distances 窗口打开，在文件中将显示每两
个序列距离的矩阵。
3.3.7File菜单中, 选择Export/Print Distances,在Text File
Editor and Format Converter 窗口中将出现一个名为
Distances 的文件，它显示了所有的信息及距离矩阵，保存
后可以用记事本或写字板打开。
3.3.8进化分析
3.3.8.1Phylogeny菜单中，选择Neibour-Joining(NJ),
Analysis Preferences 框将打开。
3.3.8.2在Distance options列表中, 选择Nucleotide:
Kimura 2-parameter for Models, 选择Distances
only for Comput, 选择d: Transitions +
transversions for Substitutions to include.
3.3.8.3Include Sites list, 选择Complete Deletion for
Handling Gap/Missing Data, 选择1st, 2nd, 3rd for
Codon Positions/Sites Included.
3.3.8.4在Test of Phylogeny列表中, 选择Bootstrap for
Test of Inferred Phylogeny.
3.3.8.5屏幕的右侧将出现一个小对话框，选择1000 for
Replications, 然后点击OK, 进程框将打开。
3.3.8.6进程结束后, Tree Explorer窗口将显示两种进化
树。
同源树Original tree是我们所需要的。
3.3.8.7File菜单中, you can save the tree data as可以将所做
的树通过Save键保存成Tree Session File(*.mts), 或
者选择Export Current Tree得到Tree Data
File(*.tre)文件, 两种格式的文件都能被MEGA或其
他软件所识别。
3.3.8.8Image菜单中, 选择Copy to Clipboard, 进化树即
可被复制并粘贴到word文档或ppt文档中进一部编
辑。
3.3.9交叉污染的判断:
3.3.9.1如果有两个或者更多的序列在进化树中距离非常接
近或者两个分支有相同的结点且有相同的水平距离，
而序列之间又没什么流行病学联系, 那么这些标本
则需要从核酸提取阶段进行重复检测，以此验证它们
之间的相近关系并排除交叉污染。
3.4亚型的初步分析:
3.4.1用NCBI 基因分型工具进行亚型的初步分析。
3.4.2双击下面的网址
/projects/genotyping/formpage.cgi
3.4.3在相应位置填入序列的FASTA/GI /Accession 格式文件。
3.4.4点击亚型按钮。
3.4.5出现一个扫描窗口，如果序列是单一的亚型，记录结果，如
果是复杂的重组亚型，则需要对序列进行详细的系统进化分
析。
生物序列的同源性搜索blast简介及其应用
分析过程（三）
6.限制条件，我们限制 在病毒里面找。
7.其他选项保持默认值
打分矩阵
30
分析过程（四）
8.输出格式选项保持 默认值
9.点击开始搜索31分析过程（五）10.查询序列的一些 相关信息 在cdd库里面找到 两个保守区域， 点击可以进入
32
分析过程（六）
图形结果
33
分析过程（七）
也可以选择tblastn
作为演示， 我们这里选blastp
28
分析过程（二）
3.填入序列（copy＋paste） Fasta格式，或者纯序列 4.选择搜索区域，这里我们要 搜索整个序列，不填 5.选择搜索数据库，这里我们 选nr(非冗余的蛋白序列库)。 是否搜索保守区域数据库 （cdd），蛋白序列搜索才有。 我们选上
6
序列相似性比较和序列同源性分析
序列相似性比较： 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较， 用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似 的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列 比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；
序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种 的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序 列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。 完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包 有CLUSTAL等；
7
Blast简介（一）
BLAST 是由美国国立生物技术信息 中心（NCBI）
开发的一个基于序列相似性的数据库搜 索程序。 BLAST是“局部相似性基本查询工 具”(Basic Local Alignment Search Tool)的 缩写。
8
Blast简介（二）
MEGA_3.1分子进化遗传分析软件
