蚕豆多倍体植物的诱导及其鉴定实验方案
实验二十一 多倍体的人工诱发和鉴定
实验二十一多倍体的人工诱发和鉴定【实验目的】1、通过实验掌握诱导植物多倍体的方法和技术，观察多倍体的特点及染色体加倍后的细胞学表现；2、学习植物材料的固定方法和常规压片技术；3、利用染色体分析的方法对多倍体的细胞做出准确判断。
【实验原理】各种生物细胞中的染色体数目一般是恒定的，在自然因素和人工诱变因素（物理的、化学的）作用下，生物体细胞中的染色体数目也会发生变异，从而导致生物性状、育性、生活力等一系列改变。
多倍体是指具有了三套或三套以上完整染色体组的个体，分为三类。
同源多倍体（autoploid）：是指增加的染色体组来自同一物种（如水稻的同源三倍体、同源四倍体等）。
异源多倍体：是指增加的染色体组来自不同的物种（如普通栽培小麦）。
同源异源多倍体；是指使异源多倍体的染色体数再加倍所得个体，如人工合成的八倍体小粒野生稻。
自然发生多倍体的概率很低，如水稻中发生同源三倍体的频率为1/50000~1/30000。
利用一些诱发因素可以人工诱变植物产生多倍体，这些因素包括物理的温度剧变、机械损伤、各种射线处理等，还有化学因素，如植物碱、麻醉剂、植物生长激素等处理方法。
其中，秋水仙素（colchicine）是诱导多倍体形成最为有效和常用的药品之一。
它是从百合科植物秋水仙属秋水仙（Colchicum autumnale）的种子和鳞茎中提炼出来的一种植物碱，对植物种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等都可产生诱变作用，其分子式C22H25NO6。
商品秋水仙素为淡黄色粉末，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，但在热水中溶解度较低，不易溶于苯和乙醚。
毒性极强，可导致眼睛暂时失明及使中枢神经系统麻痹而导致呼吸困难。
使用时要注意安全并需做好药品管理工作。
一般认为，秋水仙素的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能向两极移动而被阻止在中期，染色体数目加倍，当秋水仙素处理停止后，细胞继续分裂，就形成多倍体的组织。
若多倍体组织分化产生的是性细胞，则所产生的配子也是多倍性的，因而可以通过有性生殖途径把多倍体特性遗传下去。
蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计方案
蚕豆多倍体诱导和鉴定实验设计方案一、实验目的初步认识化学诱发植物多倍体的过程，学习利用孚尔根反应（染色）鉴定多倍性细胞的方法。
二、实验材料：蚕豆根尖三、实验药品及工具：生物显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、小玻璃瓶、小酒杯、培养皿、恒温箱、0.1%-0.2%秋水仙碱溶液、希夫氏试剂（是一种将碱性复红在酸性溶液中以过剩的亚硫酸（亚硫酸氢钠等）脱色的试剂）、纯净水、1mol 1-1盐酸等四、实验原理：多倍体的发生，尤其是异源多倍体的产生是生物进化的重要途径之一。
正常细胞的有丝分裂，在中期已复制为两的染色体，都集中于中央赤道板上，染色单体由于纺锤丝的牵引至后期分别趋向细胞两级。
纺锤丝主要化学组成为蛋白质。
一般认为蛋白质分子中的二硫键可以被细胞中辅酶的-SH（巯基）还原，于是由分子内的二硫键转变为分子间的二硫键，从而使蛋白质分子聚合。
凡是能抑制巯基作用又能保持细胞活性的物质，就能阻止蛋白质分子聚合或使已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚作用，致使纺锤丝不能形成或断裂，从而消失，造成染色单体不能分向细胞两极，细胞质也不分离，复制的染色体仍存在于一个细胞中，结果染色体倍增。
如果该细胞在下一次细胞分裂时又经药剂作用，则可产生更高倍数的细胞，（一般成等比级数增加，但也会出现奇数倍或非整倍现象，且由于药物的毒性作用染色体不会无限止的增多），这样就形成了多倍性细胞。
