小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析
浙江农业学报ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＺｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓꎬ２０１９ꎬ３１(１):９８－１０３ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｚｊｎｙｘｂ.ｃｎ陈炫ꎬ张天烨ꎬ羊健ꎬ等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析[Ｊ].浙江农业学报ꎬ２０１９ꎬ３１(１):９８－１０３.
ＤＯＩ:１０３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００４￣１５２４２０１９０１１３
收稿日期:２０１８￣０３￣２５基金项目:国家自然科学基金(３１５０１６０)ꎻ国家农业产业体系(ＣＡＲＳ￣３￣１)ꎻ国家小麦转基因专项(２０１６ＺＸ０８００２００１)作者简介:陈炫(１９９２—)ꎬ女ꎬ陕西咸阳人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｖｉｖｉａｎｃｃｘ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ陈剑平ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｐｃｈｅｎ２００１＠１２６.ｃｏｍ
小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析陈 炫１ꎬ张天烨１ꎬ羊 健２ꎬ张恒木２ꎬ陈剑平２ꎬ∗(１.浙江农林大学林业与生物技术学院ꎬ浙江杭州３１１３００ꎻ２.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所ꎬ浙江杭州３１００２１)
摘 要:真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｅＥＦｓ)是一种重要的多功能调控蛋白ꎬｅＥＦ１β是ｅＥＦ１的组成部分ꎬ在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用ꎮ本文通过ＲＴ￣ＰＣＲ扩增克隆小麦
(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)的ｅＥＦ１β基因ꎬ并命名为ＴａｅＥＦ１βꎮ氨基酸同源性分析发现ꎬＴａｅＥＦ１β具有高度保守
性ꎬ且其保守结构域位于１３７~２２６ａａ处ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬＣＷＭＶ)侵染小麦植株后ꎬ可以诱导ＴａｅＥＦ１β基因转录水平的上调表达ꎮ另外ꎬ本文也进一步分析了
ＴａｅＥＦ１β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和ＣＷＭＶ侵染不同时间点的表达情况ꎮ关键词:真核翻译延伸因子ꎻ中国小麦花叶病毒ꎻ同源性分析中图分类号:Ｓ４３５１２文献标志码:Ａ文章编号:１００４￣１５２４(２０１９)０１￣００９８￣０６
ＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎬｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.ＣＨＥＮＸｕａｎ１ꎬＺＨＡＮＧＴｉａｎｙｅ１ꎬＹＡＮＧＪｉａｎ２ꎬＺＨＡＮＧＨｅｎｇｍｕ２ꎬＣＨＥＮＪｉａｎｐｉｎｇ２ꎬ∗
(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１１３００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＺｈｅｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｎｇｚｈｏｕ３１００２１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ(ｅＥＦｓ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎ.ｅＥＦ１βｗａｓｓｕｂ￣ｕｎｉｔｏｆｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ￣１(ｅＥＦｓ￣１)ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＴｈｅｅＥＦ１βｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｌｏｎｉｎｇｗｉｔｈＲＴ￣ＰＣＲｆｒｏｍｗｈｅａｔａｎｄｎａｍｅｄａｓＴａｅＥＦ１β.