公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定操作规程
大肠菌群的测定方法操作规程
文件制修订记录1、培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，煌绿乳糖胆盐肉汤，结晶紫中性红胆盐琼脂，无菌生理盐水。
2、操作步骤2.1样品的稀释：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
用1 mL 无菌吸管吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1 次，换用1支1 mL 无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。
2.2选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。
同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
2.3及时将15 mL～20 mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36℃±1℃培养24h～48 h。
3、平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。
4、证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36℃±1℃培养48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
5、大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以4.4中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则(中英文对照版)
大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱:36±1℃。
1.2 冰箱:0~4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
大肠菌群测试片检测操作流程
大肠菌群测试片操作流程1.样品的前处理(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠菌群标准菌：挑取平板上大肠菌群标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液必要时用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（3）大肠菌群标准菌原液的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
大肠菌群测定操作规程
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大肠菌群测定操作规程
适用范围：大肠菌群系指一群在 36℃条件下培养 48h 能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革 兰氏阴性无芽孢杆菌。通常用此法作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。
二． 1.
操作内容： 检验程序： 检样→ 稀释 → LST 发酵管（36±1℃，24±2h）
↓→不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 →BGLG（36±1℃，48±2h） → 不产气 → 大肠菌群阴性 → 报告 产气 → 大肠菌群阳性 → 报告 2. 操作方法：
2.1 以无菌操作，将检样 10ml 被测液放于含有 90ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶 内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。 2.2 用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液） ，振摇试管，混合均匀，做成 1：100 的稀释液。 （均 液的 PH 值应在 6.5～７.5 之间，必要时分别用 1mol/L 氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL） 调节。 2.3 另取 1ml 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。 2.4 根据食品卫生标准要求或对检污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种 3 管。 2.5 初发酵试验：将待检样品接种于月桂基硫盐胰蛋白胨发酵管内，接种量在 1ml，每一稀释度接种 3 管， 36±1℃文箱内培养 24±2h， 置 观察倒管内是否有气泡产生， 如未产气则继续培养至 48h±2h. 记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 2.6 复发酵试验 用按种环从所有 48h±2h 内发酵产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环， 移种于 BGLB 肉汤管中， 36±1℃培养 48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 2.8 报告： 根据证实为大肠菌群阳性的管数， MPN 检索表 查 （见 GB/T4789.3 附表 B） 报告每 100ml ， （g） 大肠菌群的 MPN 值。
公共场所浴盆、脸(脚)盆微生物检验方法 大肠菌群测定
GB/T 18204. 12-2000前言为贯彻执行《公共场所卫生管理条例》和GB 9663—9673-1996、GB 16153-1996《公共场所卫生标准》，加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准。
本标准中的方法是与GB 9663～9673-1996、GB 16153-1996相配套的监测检验方法。
本标准第一次为仲裁法。
本标准为首次发布。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：吉林省卫生防疫站、长春市卫生防疫站、黑龙江省卫生防疫站。
本标准主要起草人：刘亚平、李梅、张旭宏、刘艳芬、袁韧。
中华人民共和国国家标准公共场所浴盆、脸（脚）盆微生物检验方法大肠菌群测定GB/T 18204.12-2000Methods of microbiological examinationfor bath tube and wash basin in public places-Determination of Coliform bacteria1范围本标准规定了公共场所浴盆、脸（脚）盆大肠菌群的测定方法。
本标准适用于公共场所浴盆、脸（脚）盆大肠菌群的测定。
2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 18204. 3-2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定GB/T 18204. 11-2000公共场所浴盆、脸（脚）盆微生物检验方法细菌总数测定3定义本标准采用下列定义。
大肠菌群coliform bacteria指一群在37℃、24 h能发酵乳糖、产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价公共场所浴盆、脸（脚）盆的卫生质量，推断右否被肠道致病菌污染的可能性。
4仪器和材料4.1 无菌滤纸片。
4.2恒温箱．4.3冰箱(0～4℃)。
大肠菌群的测定方法和步骤
大肠菌群的测定方法和步骤嘿，咱今儿就来聊聊大肠菌群的测定方法和步骤。
你说这大肠菌群啊，就像是一群调皮的小精灵，得把它们给找出来，弄清楚它们的情况呢！首先呢，得准备好各种各样的家伙什儿，就像战士上战场得拿好自己的武器一样。
什么培养皿啦、培养基啦，都得齐全咯。
然后呢，就是采样啦。
这可不能马虎，得从要检测的东西里面准确地取到样，就好像去果园里摘果子，得挑那些长得好的摘呀。
接下来就是培养啦。
把取来的样品放到合适的培养基里，给这些大肠菌群创造一个舒适的“家”，让它们能好好地生长。
这就好比给小树苗找了块肥沃的土地，让它们能茁壮成长。
培养的过程中可得细心照料着，温度啦、湿度啦都得控制好。
不然这些小精灵可不乐意好好表现呢。
过了一段时间后，就得去观察啦。
看看培养基上有没有出现那些特征性的菌落。
这就像是在一群孩子里面找那个最调皮的。
要是发现了可疑的菌落，还得进一步去验证呢。
就跟警察破案似的，得找到确凿的证据才能下定论。
最后确定了大肠菌群的情况，咱就能知道这个东西是不是干净卫生啦。
这可关系到大家的健康呢，可不是闹着玩的。
你想想啊，如果吃的东西或者用的东西里面大肠菌群超标了，那会咋样？那肯定会让人不舒服呀，说不定还会生病呢！所以说这个测定大肠菌群的事儿可重要了。