在药剂作用的过程中，由于同一组织中的不同细胞有丝分裂的不同步性，而出现加倍程度不一的表现，这种现象称为混倍性（混倍现象）。
经加倍了的细胞，一旦停止药剂作用，仍能进行正常的有丝分裂。
由此而产生的子细胞，一般说都是多倍性细胞，从这种细胞分化出来的植株，就是多倍体。
人工诱发多倍体的方法很多，分为物理的（变温、机械损伤、射线处理等）和化学的，我们常采用秋水仙素来进行诱导，这是诱发多倍体最有效的方法，此外还有六氯代苯、a-溴代萘、对-二氯代苯、申苯磺硫苯胺基苯汞(富民隆的主要成分)等化学物质均有此作用。
“秋水仙素诱发蚕豆多倍体实验”中诱发因素最佳组合的探索
“秋水仙素诱发蚕豆多倍体实验”中诱发因素最佳组合的探索赵锦慧【摘要】以蚕豆为材料,选用秋水仙素的5个浓度(0.025％,0.050％,0.100％,0.150％,0.200％)和4个诱导时间(12,24,48,60 h)进行配组,通过调查不同组合处理下根尖诱导率、胚根膨大率、胚根细胞染色体数目、幼叶气孔数目、保卫细胞大小、胚根数目和幼苗高度的变化,研究秋水仙素诱发蚕豆胚根多倍体的最佳处理浓度与处理时间组合.结果表明,秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最适处理时间为48 h,最佳处理浓度为0.100％.在秋水仙素处理下,蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率升高,根尖细胞染色体数目增多,气孔数量减少,保卫细胞变大,胚根数量减少,幼苗高度降低.蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率、气孔数量在秋水仙素不同处理浓度、不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异显著,胚根数量、幼苗高度在秋水仙素不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异不显著,但不同处理浓度之间差异显著.【期刊名称】《周口师范学院学报》【年(卷),期】2015(032)002【总页数】5页(P102-106)【关键词】蚕豆;多倍体;胚根;秋水仙素【作者】赵锦慧【作者单位】周口师范学院生命科学与农学学院,河南周口466001【正文语种】中文【中图分类】Q3-3高等植物染色体进化有一个显著的特征即染色体会加倍,植物染色体加倍后可以使植物的生态适应力和对逆境的抗性增强.主要表现为对环境的适应性增强,抗寒、抗旱及抗病虫害的能力增强[1-3].目前,秋水仙素是使用最多、应用最广泛的化学诱导剂.在一定的浓度范围内,秋水仙素对培养材料没有特殊要求,能明显提高新生细胞的染色体加倍诱导率,经秋水仙素处理后的细胞在正常条件下又可以恢复正常分裂.诱导多倍体时,为了保证有较高的成功率,往往对秋水仙素的处理浓度和处理时间组合要求比较高[4].因此,实验室急需解决的问题就是针对某种植物,选出最适合的诱导方法进行多倍体植株的诱导,并因此获得稳定生长的多倍体植株[5].本实验以蚕豆胚根膨大率和胚根诱导率为指标,再通过染色体的倍性变化、保卫细胞大小的变化及气孔大小对多倍体诱导结果进行鉴定.同时,对诱导出的蚕豆多倍体植株的胚根和幼苗的生长状况进行调查分析,旨在筛选秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最佳处理浓度和处理时间组合,为秋水仙素诱导蚕豆多倍体提供最佳的实验方案.1 材料与方法1.1 材料蚕豆种子,购于周口市种子公司.1.2 方法1.2.1 种子处理、胚根培养及秋水仙素处理[6]将蚕豆种子洗净,用5%次氯酸钠消毒1 h,在室温(25℃)下浸种24 h后光照培养.胚根长至1.5 cm左右时,选取长势一致的种子分成6组,分别用0.000%,0.025%,0.050%,0.100%,0.150%,0.200%的秋水仙素溶液浸泡.每组又分成4份,各份处理时间分别是12,24,48,60 h,“浓度×时间”共24个处理组合,以上每份处理50粒种子,处理后一半种子用于细胞学观察,一半土培,长出幼苗后调查苗高和胚根的数量.1.2.2 形态学上对蚕豆多倍体诱导结果的鉴定统计胚根诱导率和胚根膨大率,在形态上对蚕豆多倍体诱导结果进行鉴定.