微生物学实验_3_土壤中微生物的分离
微生物的分离和纯培养
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。
培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。
为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
2、接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。
由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
【微生物学期末考试题库】经典题目简答题1
2020届微生物学期末考试经典题目题库整理问答题1、如何从土壤中分离得到一个微生物的纯培养体?答：首先要根据分离对象选择适宜的培养基。
若要分离真菌应选用马丁-孟加拉红选择培养基；若要分离细菌应选用牛肉膏蛋白胨培养基；若要分离放线菌应选用高氏培养基。
土样采回来后，用常规的十倍稀释分离法进行稀释分离，若分离细菌，一般稀至10-8, 若分离放线菌,一般稀至10-6；若分离真菌，一般稀至10-4。
取最后三个稀释度倒平板获得单个菌落。
将平板上出现的单菌落转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度，若不纯，应将培养的单菌落斜面再次进行稀释分离。
倒平板获得单菌落，转接斜面培养，同时镜检菌体的纯度。
反复几次直到得到菌体单一的单菌落方可认为是某一微生物的纯培养体.2、革兰氏染色反应的成败关键是什么?为什么革兰氏染色有十分重要的理论与实践意义?答案：因通过革兰氏染色，可把几乎所有的细菌都分成G＋和G－菌两大类细菌，在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显的差异。
因此，任何细菌只要通过革兰氏染色，即可提供不少重要的生物学特性方面的信息。
革兰氏染色反应的成败关键是:1). 菌龄:12-24小时的纯培养物。
2）革兰氏染色操作时，要严格控制酒精脱色时间，菌液涂布均匀而薄。
3. 培养基的组成。
3、简述防腐的种类及其应用。
答案：防腐的种类很多，主要有①低温，利用4①以下的温度保藏食物、菌种等；①缺氧，采用在密封容器中加入除氧剂来有效地防止食品和粮食等的腐烂；①干燥，采用晒干、烘干或红外线干燥等方法对食物等进行保藏；①通过盐腌和糖渍等高渗来保藏食物。
①高酸度；①加防腐剂。
4、根据温度、氧、pH可将微生物分为哪些类型？答案：按照微生物的最适生长温度可将微生物分为三种类型：①嗜冷菌；①中温菌；①嗜热菌。
按照微生物与pH的关系，可将微生物分为三种类型：①嗜酸菌；①嗜中性菌；①嗜碱菌。
按照微生物与氧的关系，可将微生物分为两大类：①好氧菌；①厌氧菌。
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
2、首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只 有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以 该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总 数（见下表，例1）。 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值 小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其 中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表， 例2及例3）。
10-4 稀释度 细 菌 cfu数/平板 每g土壤的CFU数 10-5 10-6
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
3
平均
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
2、培养时为什么要将培养皿倒置培养？
其它微生物的分离纯化方法
（一）、稀释混合平板法
①按无菌操作要求，用胶头滴管依次吸取10-6、 10-5 、 10-4稀释液各200 uL，分别加入编号为10-6、 10-5 、 10-4的培养皿中。
正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿
计算公式：
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。
交叉划线法
连续划线法
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
微生物学实验知识点总结与实践应用
微生物学实验知识点总结与实践应用微生物学实验知识点总结与实践应用微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。
《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。
微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。
涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。
我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。
（1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。
在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。
（2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。
自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。
（3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。
灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。
微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或环境赋予菌种的抵抗力。
灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。
是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。
经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。
经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。
（4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。
经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。
根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术是微生物学实验室中最基本、最重要的实验技术之一。
其主要原理是将混合微生物群落分离为单一的微生物菌落，并在适宜的环境条件下使其生长繁殖形成单一菌种培养物，以便进行鉴定和研究。
1.微生物的分离技术
（1）稀释涂布法：将微生物混合液逐渐稀释，然后取一定量的稀释液涂布在富养基平板上，待菌落形成后，挑取单一菌落进行培养和研究。
（2）过滤法：利用微孔膜或滤纸将混合液过滤，将过滤后留在微孔膜或滤纸上的微生物进行培养和研究。
（1）液体培养：将微生物接种在富足的液体富养基中，置于适当的温度、光照和通气条件下进行培养。
（3）混合培养：将两种或以上的微生物同时接种在同一富养基上进行培养，这一技术可同时培养多种微生物，缩短实验时间。
3.技术应用
微生物的分离与培养技术在微生物学研究、医学诊断、生物工程和食品工业等领域都得到广泛应用。
（1）微生物学研究：分离单一菌种进行研究，为微生物学研究提供基础。
（2）医学诊断：从临床样品中分离出致病微生物进行培养与鉴定，有助于快速准确地诊断、鉴定和治疗病原微生物感染。
（3）生物工程：在微生物培养基中添加营养物质，用微生物进行合成、代谢和分泌等反应。
（4）食品工业：将微生物培养在富有营养的富养基中进行发酵，生产出发酵食品。
环境工程微生物学实验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别穿刺接种大肠杆菌和变形杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h 3、柠檬酸盐利用试验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别划线接种大肠杆菌和枯草杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h
四、实验结果观察与记录
1、将实验结果填入下表，＋表示阳性，－表示阴性。 2、思考题：微生物生理生化反应的意义何在？
三操作步骤1微生物大小的测量1枯草杆菌标本片的制作2目镜测微尺的标定放置镜台测微尺放置目镜测微尺校正目镜测微尺计算不同放大倍数下目镜测微尺每格代表的长度3枯草杆菌大小的测量四实验报告1将目镜测微尺校正结果填入下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺目镜测微尺每格代表的长度2在高倍镜下测量枯草杆菌大小的实验结果填入下表菌体编号长度的目镜测微尺格数宽度的目镜测微尺格数平均值菌体大小平均值m3分析实验结果一实验目的明确显微镜计数的原理
酵母菌的形态构造
线 粒 体 芽体液泡 芽 体 核 液 泡 膜 细 胞 壁 细 胞 膜
根霉（Rhizopus)
青霉（Penicillum):
曲霉(Aspergillus)
四、实验报告
1. 分析实验结果，绘制酵母菌、青霉、黑曲霉的形
态图，并注明各部位名称，。 2. 怎样才能观察到较为完整的霉菌形态，各种霉菌 制片过程中分别有哪些注意事项？
121℃,灭菌20~30min
使用时, 将培养基加热融化, 待温度降至50 ℃左右时在 100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL
糖发酵培养基：
蛋白胨2g，葡萄糖10g， K2HPO4 0.2g, NaCl 5g, 琼脂5～6g， pH7.0～7.2 ，蒸馏水1L ， 1%溴百里酚蓝 3ml. 分装试管，每管4～5cm， 112℃,灭菌30min.