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｗａｓｌｏｃａｔｅｄｉｎ１３７￣２２６ａａ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｅＥＦ１βｗｅｒｅｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅＣＷＭＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｌａｎｔｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴａｅＥＦ１βｉｎｔｈｅｓｔｅｍｓꎬｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｏｆｗｈｅａｔａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＣＷＭＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎻＣｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎻｈｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓ
真核翻译延伸因子(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅ￣ｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒꎬｅＥＦｓ)最早作为一个对噬菌体Ｑβ的依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬＲｄＲｐ)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[１]ꎮ在真核细胞中包括３类延伸因子ꎬ分别为ｅＥＦ１α(ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ１α)、ｅＥＦ１β和ｅＥＦ２[２]ꎮＥＦ１β在
真核生物中的结构比在细菌中更复杂ꎬ该蛋白由ＥＦ１β￣ａｌｐｈａ、ＥＦ１β￣ｇａｍｍａ和ＥＦ１β￣ｂｅｔａ三个亚基
组成ꎮ在蛋白质的合成过程中ꎬｅＥＦ１β主要作为ＥＦ家族的一种核苷酸交换因子ꎬ催化不活跃的ｅＥＦ１αＧＤＰ重新变成具有活性的ｅＥＦ１αＧＴＰ[３]ꎮ 近年来ꎬ越来越多的证据表明ꎬｅＥＦｓ作为蛋白分子伴侣和ＲＮＡ/ａｃｔｉｎ结合蛋白参与病毒的转录、翻译、组装及其致病机理的过程[４－９]ꎮ已经报道的有ｅＥＦ１α在番茄花叶病毒(Ｔｏｍａｔｏｍｏ￣ｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴｏＭＶ)[１０]和番茄丛矮病毒(ＴｏｍａｔｏｂｕｓｈｙｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓꎬＴＢＳＶ)[１１]中促进病毒复制复合体的形成ꎻ在人类免疫缺陷病毒１型(ＨＩＶ￣１)病毒中促进病毒粒子的组装[１９]ꎻ在乙型肝炎病毒(ｈｅｐ￣ａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓꎬＨＢＶ)中作为Ｘ蛋白的分子伴侣[１２]ꎻｅＥＦ１β与烟草花叶病毒(ＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＴＭＶ)的ＲｄＲｐ互作影响其病毒的复制[１３]等ꎮ中国小麦花叶病毒(Ｃｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬＣＷＭＶ)是本实验室于２０世纪末在我国山东冬小麦上鉴定的一种由禾谷多黏菌(Ｐｏｌｙｍｙｘａｇｒａｍｉｎｉｓ)传播的病毒[１４]ꎮＣＷＭＶ为单链正义ＲＮＡ病毒(ｐｏｓｉｔｉｖｅ￣ｓｅｎｓｅｓｉｎｇｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｖｉ￣ｒｕｓꎬ(＋)ｓｓＲＮＡｖｉｒｕｓ)ꎬ包含两条基因组分别命名为ＲＮＡ１和ＲＮＡ２ꎮＲＮＡ１含有３个开放阅读框(ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)ꎬ其中ＯＲＦ１编码一个１４９~１５３ｋｕ的多肽ꎬ其ＵＧＡ终止密码子能以一定比例通读(ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈꎬＲＴ)而使开放阅读框延伸至ＯＲＦ２ꎬ产生一个ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶(ＲｄＲＰ)ꎮＯＲＦ３编码一个３６~３７ｋｕ的运动蛋白(ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＭＰ)[１５]ꎮＲＮＡ２含有３个ＯＲＦꎬ分别编码１９ｋｕ的ＣＰ蛋白、８４ｋｕ的外壳蛋白基因通读区(ＣＰ￣ＲＴ)蛋白、２５ｋｕ的蛋白质(Ｎ￣ＣＰ)和１８~１９ｋｕ的沉默抑制子蛋白[１６]ꎮ前期本实验室通过蛋白质组学分析发现ꎬＣＷＭＶ侵染小麦初期能够诱导ＴａｅＥＦ１β在蛋白质水平的上调表达(数据待发表)ꎬ据此ꎬ推测ＴａｅＥＦ１β可能通过某种途径参与病毒侵染寄主植物的过程ꎮ本研究首先用ＲＴ￣ＰＣＲ从小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓ￣ｔｉｖｕｍＬ.)中克隆ＴａｅＥＦ１β基因ꎬ并对其进行生物信息学分析ꎬ并采用ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析ＴａｅＥＦ１β在小麦根、茎、叶等不同组织部位和ＣＷＭＶ不同侵染时期的转录表达水平ꎬ为进一步研究ＴａｅＥＦ１β对ＣＷＭＶ的影响机制提供依据ꎮ１ 材料与方法１.１ 材料本实验所用小麦烟农２２由山东省烟台市农业科学研究院提供ꎬ并由本实验室于温室内培养ꎮ大肠埃希菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ)感受态细胞Ｔｒａｎｓ５α购于北京全式金生物技术有限公司ꎻ基