胚根膨大率(%)=(根尖膨大后离根尖2 cm处的周长-对照组相应位置的周长)/对照组相应位置的周长×100.根尖诱导率(%)=(诱导膨大的根尖/对照组根尖总数)×100[7].当蚕豆根尖处理到第10 d和第15 d时分别调查各处理组的胚根数量和苗高.1.2.3 细胞学上对蚕豆多倍体诱导结果的鉴定调查胚根细胞染色体数目、气孔及保卫细胞大小和数量,在细胞学上对蚕豆多倍体诱导结果进行鉴定.胚根细胞染色体数目的鉴定方法为:取各处理组胚根20条,用卡诺氏固定液固定10 h后用蒸馏水冲洗2～3 min,然后用l mol/L的盐酸在60℃水浴中解离20 min,蒸馏水洗涤3～5次,用刀片将蚕豆根尖纵切3～4片,最后用改良的苯酚品红溶液染色8～10 min,压片后在光学显微镜下观察[8,9].从每个处理中随机选择20个制片进行统计,共统计100个处于分裂中期的细胞以及其中染色体加倍的细胞.气孔及保卫细胞数量的鉴定方法为:各处理幼苗长出2～3片幼叶后,用刀片把第2片幼叶的上表皮及叶肉刮去,剩余的下表皮用改良的苯酚品红溶液染色,光学显微镜下观察气孔及保卫细胞的大小,并调查10×40倍光学显微镜下20个视野内的各处理平均气孔及保卫细胞的数目.1.2.4 数据分析方法用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计分析,并用Duncan法进行多重比较.2 结果与分析2.1 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆根尖诱导率的影响秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆根尖诱导率的统计结果见图1.由图1可以看出,蚕豆根尖诱导率随秋水仙素处理浓度的增加呈现先升高后降低的趋势.秋水仙素处理浓度为0.100%时,根尖诱导率最大;秋水仙素处理浓度为0.200%时,根尖诱导率最小;秋水仙素处理浓度为0.025%～0.100%时,根尖诱导率升高趋势明显;处理浓度为0.150%～0.200%时,根尖诱导率下降趋势明显.随处理时间的延长蚕豆根尖诱导率呈上升趋势,处理60 h时根尖诱导率最大,12 h时根尖诱导率最小,在12～48 h之间根尖诱导率变化明显,而48～60 h之间变化不明显.这表明蚕豆根尖诱导率在不同诱导时间和诱导浓度之间差异明显.这与郭英等[10]以及胡洲鹤等[11]研究结果相似.2.2 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根膨大率的影响秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆胚根膨大率的统计结果见图2.由图2可知,随秋水仙素处理浓度的增加,蚕豆胚根膨大率呈先升高后降低的趋势.秋水仙素处理浓度为0.100%时,胚根膨大率最大;处理浓度为0.200%时,胚根膨大率最小;处理浓度为0.025%～0.100%时,胚根膨大率升高趋势明显;处理浓度为0.150%～0.200%时,胚根膨大率下降趋势明显.随处理时间的延长蚕豆胚根膨大率呈上升趋势,处理60 h时胚根膨大率最大,12 h时胚根膨大率最小,在12～48 h之间胚根膨大率变化明显,而48～60 h之间变化不明显.这表明蚕豆胚根膨大率在不同诱导时间和诱导浓度之间差异明显.这与闫秋洁等[7]研究结果相似.图1 秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆根尖诱导率图2 秋水仙素不同处理浓度与处理时间下蚕豆胚根膨大率2.3 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根细胞染色体数目的影响调查发现,秋水仙素不同处理浓度与处理时间下,蚕豆胚根根尖细胞染色体有加倍现象,既有二倍体(2n=12),又有四倍体(4n=24)和八倍体(8n=48),但未发现异形染色体,也未发生染色体交叉丢失现象.