咱平时买东西的时候也得留个心眼，看看是不是经过严格检测的。
别稀里糊涂地就买了那些不靠谱的东西。
总之呢，大肠菌群的测定可不是个简单的事儿，但又特别重要。
咱得重视起来，把这些小精灵都给管得服服帖帖的，让大家都能吃得放心，用得安心，你说是不是？这可不是开玩笑的呀！。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
公共场所毛巾、床上卧具微生物检验方法 大肠菌群测定
GB/T 18204. 5-2000前言为贯彻执行《公共场所卫生管理条例》和GB 9663～9673-1996、GB 16153-1996《公共场所卫生标准》，加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准。
本标准中的方法是与GB 9663～9673-1996、GB 16153-1996相配套的监测检验方法。
本标准第一法为仲裁法。
本标准为首次发布。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：江苏省卫生防疫站、广东省卫生防疫站、天津市卫生防疫站。
本标准主要起草人：符晓梅、封幼玲、杭万双、蔡玟、张淑兰。
中华人民共和国国家标准公共场所毛巾、床上卧具微生物检验方法大肠菌群测定Methods of microbiological examinationfor towel and bedclothes in public places-Determination of Coliform bacteriaGB/T 18204. 5-20001 范围本标准规定了公共场所毛巾、床上卧具大肠菌群的测定方法。
本标准适用于公共场所内公用毛巾、床上卧具大肠菌群的测定。
2引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。
本标准出版时，所示版本均为有效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 18204. 3-2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定3定义本标准采用下列定义。
大肠菌群coliform bacteria指一群在37℃、24 h能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价公用毛巾、床上卧具的卫生质量。
4 仪器见GB/T 18204. 3-2000中第3章。
5培养基和试剂见GB/T 18204. 3-2000申第4章。
6检验程序见GB/T 18204. 3-2000中第5章。
7操作步骤7.1 采样方法7.1.1 随机法：随机抽取清洗消毒后准备使用的毛巾、床上卧具。
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1、目的
依据GB/T18204.3—2000公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。
2、适用范围
本标准规定了公共场所内公用茶具大肠菌群的测定方法。
3、责任
使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。
4、内容：
4.1定义：大肠菌群
指一群在37℃、24h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。
4.2 仪器：
高压蒸汽灭菌器。
干热灭菌箱。
培养箱：36℃±1℃。
冰箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿：直径9cm。
灭菌刻度吸管：1mL,10mL。
灭菌棉拭子。
灭菌剪刀。
PH计或精密PH试纸。
4.3 培养基和试剂：
4.3.1乳糖胆盐发酵培养液
4.3.1.1成分：
蛋白胨20g
猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g
乳糖10g
0.04%溴甲酚紫水溶液25ml
蒸馏水1000ml
4.3.1.2制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH值至7.4，加溴甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10ml，在115℃高压灭菌15分钟。
（注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍）
4.3.2伊红美兰琼脂
4.3.2.1成分：
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂17g
2.0%伊红水溶液20ml
0.65%美蓝溶液10ml
蒸馏水1000ml
4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。
121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。
4.3.3乳糖发酵管
4.3.3.1成分：
蛋白胨20g
乳糖10g
0.04%溴甲酚紫水溶液25ml
蒸馏水1000ml
4.3.3.2制法：将蛋白胨和乳糖溶于水中，调pH值至7.4，加入指示剂，分装到带有倒管
的试管中，每管3ml，在115℃高压灭菌15分钟。
4.3.4革兰氏染色液
4.3.4.1结晶紫染色液：
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
4.3.4.2革兰氏碘液：
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
4.3.4.3脱色液：95%乙醇
4.3.4.4沙黄复染液：
沙黄0.25g
95%乙醇10ml
蒸馏水90ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.3.5染色法
4.3.
5.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗。
4.3.
5.2滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗。
4.3.
5.3滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗。
4.3.
5.4滴加复染液，复染1分钟，水洗，待干，镜检。
4.3.6染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
4.3.7大肠菌群快速检验纸片
4.3.7.1质量要求：纸片必须符合食（饮）具用大肠菌群快速检验纸片质量标准。
4.3.7.2质量标准：每张纸片5c m×5cm，pH值7.0～7.4，包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。
4.4 检验程序：
大肠菌群检验程序如下：
见GB/T 18204.3—2000中第5章。
4.5 操作步骤
4.5.1 采样方法
4.5.1.1 随机法：随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具。
4.5.1.2 涂抹法：使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。
4.5.1.3 纸片法：用灭菌生理盐水湿润5cm×5cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30s后取下，置于无菌塑料袋内。
4.5.2 检验方法
4.5.2.1 发酵法
4.5.2.1.1 用测定细菌总数剩余的检样，倒入双料乳糖胆盐发酵培养液中。
置36℃±1℃培养箱内培养24h。
4.5.2.1.2 观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测是检验阳性。
如不产酸、产气则为大肠菌群阴性。
4.5.2.1.3 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。
4.5.2.1.4 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行染色镜检；
同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养24h。
4.5.3 纸片法
将已采样的纸片置36℃±1℃培养箱内培养16～18 h，观察结果。
4.6 结果报告
4.6.1发酵法
凡乳糖发酵管最终产酸、产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。
4.6.2纸片法
纸片保持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性；纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。