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微生物学实验-3
实验五
土壤中微生物的分离
实验目的
1．了解微生物分离和纯化的基本原理。 2．掌握常用的微生物分离纯化的方法。
实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种 或某一株微生物的过程称为微生物的分离 纯化，常用的方法有两种：
1．平板分离法（涂布法、混菌法） 2．划线分离法
实验器材
1. 微生物样品：土壤 2. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏1号培养
基，PDA培养基。 3. 溶液或试剂：盛9ml无菌水的试管，盛99ml无菌
水并带有玻璃珠的三角烧瓶，95%酒精。 4. 仪器或其他用具：天平，玻璃涂布棒，移夜枪，
无菌枪头，接种环，无菌培养皿，记号笔等。
实验方法
1．稀释涂布平板法
3. 划线时动作要轻巧，避免划破平板。 4. 注意整个操作过程是在火焰周围的无菌操作区
域内进行，操作完成后将接种工具火焰灭菌后 再放回原处。
思考题
1. 涂布好的平板在培养时为何要倒置?
知识回顾 Knowledge Review
①倒平板
将固体培养基加热溶化，待冷却至55~60℃时， 在酒精灯火焰旁，将培养基迅速倒入已灭菌的培 养皿中约15~20ml，平放于桌面上，待冷却凝固 后即为无菌平板。
倒平板操作示意图
②制备样品稀释液（以土壤为例）
准确称取土壤样品1g，放人盛有99ml无菌水并 放有小玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使 微生物细胞分散，即成10-2的土壤样品稀释液； 用无菌吸管吸取10-2稀释液1mL，移入装有 9mL无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合 均匀，即成10-3稀释液；再换一支无菌吸管吸 取10-3稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试 管中，也吹吸几次，即成10-4稀释液，以此类 推，连续稀释，制成10-5、10-6、10-7、10-8、 10-9等一系列稀释菌液。
涂布平板操作法示意图
涂
混
布
菌
法
法
培养基 约55℃
④培养
将平板倒置于28℃温箱中恒温培养，细菌培养1～ 2 d ，放线菌培养5～7 d ，霉菌3～5 d。
⑤挑菌落
将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种 到上述培养基的斜面上，置于28℃温箱培养，待 菌苔长出后，检查其特征是否一致，若发现有杂 菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养
2.平板划线分离法
①倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，标明培养基名 称、样品编号和实验日期。
②划线：点燃酒精灯，在火焰旁左手拿无菌平板，右 手拿接种环以无菌操作沾取少许待分离的样品， 在无菌平板表面进行平行划线、连续化线、交叉 划线、扇形划线、方格划线或其他形式的划线， 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少， 并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能 一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
使用：10-2、10-3、10-4
从土壤中分离微生物操作过程
注意：
按下加样按 钮时要轻轻 按下，注意 区别加样档 和排空档； 放开时要缓 缓放松。
加样按钮 卸枪头按钮 加样量显示窗
枪头
③涂布
在无菌平板的底部贴好标签，然后用无菌吸管 分别由10-2 、10-3和10-4 土壤样品稀释液中各吸 取一定量的稀释液（0.1ml~0.2ml）对号放入已 写好标签的无菌平板中，用无菌玻璃涂布棒在 培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～ 10min，使菌液吸附进培养基。
③培养，挑单菌落。
平板划线操作法示意图
平板划线分离法(streak plate method)
Байду номын сангаас 1
3
4
平板划线菌落分离效果图
注意事项
1. 在稀释混合平板法中，注入培养基不能太热， 否则会烫死微生物；在混匀时，动作要轻巧， 应多次前后、 左右、顺或逆时针方向旋动。
2. 作涂布、划线用的平板，琼脂含量可适当高些， 倒平板时培养基不宜太烫，否则易在平板表面 形成冷凝水，导致菌落扩散或蔓延。