这表明用秋水仙素诱导处理后除倍性发生变化外,染色体其余特征均与二倍体表现一致.这与陈高等[12]以及郑宝强等[13]研究结果相似.2.4 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼叶气孔数量的影响秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼叶气孔数量的影响见图3.由图3可知,与对照相比,秋水仙素各种处理下,幼叶的气孔数量明显减少.在10×40倍显微镜下,处理组一个视野内平均气孔数约为3～4个,而对照组平均约5个.方差分析结果表明,气孔数量在不同的诱导时间、诱导浓度之间以及“时间×浓度”之间差异显著(见表1).多重比较结果表明,处理时间为12 h和24 h时差异不显著,48 h和60 h 时差异也不显著,但12～24 h与48～60 h之间差异显著(见表2).处理浓度为0.025%时气孔数量最多,与0.050%,0.100%浓度下的气孔数量差异显著,0.100%时气孔数量最少,但与0.050%,0.150%和0.200%之间的气孔数量差异不显著.这与陈发棣等[14]、阎志红等[15]及王鸿鹤等[16]研究结果相似.图3 各种处理下一个视野内的平均气孔数目(10×40倍显微镜下观察)2.5 秋水仙素不同处理浓度下保卫细胞大小变化10×40倍显微镜下观察到,在秋水仙素不同处理浓度下,处理组与对照组相比,保卫细胞均有不同程度地变大.在0.100%水平处理下保卫细胞最大.这与李晓艳等[17]研究结果相似.2.6 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗高度的影响秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗高度的影响见图4、图5.对图4、图5数据进行方差分析和多重比较,分析结果见表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,经秋水仙素处理10 d和15 d后,幼苗的高度在各处理时间之间以及“时间×浓度”之间差异不显著,但各处理浓度之间差异显著,并且随着处理浓度升高苗高呈降低趋势.秋水仙素处理10 d后,苗高在0.025%时最高,在0.200%时最低.苗高在0.100%和0.150%之间差异不显著,其他处理浓度之间差异均显著.秋水仙素处理15 d后,2个相邻的处理浓度之间无显著差异,但相隔的处理浓度之间有显著差异.这与陈绍潘等[18]及匡全等[19]研究结果相似.2.7 秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆幼苗胚根数量的影响秋水仙素不同处理浓度与处理时间对蚕豆胚根数量的影响结果见表1、表2、表3.由表1、表2、表3知,经秋水仙素处理10 d和15 d后,胚根数量在各处理时间之间、各处理浓度之间以及“时间×浓度”之间差异不显著,但对照组与各处理组之间差异极显著.即在秋水仙素处理下,蚕豆幼苗胚根生长严重受到抑制.这与张素芝等[20]研究结果相似.图4 10 d后各处理下的幼苗高度图5 15 d后各处理下的幼苗高度表1 秋水仙素不同处理时间和处理浓度下各变量的方差分析注:表中数据小于0.05者表示差异显著(P＜0.05).变异来源诱导时间诱导浓度诱导时间×_____________________________________________________诱导浓度根尖诱导率∕% 0.000 0.000 0.007胚根膨大率∕% 0.000 0.000 0.000气孔数量∕个 0.000 0.000 0.006 10 d后胚根数量∕个 0.168 0.000 0.315 15 d后胚根数量∕个 0.738 0.000 0.870 10 d后幼苗高度∕cm 0.185 0.000 0.059 15 d后幼苗高度∕cm_0.635______0.000_____________0.7932.8 秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最佳“处理时间×处理浓度”组合的确定秋水仙素诱导蚕豆多倍体的处理浓度和处理时间之间的互作见表1.