分子进化分析软件MEGA 3.1的使用操作作者：Dxyer- lzf战友（山东大学生命科学学院微生物国家重点实验室）受益的话，请到下列地址给我投一票，谢谢☺/bbs/post/view?bid=73&id=5059255&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0#5059255进化树也称种系树，英文名叫“Phyligenetic tree”，主要通过蛋白质序列/核酸序列的同源性比较进而了解基因或物种进化发生的内在关系和规律。
完整的进化分析需要以下几个步骤[1]：A.了解进化树的一些基本的概念和定义；B.集合一个待分析的数据组；C.对数据组进行多重序列比对；D.比对结果的校正；E.进化树的构建:为了说明进化分析结果的真实性，往往需要对校正后的比对结果选择不同的算法、模型和程序进行进化树的构建（必要的话，可利用Gblocks：http://molevol.ibmb.csic.es/Gblocks/Gblocks.html等软件提取数据组中的保守区后再进行进化树构建）；F.树枝可信度评估：可利用bootstrap和interior-branch等测试方法；G.发表数据的优化及展示：可利用MEGA3.1软件打开多种软件所做的进化树并对其进行分枝合并、排序等优化，最后利用Photoshop、Macromedia Fireworks MX 等作图软件对图的清晰度进行优化以获得高质量的发表展示图.目前树状进化树的分析软件很多，其中MEGA 3.1（/）[2]最大的优点在于易于上手操作并可对图形进行优化展示，是分子进化分析最理想的软件之一。
但MEGA软件包中没有目前蛋白序列进化分析中推崇的“最大可能性（maximum likelyhood，ML）”和“贝叶斯推论（bayesian inferences）”这两种算法[3]。
ML算法可使用软件phyml（http://atgc.lirmm.fr/phyml/），贝叶斯分析使用软件MrBayes（/）。
生物序列的同源性搜索blast简介及其应用
序列同源性分析： 是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种 的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序 列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。 完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包 有CLUSTAL等；
生物序列的同源性搜索blast简介及其应用
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2020/11/26
生物序列的同源性搜索blast简介及其 应用
•生物信息学常见的应用与软件
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序列数据的保存格式与相关数据库资源 在数据库中进行序列相似性搜索 多序列比对 进化树构建与分子进化分析 Motif的寻找与序列的模式识别 RNA二级结构，蛋白质二、三级结构的预测 基因芯片的数据分析
核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白 质数据库中的序列逐一搜索。
蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6 框翻译后的蛋白质序列逐一比对。
核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核 酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋 白质序列逐一进行比对。
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生物序列的同源性搜索blast简介及其 应用
Blast相关的问题
结果页面（一）
•图形示意结果
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生物序列的同源性搜索blast简介及其 应用
结果页面（二）
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•目标序列描述部分
•带有genbank的链接，点击可以进入
•匹配情况，分值，e
相应的genbank序列
生物序列的同源性搜索blast值简介及其
应用
结果页面（三）
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生物序列的同源性搜索blast简介及其应用
Score：使用打分矩阵对匹配的片段进行打分，这是
对各对氨基酸残基（或碱基）打分求和的结果，一般来 说，匹配片段越长、 相似性越高则Score值越大。
E value:在相同长ห้องสมุดไป่ตู้的情况下，两个氨基酸残基（或
碱基）随机排列的序列进行打分，得到上述Score值的 概率的大小。E值越小表示随机情况下得到该Score值的 可能性越低。
详细的比对上的序列的排列情况
25
一个具体的例子（blastp）
假设以下为一未知蛋白序列