因克隆所使用的反转录试剂盒ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ购于ＴＯＹＯＢＯ公司ꎻＥｘＴａｑ酶购于
ＴａＫａＲａ公司ꎻ限制性内切酶购于ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ(ＮＥＢ)公司ꎻ实时荧光定量ＰＣＲ(ｑｕａｎｔｉｔａ￣ｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ)所用的反转录试剂
盒ＨｉＳｃｒｉｐｔＱＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘｆｏｒｑＰＣＲ与ＣｈａｍＱＵ￣ｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购于南京诺唯赞
生物科技公司ꎻ凝胶回收ＧｅｎｅＪＥＴＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ购于ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻ引物由杭州擎科
梓熙生物技术有限公司合成ꎮ１.２ 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成
总ＲＮＡ的提取:取健康小麦叶片０７５ｇꎬ使用液氮进行研磨后装入１５ｍＬＲＮａｓｅｆｒｅｅＥＰ管(以下步骤均使用ＲＮａｓｅｆｒｅｅＥＰ管)ꎻ按照１ｇ
ｍＬ－１
的量加入７５０μＬＴＲＩｚｏｌꎬ涡旋振荡混匀后于
４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心１０ｍｉｎꎻ小心吸取上清
到新的ＥＰ管中ꎬ按每１ｍＬＴＲＩｚｏｌ加入２００μＬ氯仿ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置１０ｍｉｎꎬ４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心１０ｍｉｎꎻ吸取上清无色水相ꎬ
按每１ｍＬＴＲＩｚｏｌ加入６００μＬ异戊醇ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置１０ｍｉｎꎬ４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ
离心１０ｍｉｎꎻ弃上清后ꎬ用预冷的无水乙醇悬浮沉淀(ＲＮＡ)后于４℃ꎬ１４０００ｒｍｉｎ－１ꎬ离心
１０ｍｉｎ(重复该步骤一次)ꎻ对ＲＮＡ进行微干燥
后ꎬ使用３０~５０μＬＤＥＰＣ水进行溶解ꎬ用ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳和ＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ对ＲＮＡ的完整性、浓度和纯度进行检测ꎬ于－８０℃保存ꎮｃＤＮＡ合成:取总ＲＮＡ１μｇꎬ以随机引物为
反转录引物ꎬ采用ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ进行反转录ꎬ反应液配置及反应体系参照试剂盒说明书ꎬ进行反转录获得小麦ｃＤＮＡꎬ以０１×ｃＤ￣ＮＡ为ＰＣＲ扩增模板ꎮ
１.３ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
根据ＮＣＢＩ数据库中小麦ｅＥＦ１β序列(登录号:ＡＫ３３２５２９１)ꎬ设计小麦基因ＴａｅＥＦ１β的ＰＣＲ引物(表１)ꎮ使用诺唯赞公司的ＳＹＢＲ在荧
光定量仪ＰＣＲ￣７９００(ＡＢＩ)上进行ｑＲＴ￣ＰＣＲ反应ꎬ
９９陈炫ꎬ等.小麦ＴａｅＥＦ１β基因的克隆、同源性及表达分析
小麦lncRNA27195及其靶基因TaRTS克隆及表达分析
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(8): 1417-1426 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.01071小麦lncRNA27195及其靶基因TaRTS克隆及表达分析王娜1,2,**白建芳2,**马有志1郭昊宇2王永波2陈兆波2赵昌平2,*张立平2,*1中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100087; 2北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心 / 杂交小麦分子遗传北京市重点实验室, 北京 100097摘要: 长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一种大于200 bp的非编码RNA, 大量存在于植物体中,其可通过调节基因表达或蛋白功能, 在植物生长发育与胁迫应答中发挥重要作用。