由表1可以看出,在2种因素共同作用下,根尖诱导率和胚根膨大率与对照相比均达到显著水平,再结合多重比较结果,确定秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最适处理时间为48 h,最佳处理浓度为0.100%.3 讨论本实验结果表明,在秋水仙素处理下,蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率升高,根尖细胞染色体数目增多,气孔数量减少,保卫细胞变大,胚根数量减少,幼苗高度降低.蚕豆根尖诱导率、胚根膨大率、气孔数量在秋水仙素不同处理浓度、不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异显著.胚根数量、幼苗高度在秋水仙素不同处理时间、不同“处理时间×处理浓度”组合之间差异不显著,但不同处理浓度之间差异显著.秋水仙素诱导蚕豆多倍体的最适处理时间为48 h,最佳处理浓度为0.100%. 表2 秋水仙素不同处理时间下各变量的多重比较注:同列比较,字母相同者表示差异不显著(P＞0.05),字母不同者表示差异极显著(P＜0.01),下表同.时间/h 根尖诱导率∕%______胚根膨大率∕%______气孔数量∕个_____10 d后胚根数目∕条_____15 d后胚根数目∕条_____10 d后幼苗高度∕cm_____15 d后幼苗高度∕cm__12 0.340C 0.326D 4.224A 3.600A 4.320A 2.323A 3.643A 24 0.477B 0.413C 4.203A 4.210A4.520A 2.586A 3.786A 48 0.563A 0.514B 3.893B 3.700A 4.290A 2.635A3.685A__60______0.572A____0.623A____3.828B______4.350A________4.4________ _____________________30A_2.279A3.325A表3 秋水仙素不同处理浓度下各变量的多重比较秋水仙素诱__导浓度_______∕%根尖诱导率∕%_____胚根膨大率∕%_____气孔数量∕个_____10 d后胚根数目∕条______15 d后胚根数目∕条_____10 d后幼苗高度∕cm_____15 d后幼苗高度∕cm__0.0000.000D 0.000C 5.923A 18.270A 20.620A 4.430A 7.130A 0.025 0.574B 0.624A 3.794B 1.280B 1.230B 3.230B 4.325B 0.050 0.640A 0.613A 3.565C 1.400B1.360B2.554C3.436BC 0.100 0.668A 0.627A 3.535C 1.100B 1.000B 1.890D2.674CD 0.150 0.524BC 0.493B3.695BC 1.120B 1.070B 1.580D2.317DE___0.200________0.463C____0.493B___3.664BC______1.160B_________________________________________1.210B_1.060E__ 1.623E秋水仙素是一种作用于微管的特异性生物碱,秋水仙素能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期.秋水仙素有剧毒,处理太长时间会对处理的植物产生毒害作用,但秋水仙素不论是破坏还是抑制纺锤体的形成,作用都是一时的,去除秋水仙素后细胞可以恢复正常的分裂[21].从实验结果可以看出,当秋水仙素处理浓度一定时,植株细胞加倍率会随处理时间的延长呈现上升的趋势,在处理时间一定时,细胞染色体的加倍率会随浓度的上升而呈现出先上升后下降的趋势,所以应权衡诱导时间和诱导浓度之间的平衡,选择最适宜的组合进行处理.本实验中秋水仙素溶液处理蚕豆胚根的最佳浓度是0.100%,最佳时间是48 h.