>query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTAS WFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKEL SPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATV LQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARM ASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRT ATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFG MSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDK KKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA
也可以选择tblastn
作为演示， 我们这里选blastp
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分析过程（二）
3.填入序列（copy＋paste） Fasta格式，或者纯序列 4.选择搜索区域，这里我们要 搜索整个序列，不填 5.选择搜索数据库，这里我们 选nr(非冗余的蛋白序列库)。 是否搜索保守区域数据库 （cdd），蛋白序列搜索才有。 我们选上
综合序列分析软件BioEdit中文说明书-文档资料66页PPT
ห้องสมุดไป่ตู้
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
综合序列分析软件BioEdit中文说明书 -文档资料
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
核酸序列分析软件介绍
核酸序列分析1、核酸序列检索可通过NCBI使用Entrez系统进行检索，也可用EBI的SRS服务器进行检索。
在同时检索多条序列时，可通过罗逻辑关系式按照GenBank接受号进行批量检索。
如用“AF113671 [ac] OR AF113672 [ac]”可同时检索这两条序列。
其中“[ac]”是序列接受号的描述字段。
2、核酸序列的基本分析（1）分子质量、碱基组成、碱基分布分子质量、碱基组成、碱基分布可通过一些常用软件等直接获得。
如:BioEdit（/BioEdit/bioedit.html），DNAMAN（）。
（2）序列变换进行序列分析时，经常需要对DNA序列进行各种变换，例如反向序列、互补序列、互补反向序列、显示DNA双链、转换为RNA序列等。
这些用DNAMAN软件可很容易实现，这些功能集中在Sequence→Display，从中可选择不同的序列变换方式对当前通道的序列进行转换。
（3）限制性酶切分析该方面最好的资源是限制酶数据库（Restriction Enzyme Database，REBASE）。
REBASE数据库（，/rebase）中含有限制酶的所有信息，包括甲基化酶、相应的微生物来源、识别序列位点、裂解位点、甲基化特异性、酶的商业来源及公开发表的和未发表的参考文献。
其它资源还有：WebGene：/~tjyin/WebGene/RE.html，/personal/tyin.htmlWebCutter2：http://www//firstmarkert/firstmarket/cutter/cut2.html同时，很多软件也能够识别REBASE限制酶数据库。
强烈推荐使用集成化的软件如BioEdit和DNAMAN等。
所得出的结果给出指定DNA序列的酶切位点信息，为克隆鉴定和亚克隆提供了重要信息。
在实际进行分子生物学实验中，有时需要对多条相关序列（如发生突变的一批序列）同时进行酶切分析，以便为后续的克隆鉴定提供参考。
(医学课件)mega操作过程-多序列比对、进化树
第二节 多序列比对程序及应用
Progressive Alignment Method Iterative Alignment Block-Based Alignment DNASTAR DNAMAN
12
1、Progressive Alignment Method
Clustal: Clustal，是由Feng和Doolittle于1987年提出的。 Clustal程序有许多版本
根据自己的需要选择合适的输出格式。
用ClustalW得到的多序列比对结果中，所有序列排列在一起，
并以特定的符号代表各个位点上残基的保守性，“*”号表示保 守性极高的残基位点；“.”号代表保守性略低的残基位点。
15
Progressive Alignment Method
Clustal W 使用
基础生物信息学及应用
1
内容
多序列比对 分子进化分析——系统发生树构建 核酸序列的预测与鉴定 酶切图谱制作 引物设计
2
多序列比对
3
内容：
多序列比对 多序列比对程序及应用
4
第一节、多序列比对 （Multiple sequence alignment）
概念 多序列比对的意义 多序列比对的打分函数 多序列比对的方法
/clustalw/
14
Progressive Alignment Method
ClustalW 程序
ClustalW对输入序列的格式比较灵活，可以是FASTA格式，还可
以是PIR、SWISS-PROT、GDE、Clustal、GCG/MSF、RSF等格式。 输出格式也可以选择，有ALN、GCG、PHYLIP和GDE等，用户可以
生物信息学名词解释
