土壤中微生物的分离
实验五 土壤中微生物的分离计数
（四）悬液稀释
无菌操作采用－4，－5，－6 稀释液涂布牛肉膏蛋白 胨平板;每个稀释度2个重复。每人用剩下的1个平板做 划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离。
10-1 10克 土样
90毫升 无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
(五)平板涂布
Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.
一、实验目的：
学习微生物稀释平板计数及划线分离技术 二、实验原理: 采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑 制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微
生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法
在固体培养基上形成单个菌落。
依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌
落从而推算样品中含有多少细菌的活菌数目。
简单易行，但易 造成机械损伤
（六）培养：
将平板用报纸包好（每个平板方向一致），
写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱 培养(温度37℃) 。
（七）细菌计数结果
稀释度 平板 10-5 1 2 10-6 度平 均菌落数
土壤中含 细菌数量
四、平皿划线 分离法
特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
五、试管斜面接种
1.两支试管呈“V”字形 3.火焰上微烧一周
2.拔下试管塞
4.接种环灼烧、冷却 6.塞上塞子，灼烧接种环
5.接种、划线
六、思考题
(1) 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关 键?为什么?
(2)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而
实验二：土壤中微生物分离与纯化
了解并掌握微生物的生理生化特征， 如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划 线培养或平板克隆培养，获得纯培养 的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本， 采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化， 通过反复划线或平板克隆培养 ，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落 特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保 藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生 物学方法对分离得到的菌株进行鉴定 。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态 各养基
根据目标微生物的特性， 选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加 在培养基上，放入恒温培 养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况， 记录菌落形态、颜色、大 小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划 线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或 传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养 基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这 些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03
实验十二---土壤中微生物的分离纯化-PPT
三、实验器材
1、土壤样品（自带） 2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试 管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌 培养皿等。
四、操作步骤
五、实验报告
１、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表II-5） ２、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不 是，请分析其原因。 ３、在３种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简 述它们的菌落形态特征。
六、思考题
1、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何 特点？说明理由。 3、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？ 4、为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉 素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细 菌，你认为应如何做？ 5、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行 的检测方法。
2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土壤是 微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从 中分离、纯生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining
如何从土壤中分离出微生物
如何从土壤（污水）中分离出微生物把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。
而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。
对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用2.做浸出液的梯度稀释3 .涂平板4.划线分离5.接平板，接斜面6.检测从土壤中分离微生物环境工程（1）班一、试验目的1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。
2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。
它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。
此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。
因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验器材(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。
(三)土壤样品、天平、称旦纸。
（四）恒温箱、气体流量计四、试验程序1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液3、涂布将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
分离土壤中微生物的方法
分离土壤中微生物的方法
《分离土壤中微生物的方法》
一、离心分离法