前期在研究光照和温度对小麦光温敏核雄性不育系BS366育性诱导中, 利用转录组测序筛选获得与育性相关的lncRNA (lncRNA2719)。
为研究小麦lncRNA27195的功能, 本研究在BS366中克隆lncRNA27195及其靶基因TaRTS, 并对TaRTS进行生物信息学分析, 结果显示, TaRTS基因全长315 bp, 编码104个氨基酸, 且发现该RTS蛋白仅存在于禾本科植物中。
通过实时荧光定量PCR, 对lncRNA27195及TaRTS基因在不同组织不同光温处理及茉莉酸甲酯处理下进行表达模式分析, 发现lncRNA27195和TaRTS均在雄蕊中高表达, 呈显著的正相关, 且两者在不同光温条件下呈现出不同的表达模式。
光照和温度均对lncRNA27195和TaRTS有调控作用, 适当浓度的MeJA促进两者的表达, SA抑制两者表达。
以上结果表明, 在光周期、温度和植物激素的诱导下, lncRNA27195正向调节TaRTS基因表达, 进而影响花粉育性, 本研究结果有助于促进对小麦光温敏核型雄性不育系的机理研究和生产应用。
小麦Ta—UBX1基因的电子克隆和生物信息学分析
Ａ Ａ ＣＡ ＴＡＣ ＧＡ Ｃ Ｃ （ ＣＣ ＡＴ ＴＩｒ Ｔ Ｔ Ｔ ＧＧ ＴＡ ＣＡ Ｇ ＡＡ Ｃ ＧＡ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ｇ ＡＧ ＡＧ Ｃ
４
Ｇ
刀 ＡＣ 翻 劢 Ｇ ＧＧ￣
ＧＡ ＇ Ｇ ＴＩ ＣＡ Ｃ
酶Ｅ ４的原 型 — — 酵 母 中 的 蛋 白 Ｕ Ｄ 的 碳 末 端 鉴 定 出 来 Ｆ２
物信息学相关软件对其 进行生物信 息学综合分 析 ， 为进一步 研究在小麦发育过程 中的调节作用提供理论基础 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 小麦 Ｕ — ｏ ． ｂｘ蛋 白基 因的 电子 克 隆
Ｈ Ｃ Ｅ 、 Ｉ Ｇ—ｆ ｇｒＥ 、 —ｂｘＥ 。 Ｕ —ｂｘ域 是 决 定 Ｅ Ｔ ３ＲＮ ｉ ｅ ３ Ｕ ｎ ｏ ３ ｏ
关于植物 Ｕ—ｂｘ蛋 白基 因序列 的报道 较多 ， ｏ 但有 关小 麦 Ｕ— ｏ ｂｘ蛋白基 因克 隆的研究 目前 尚未见 报道。本 研究在 前期工作基础上 ， １个在小麦生理 型不 育花药 中上调表 以
分 析
雄性不育与油菜遗传育种研 究。Ｅ— ａ ：ｊ ０ ９ ６ ．ｏ 。 ｍ ｉ ｗ ｓ ９ ＠１３ ｃｒ ｌ ０ ｎ 通信作者 ： 李成伟 ， 博士 ， 教授。Ｅ— ａ ：ｃｅ ｇ ｅ ｋ ｕ ｅｕ ｃ 。 ｍ ｉ ｌｈｎｗ ｉ ｎ ．ｄ ．ｎ ｌｉ ＠ｚ
以小麦序列 Ｔ Ｆ ６ Ｄ ２ ９作为种子序列 ， 利用软件 ＢＯ ｄｔ Ｉ Ｅ ｉ电
的 。 目前 已鉴定 出的真核生 物 的 Ｕ—ｂｘ蛋 白中， ｏ 酵母 体
内发 现 ２种 ， 物 中有 ６种 ， 动 而拟 南 芥 中有 ３ 该 类 蛋 白 Ｊ ７种 。
小麦TaGL3.1基因的克隆及相关分子标记的开发
2.c DNA克隆测序结果表明三种序列外显子区域相对保守。c DNA序列全长2769bp,编码922个氨基酸。
经过对中国春与西农817的序列进行比对,其中的A序列在两个小 麦材料中仅有一个单碱基的替换,尚未造成所编码氨基酸的改 变,B序列在西农817第3155处有一个单碱基A的缺失,D序列在两 个小麦品种中无差异。Ta GL3.1基因与大麦Hv GL3.1基因 (AK375108.1)同源性高达98.0%。
Ta GL3.1蛋白和水稻Os GL3.1蛋白的三维结构几乎重叠,说明与 水稻粒长Os GL3.1基因同源的小麦Ta GL3.1基因在小麦中也可 能调控小麦籽粒长度。4.Ta GL3.1蛋白与其他物种GL3.1基因编 码的氨基酸序列比较结果表明,不同物种的GL3.1蛋白具有很高 的同源性,Ta GL3.1蛋白与大麦的同源性最高,达到98%。
结果表明:40对SRAP引物在52份材料中共检测出941个等位变异, 其中具有多态性的266个,多态性条带比率为28.27%,每对引物平 均检测出6.65个等位变异;SRAP引物基因多态信息含量值为 0.106 3~0.7385,平均值为0.477 5;在遗传相似系数0.5710处将 52份材料分为5个类群,与群体遗传结构分析的结果基本一致,聚 类结果也与遗传系谱较为吻合;豫麦2号对各世代的遗传贡献分 析表明,豫麦2号对其衍生子二代、子三代和子四代的平均遗传 贡献率为44.06%、42.14%和41.98%。
小麦TaGL3.1基因的克隆及相关分子标 记的开发
小麦是全球非常重要的粮食作物,近年来,可以用来耕种的土地 面积逐渐减少,而人口数量却在不断增加,因此对于粮食的需求 也越来越大,那么在有限的土地资源条件下,如何提高小麦的产 量已经成为今后农业发展的主要研究目标。千粒重对小麦的产 量起到至关重要的作用,它主要由籽粒的长度、宽度、厚度和饱 满度等决定。
冬小麦膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10的克隆及低温表达分析