名词解释：Consensus sequence：共有序列，指多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列。
1、FASTA序列格式：是将DNA或者蛋白质序列表示为一个带有一些标记的核苷酸或者氨基酸字符串，大于号（>）表示一个新文件的开始，其他无特殊要求。
2、Similarity相似性：是直接的连续的数量关系，是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比列的高低。
3、genbank序列格式：是GenBank 数据库的基本信息单位，是最为广泛的生物信息学序列格式之一。
该文件格式按域划分为4个部分：第一部分包含整个记录的信息（描述符）；第二部分包含注释；第三部分是引文区，提供了这个记录的科学依据；第四部分是核苷酸序列本身，以“//”结尾。
4、模体（motif）：短的保守的多肽段，含有相同模体的蛋白质不一定是同源的，一般10-20个残基。
5、查询序列（query sequence）：也称被检索序列，用来在数据库中检索并进行相似性比较的序列。
6、打分矩阵（scoring matrix）：在相似性检索中对序列两两比对的质量评估方法。
包括基于理论（如考虑核酸和氨基酸之间的类似性）和实际进化距离（如PAM）两类方法。
7、空位（gap）：在序列比对时，由于序列长度不同，需要插入一个或几个位点以取得最佳比对结果，这样在其中一序列上产生中断现象，这些中断的位点称为空位。
8、PDB：PDB中收录了大量通过实验（X射线晶体衍射，核磁共振NMR）测定的生物大分子的三维结构，记录有原子坐标、配基的化学结构和晶体结构的描述等。
PDB数据库的访问号由一个数字和三个字母组成（如，4HHB），同时支持关键词搜索，还可以FASTA程序进行搜索。
9、Prosite：是蛋白质家族和结构域数据库，包含具有生物学意义的位点、模式、可帮助识别蛋白质家族的统计特征。
mega操作过程-多序列比对、进化树PPT幻灯片课件
信
（neighbour joining）、phylip、dist
息
学
CORRECT DIST：决定是否做距离修正。对于小的序列歧异（＜
及
10％），选择与否不会产生差异；对于大的序列歧异，需做出
应
修正。因为观察到的距离要比真实的进化距离低。
用
IGNORE GAPS：选择on，序列中的任何空位将被忽视。
Extremely slow computation.
20
Progressive Alignment Method
DbClustal:
http://igbmc.u-strasbg.fr:8080/DbClustal/dbclustal.html
基
础 Poa (Partial order alignments):
第二节 多序列比对程序及应用
基 础
Progressive Alignment Method
生
物
Iterative Alignment
信
息 学
Block-Based Alignment
及 应
DNASTAR
用
DNAMAN
12
1、Progressive Alignment Method
学
A distance matrix is built to derive a guide tree, which is
及
then used to direct a full multiple alignment using the
应
progressive approach.
用
Outperforms Clustal when aligning moderately divergent
Mega软件使用说明
Alignment 菜单 Mark/unmark site:在比对的表格中标记或者不标记一个单一位点，一次每 条序列只能被标记一个位点，不同序列间的位点你可以选择同一列的，也 可以是错开的，要根据自己的目的进行选择。选择标记后的序列可以使用 alignmarked sites 进行比对分析。 Align marked sites: 比对标记的序列，在这里如果在两个或多个序列间标 记了不在一列的位点重新比对后会出现空格 。 Unmarked all sites ：把所以标记的位点去标记； Delete gap-only site ：去掉序同是空格的一列；这在多序列比对前很有用。 Auto-fill gaps ：使用空格补齐不同长度的序列。
Sequencer 菜单：
此菜单下只有一个子菜单： edit sequencer file ，用来打开一个打开文件对话 框，此对话框可以打开一个 sequencer data file ，一旦打开，这个文件就在 trace data file viewer/editor 的对话框中展示出来。这个编辑窗口允许你查看和编辑 automatd DNA sequencer 产生的 trace data 。它可以阅读和编辑 ABI 和 Staden 格式 文件并且序列可以直接被导入到序列比对窗口或被上传到网页浏览器做 blast 搜 索。
一、启动
打开后会出现下面的页面，通过这个界面我们可以看 到有四个条目，一个是 MEGA 的使用指南；二是打开数据 文件；三是发表文章时要注明引用 MEGA；四个到达MEGA 的网站。我们可以通过使用指南熟悉 MEGA 的使用，MEGA 的使用指南详细地介绍了 MEGA的使用。
二、数据的准备
一个是可以利用已有的数据，二是可以利用 MEGA直接通过NCBI直接查找所感兴趣的序列， 或到NCBI、EMBL、DDBJ、GenBank等数据库网 站查找，并以Fasta等格式保存。