1、离心分离法是一种快速、简便、有效的土壤微生物分离方法，主要用来分离大量的土壤和沉淀物中的微生物。
原理是利用离心力将土壤中的微生物悬浮液中的水分剥离出来，浓缩悬浮液，然后采用制备的高标准分析液（如硫酸铵）搅拌悬浮液，将微生物转移到新的液体中，最终将微生物和悬浮液分离。
2、离心分离的步骤包括：
（1）采集土壤样品
（2）将土壤样品放入备有清水的容器中，并予以搅拌，搅拌时间1-2min。
（3）将搅拌后的样品置于离心机中，用适当速度及时间进行离心分离，离心结束即可得到悬浮液。
（4）将离心后的悬浮液加入制备好的高标准分析液中，并搅拌。
（5）将混合液再次置入离心机中，离心一段时间，即可将高标准分析液和悬浮液分离开来，从而完成土壤中微生物的分离。
二、膜过滤法
1、膜过滤法是一种分离土壤中微生物的有效方法。
原理是将土壤中的微生物悬浮液置于膜滤器上，通过该膜滤器，微生物悬浮液中的水分可以通过滤膜留下，膜滤器上的微生物则由于大小不同而滞留在膜滤器上，最终完成分离。
2、膜过滤分离的步骤包括：
（1）采集土壤样品
（2）将样品放入备有清水的容器中，并搅拌于汤匙，搅拌时间1-2分钟；
（3）将搅拌后的悬浮液置于膜滤器上，以适当的速度滤过，最终完成分离。
（4）完成后，将膜滤器上的微生物收集用来进行后续操作。
王--实验二 土壤中微生物的分离与纯化
王--实验二土壤中微生物的分离与纯化
土壤中是存在大量微生物的，包括细菌、真菌、放线菌等，在生态系统中起着重要作用。
微生物的分离与纯化是微生物学研究的重要方法之一，对于了解土壤微生物多样性、功能和应用具有重要意义。
本实验旨在通过土壤样品进行微生物分离和纯化，了解微生物分离技术和分离纯化菌株的方法。
一、实验方法
1.1 实验设备
实验室常用的分离纯化设备有平板计数器、减压灭菌器、烧杯、移液器、离心机等。
其中，平板计数器是精确测定细菌数量的仪器。
实验材料包括培养基、细菌液、土壤样品等。
1.3 分离纯化细菌的步骤
（1）将土壤样品放入离心管内。
（2）在土壤样品中加入生理盐水，摇晃离心管，使土壤样品和生理盐水充分混合。
（3）将混合物在烧杯内振荡。
（4）利用平板计数器精确测定细菌数量。
（5）从混合物中挑出单个菌落，进行菌株分离和纯化。
（6）将菌落移至培养基上，进行培养、观察和记录。
二、实验结果
通过本实验，我们共采集了5个不同土壤样品，进行菌落计数和菌株分离、纯化、培养等处理。
实验结果显示，不同土壤样品中微生物的数量和种类存在差异。
其中，含有腐殖质较多的土壤样品中微生物数量较多，且种类丰富。
2.2 结果分析
土壤微生物数量和种类的差异主要与土壤样品的营养含量及物理化学性质有关。
白灰土、黄土、红壤等含有较高营养含量和较优地理环境的土壤样品中微生物的数量和种类较多，而贫瘠荒芜的土壤样品中微生物数量和种类较少。
此外，氧分压、pH值、盐分等土壤环境因素的差异也会导致土壤中的微生物数量和种类存在差异。
分离土壤中微生物的方法
分离土壤中微生物的方法土壤中的微生物是土壤生态系统中非常重要的组成部分，对土壤的物质循环、生态功能以及农田生产等都有着重要的影响。
因此，分离土壤中的微生物并进行研究是了解土壤微生物群落结构和功能的重要手段。
下面将介绍一些常用的分离土壤中微生物的方法。
1.稀释涂平法：稀释涂平法是最为常用的一种分离培养微生物的方法。
首先，将土壤样品稀释成一定的浓度；然后，将适量的稀释液均匀地涂布在培养基平板上；最后，将培养基平板的菌落进行分离鉴定。
优点是简单易行，适用于常见的土壤微生物；缺点是只适用于可培养的微生物。
2.筛选技术：筛选技术通过筛选和培养特定类型的微生物，实现对土壤微生物的分离。
常用的筛选技术有选择性培养基筛选、酶基因筛选、菌落形态和色素筛选等。
优点是可以选择性培养其中一类型的微生物；缺点是存在选择性偏倚和培养基有限性。
3.海绵法：海绵法通过悬浮土壤样品，利用海绵吸附和负压吸附的原理，分离土壤中的微生物。
首先，将土壤样品加入海绵中；然后，通过一定的操作将海绵中的微生物分离出来；最后，对分离出的微生物进行鉴定。
优点是可以分离植物根际微生物和陆地微生物；缺点是操作复杂。
4.聚合物链式反应（PCR）和16SrRNA基因测序：PCR和16SrRNA基因测序是一种通过分子生物学手段分离和鉴定微生物的方法。
首先，从土壤中提取微生物的DNA；然后，利用PCR方法扩增16SrRNA基因片段；最后，对扩增产物进行测序并分析。
优点是可以快速分离和鉴定微生物，无需进行培养；缺点是依赖于标准数据库的准确性。
5.激光共聚焦显微镜技术：激光共聚焦显微镜技术可以直接观察土壤中的微生物，并通过分析其形态特征对微生物进行分类和分离。
优点是可以快速直观地观察微生物；缺点是无法进行鉴定和培养。
综上所述，分离土壤中微生物的方法有许多种，分别适用于不同的研究目的和需求。
可以根据具体情况选择适合的方法。
同时，需要注意的是，单一的方法可能无法完全反映土壤微生物多样性，因此最好结合多种方法进行研究，以全面了解土壤中微生物的群落结构和功能。
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第一节 微生物生长的测定 以数量变化对微生物生长情况进行测定 通常用来测定细菌、 通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况 或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌） 或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌） 培养平板计数法
采用培养平板计数法要求操作熟练 准确，否则难以得到正确的结果： 、准确，否则难以得到正确的结果： 样品充分混匀； 样品充分混匀； 每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液； 稀释度的菌液； 同一稀释度三个以上重复,取平均值； 同一稀释度三个以上重复 取平均值； 取平均值 每个平板上的菌落数目合适， 每个平板上的菌落数目合适，便于 准确计数； 准确计数；
一个菌落可能是多个细胞一起形成， 一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（ 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 ， ）来表示， 不是直接表示为细胞数。 不是直接表示为细胞数。
实验步骤
• 将10g土样装入含 土样装入含100ml无菌水的锥形瓶中振 土样装入含 无菌水的锥形瓶中振 荡10min • 取1ml移入含 移入含9ml无菌水的试管中，吹吸均匀， 无菌水的试管中， 移入含 无菌水的试管中 吹吸均匀， 为稀释10倍的样品 为稀释 倍的样品 • 依次进行梯度稀释 • 倒培养基 • 取合适稀释度的样品1ml涂布 取合适稀释度的样品 涂布
实验五 土壤中微生物的分离
实验目的
• 掌握从样品中分离不同种类的微生物， 掌握从样品中分离不同种类的微生物， 并进行活菌计数 • 巩固无菌操作的方法
微生物生长： 微生物生长： 单位时间里微生物数量或生物量（ 单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的增加。 ）的增加。 个体计数 微生物生长的测定： 微生物生长的测定： 群体重量测定 群体生理指标测定 评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响； 评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响； 评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死 作用的效果 评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制 或杀死)作用的效果； 或杀死 作用的效果； 客观地反映微生物生长的规律； 客观地反映微生物生长的规律；
实验安排
• 10-510-610-7稀释度为细菌培养 牛肉膏蛋白 胨培养基 • 10-310-410-5 稀释度为放线菌培养，注意培养 稀释度为放线菌培养， 基在倒入平板前先加入数滴重铬酸钾溶液 高氏一号培养基 • 10-210-310-4稀释度为真菌培养 马丁氏培养 基