冬小麦膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10的克隆及低温表达分析王明晶;王晓磊;徐永清;李凤兰;王旭;彭丽娜;李飞;董佳敏;张俊峰【摘要】以冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号为试验材料,从其根中克隆膨胀素基因TaEXPB8、TaEX-PB10,并分析其在低温条件下的表达情况,为研究膨胀素基因与植物抗寒性之间的关系奠定基础.结果表明,在冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号根中克隆得到膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10,二者分别编码273、271个氨基酸,二者序列与GenBank上公布的序列同源性分别达到99.2%、99.6%.4℃、-10℃和-20℃的低温胁迫处理均可诱导TaEXPB8、TaEXPB10基因在冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号根中表达,尤其是TaEXPB10基因,其受诱导程度高于TaEXPB8;两基因在低抗寒品种济麦22号中总体上不受诱导,甚至受到抑制.综合比较发现,4℃、-10℃和-20℃低温胁迫下,TaEXPB8、TaEXPB10基因在强抗寒品种东农冬麦1号中的表达量均明显高于低抗寒品种济麦22号.据此推测膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10与冬小麦根系的低温胁迫耐受能力具有重要的相关性,有助于进一步深入了解冬小麦根系的抗寒机制.%The cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No. 1 was used as experimental ma-terial. The expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 were cloned from its roots,and their expression pro-files were analyzed under low temperature conditions,so as to lay a foundation for study of the relationship between expansin genes expression and the plant cold resistance. The results showed that the expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 were cloned from cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No. 1,which coded 273 and 271 amino acids,respectively. In addition,they shared 99. 2% and99. 6%homology separately with the published sequence in GenBank. Besides,4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃ could induce the expression of TaEXPB8 and TaEXPB10 in roots of Dongnongdongmai No. 1. Especially for TaEXPB10,it had higher inducing level than TaEXPB8. However,these two genes were not induced in Ji-mai No. 22 ( cold susceptible variety) on a whole,even were suppressed. Taken together,we found that under 4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃,the expression level of TaEXPB8 and TaEXPB10 in Dongnongdongmai No. 1 (cold resistant variety) were all significantly higher than that in Jimai No. 22(cold susceptible vari-ety) . Thus,it had been postulated that the expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 had great relevance with low temperature stress tolerance ability of the roots of Dongnongdongmai No.1. It also provided fur-ther understanding on the cold resistance mechanism in winter wheat root system.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)002【总页数】6页(P6-11)【关键词】冬小麦;膨胀素;低温处理;表达分析【作者】王明晶;王晓磊;徐永清;李凤兰;王旭;彭丽娜;李飞;董佳敏;张俊峰【作者单位】东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨学院,黑龙江哈尔滨150086;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S512小麦是我国重要的粮食作物，可分为春小麦和冬小麦，我国以冬小麦的种植为主[1]。
耐盐小偃麦乙烯受体基因TtETR1克隆及表达特性分析
·13·收稿日期：2022-05-30基金项目：国家自然科学基金项目（31860380，32160442）；贵州省科技计划项目（黔科合平台人才〔2018〕5781号）通讯作者：张素勤（1974-），https:///0000-0001-9129-4937，教授，主要从事麦类作物遗传育种研究工作，E-mail ：zsqin************第一作者：石鹿溪（1998-），https:///0000-0003-1060-0782，研究方向为小麦遗传育种，E-mail ：*****************耐盐小偃麦乙烯受体基因TtETR1克隆及表达特性分析石鹿溪1，田怀志1，熊兴伟1，穆远航1，张菊1，何方1，2，张庆勤1，张素勤1，2*（1贵州大学农学院，贵州贵阳550025；2国家小麦改良中心贵州分中心，贵州贵阳550025）摘要：【目的】克隆耐盐小偃麦的乙烯受体基因TtETR1，并进行表达特性分析，为TtETR1基因的功能分析和小麦耐盐遗传育种提供理论参考。
【方法】以耐盐八倍体小偃麦为材料，根据小偃麦转录组数据筛选盐胁迫响应关键基因TtETR1，利用同源克隆技术获得其cDNA 序列，利用生物信息学软件进行分析，并通过实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测其在盐胁迫下的表达特性。
【结果】TtETR1基因的开放阅读框（ORF ）长度为2310bp ，编码769个氨基酸残基，其上游2000bp 启动子包含茉莉酸甲酯与脱落酸信号响应、干旱和厌氧诱导、分生组织表达等作用元件。
TtETR1蛋白分子质量为85.76kD ，理论等电点（pI ）为6.22，为含跨膜结构的分泌型蛋白，定位于细胞质膜上，二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成，含有REC_ETR-like 、HATPase_ETR2_ERS2-EIN4-like 、cGMP 磷酸二酯酶-腺苷酸环化酶-FhlA （GAF ）、组氨酸激酶（HisKA ）等结构域，具有丝氨酸为主、苏氨酸为辅的乙烯信号转导进行磷酸化修饰与调控的位点。
沉默的小麦1By高分子量谷蛋白亚基的分子克隆的开题报告
沉默的小麦1By高分子量谷蛋白亚基的分子克隆的开题报
告
一、研究背景和意义
小麦是世界上主要的粮食作物之一，但是小麦过敏症在全球范围内也越来越严重，其中大部分过敏反应是由小麦谷蛋白引起的。
小麦谷蛋白是小麦籽粒中最主要的蛋白质，由若干个不同的组分组成。
其中，高分子量谷蛋白亚基是导致小麦过敏的主要成
分之一。
因此，了解高分子量谷蛋白亚基的分子结构和功能具有重要的理论意义和实
际意义。
二、研究目的
本研究旨在利用分子生物学技术对小麦高分子量谷蛋白亚基的分子结构进行克隆和分析，以期深入探究小麦过敏的发病机制，为解决小麦过敏问题提供科学依据。
三、研究内容和方法
1.收集小麦籽粒中高分子量谷蛋白亚基的基本信息和已有研究结果，明确研究方向和重点。
2.采用PCR技术从小麦基因组DNA中扩增高分子量谷蛋白亚基的编码序列，并
进行序列分析、比对和预测蛋白质结构。
3.将克隆得到的编码序列构建表达载体，利用大肠杆菌表达系统对高分子量谷蛋白亚基进行表达和纯化。
4.利用蛋白质生化分析技术对纯化后的高分子量谷蛋白亚基进行分析，并研究其生物学功能和作用机制。
四、预期结果和意义
通过本研究的开展，预计可以获得小麦高分子量谷蛋白亚基的完整编码序列和蛋白质结构信息，深入理解高分子量谷蛋白亚基在小麦过敏中的作用机制，并且有望为
未来解决小麦过敏问题提供科学支撑和理论指导。
小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测
小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测摘要本文报道了一种小麦（Triticum aestivum L.）调控生长和抗逆性的转录因子TaBS1的克隆、原核表达和Western blot检测的方法，TaBS1被认为是一种ABA受体蛋白，其对水分胁迫的反应有重要的生物学意义。
采用RT-PCR技术，TaBS1编码序列被克隆并进行序列验证，随后将TaBS1序列直接克隆到pET30b(+)表达载体，在蓝细胞中表达出具有抗菌活性的TaBS1蛋白。
此外，TaBS1在水分胁迫条件下的表达水平得到了检验，通过Western blot实验证实，在降低水分时，TaBS1的表达水平显著增加。
本研究首次报道了这种小麦调控生长和抗逆性的转录因子的克隆、原核表达及Western blot检测的方法，这也为进一步探究TaBS1的生物学功能提供了重要的技术支持。
Introduction小麦（Triticum aestivum L）是一种重要的谷物作物，其发展及生长受水分胁迫影响。
ABF（ABA-related protein family）蛋白是一类ABAA-dependent receptor-like protein，是水分胁迫反应的关键性调节因子。
其中，TaBS1是一种ABF类蛋白，在小麦中起到调控生长和抗逆性的作用。
虽然TaBS1在水分胁迫条件下的表达有着重要的生物学意义，但是尚未有关于小麦TaBS1转录因子克隆、原核表达及Western blot检测的方法的报道。
Materials & Methods1. TaBS1 cDNA克隆采用实时PCR技术，从小麦中分离出TaBS1，序列信息并上传到NCBI数据库。
2. 原核表达使用引物5'-AAT TGC ACC TTA ATA GAT AAA GTC GGA-3'、5'-TTA GAA CTC CTA CCA ATG CCT GAG CAT-3'设计TaBS1引物，将TaBS1编码序列直接克隆到pET30b(+)表达载体中，以LB + Kanamycin (25ug/ml)培养蓝细胞表达TaBS1蛋白，经SDS-PAGE检测，TaBS1被正确表达，此外，TaBS1表达蛋白还具有抗菌活性。
拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆
拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆干旱、盐、极端温度等非生物胁迫严重影响植物的生长和发育。
植物在长期的进化过程中形成了复杂而精准的信号网络,可以感知外界信号并做出响应。
在非生物胁迫下,植物可以调控胁迫相关基因的表达,从而提高植物的抗性。
探究植物胁迫响应机制对于提高植物抗性具有十分重要的作用。
植物泛素连接酶参与了多种信号传导途径。
SEVEN IN ABSENTIA(SINA)首次在果蝇中被发现,参与果蝇眼睛的形成。
SINA是一类含有RING保守域的泛素连接酶,RING保守域对于SINA的泛素连接酶活性具有决定性作用。
拟南芥中共发现18个SINA-like蛋白,其中SINA2不含有该家族其它成员共有的RING保守域。
本研究以拟南芥为研究材料,探究SINA2在非生物胁迫条件下的响应;通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白,该蛋白在体外具有泛素连接酶活性;通过酵母双杂交系统筛库,获得SINA2的互作蛋白CDKG1,进一步研究SINA2与CDKG1之间的关系;分析CDKG1在非生物胁迫下的响应及其功能;研究同时克隆了小麦SINA同源基因TaSINA1,分析其进化关系及表达特性。
主要得到以下结果:1、氨基酸序列比对发现SINA2在N端缺失RING保守域,而含有一个不完全保守的B-box2保守域;进化树分析发现SINA2与其它SINA蛋白的亲缘关系较远,其通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白;His-SINA2在体外可以催化自身泛素化,对于UbcH5a具有特异性。
2、SINA2定位在细胞核和细胞质中;在各个器官中均有表达,在花和果荚中的转录水平最高;SINA2在干旱、盐胁迫和ABA处理下的转录水平均有提高;sina2突变体对干旱、盐胁迫和ABA处理十分敏感,发芽率和子叶展开率均明显低于野生型。
3、通过酵母双杂交筛库获得SINA2的互作蛋白CDKG1;通过原核表达系统获得MBP-CDKG1,在体外SINA2可以与MBP-CDKG1结合;将表达YFPN-SINA2和YFPC-CDKG1融合蛋白的载体通过农杆菌注射法转化烟草叶片表皮细胞,在细胞核中发现黄色荧光信号。
转基因小麦T1代中外源基因的检测和分析
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上述基 因存在较大 困难 ． 因此 ， 如何在转基 因材料 中 对外源基 因片段 检测成为新种质 培育能否 成功 的关 键． 了解 决 这 个 问 题 ， 用 分 子 标 记 技 术 ， 立 为 利 建
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摘
要 ：该 研究 采用 Ｍｕｔ ｌｘＰ Ｒ 和 ｓ Ｐ ｌ ｐｅ Ｃ ｉ Ｄ ＡＧＥ技 术 对 转 １ ｘ 基 因 （ Ｒ ） 代 小 麦 进 行 了 Ｄ ５ Ｏ ＦＴ
小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析
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（ 四川农业大学水产学 院， 成都 ６ １３ ） １７０
摘 要 ：Ｒ ＧＡ（ ￣性 基 因 同源序 列） 法是 克 隆植 物抗 性基 因的 一种 经 济 有 效 的方 法 。 为近 年 来的研 究 成 热 点。本 实验 综 合 分析 了拟 南芥 ， 红柿 ， 稻 ， 西 水 烟草 等植 物 已克 隆 的抗 性 基 因， 以这 些抗 性 基 因 的 并
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