这是因为秋水仙素对植株细胞有一定的毒害作用,诱导浓度过大或诱导时间过长都会影响到植株的正常生长,既不会诱导发芽,也不会诱导膨大.多倍体诱导的细胞学鉴定表明染色体会加倍,在二倍体的基础上出现了四倍体和八倍体.这是因为秋水仙素抑制了纺锤丝的形成,导致染色体不能移向两级,故出现了染色体加倍的情况[21].表型特征反映遗传特征,表型变异特征可作为鉴定的一个形态学指标来反映遗传特征[22].用秋水仙素处理后,保卫细胞数量减少,体积变大,这是因为秋水仙素诱导染色体加倍,细胞核的体积增大,各种细胞器也随之增大,故保卫细胞增大.秋水仙素浓度过高时会抑制胚根的形成和发育从而影响胚根的数量,而胚根的数量和植物吸收矿质元素息息相关,会影响到植株的生长发育.处理组的苗高和胚根数量明显低于空白组,是因为有些残留在组织内的秋水仙素比较容易向植物分生组织中运输积累,抑制了茎的分生生长.但是这些形态变异是否会影响到多倍体植株的生殖发育,是否能形成稳定的多倍体后代,仍需进一步研究.参考文献:[1]康向阳.林木多倍体育种研究进展[J].北京林业大学学报,2003,25(4):71-74.[2]雷家军,王冲.观赏植物多倍体诱导研究进展[J].东北农业大学学报,2012,43(1):18-24.[3]李云,冯大领.木本植物多倍体育种研究进展[J].植物学通报,2005,22(3):375-382.[4]赵阳,黄韬.秋水仙素在园艺植物多倍体育种中的应用研究进展[J].上海蔬菜,2010(2):29-31.[5]闫辉,张利,于淑惠,等.秋水仙素诱导白皮松多倍体的研究[J].山东农业大学学报,2012,43(2):184-188.[6]常青云,朱莉思,曹鑫,等.多因素对秋水仙素诱导多倍体效率的影响[J].安徽农业科学,2007,35(37):9863-9866.[7]闫秋洁,杨琼.秋水仙素对蚕豆胚根生长的影响及多倍体诱导效应分析[J].广西植物,2012,32(5):386-391.[8]黄永莲,胡木.秋水仙素对洋葱根尖细胞的诱变效应[J].亚热带植物科学学报,2005,34(1):4245.[9]李政,黄静洁,李凌.秋水仙碱诱变绿玉树多倍体研究[J].西南大学学报,2007,29(2):107-109.[10]郭英,梁国鲁.小叶绿萝同源多倍体诱导研究初报[J].西南农艺,2002,30(4):1-3.[11]胡洲鹤,覃子海,蔡玲.秋水仙索诱导桉树多倍体的初步研究[J].广西林业科学,2004,33(4):195-203.[12]陈高,孙卫邦.秋水仙素诱导七里香多倍体[J].植物生理学通讯,2006,42(2):229-231.[13]郑宝强,张莹,王雁,等.春石斛的多倍体诱导[J].园艺学报,2009,36(9):1381-1384.[14]陈发棣,蒋甲福,房伟民.秋水仙素诱导菊花多倍体的研究[J].上海农业学报,2002,18(1):46-50.[15]阎志红,刘文革,赵胜杰,等.利用二硝基苯胺类除草剂离体诱导西瓜四倍体[J].园艺学报,2008,35(11):1621-1626.[16]王鸿鹤,葛欣,徐启江,等.秋水仙碱诱导重瓣大岩桐多倍体的研究[J].热带亚热带植物学报,1999,7(3):237 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不同植物同源多倍体的诱发与鉴定实验设计
不同植物同源多倍体的诱发与鉴定实验设计引言：植物的多倍化是指由于染色体加倍而产生的具有多个完整染色体组的个体。
不同植物的同源多倍体（autopolyploid）可以通过各种实验诱发和鉴定，本文将就多种诱发和鉴定方法进行阐述。
一、诱发同源多倍体的方法1. 化学诱导：可以通过化学物质诱导多倍化，如染色体稳定化剂Colchicine、Oryzalin等。
将适宜的浓度的诱导剂溶液喷洒到植株的叶片上，使其通过气孔进入植物体内，引发多倍化。
2. 温度诱导：某些植物的花粉直接暴露在高温中，能够诱发染色体变异，进而产生同源多倍体。
诱导温度通常为35-36℃，持续时间为数小时。
3. 辐射诱导：辐射可以直接或间接地引发染色体变异，造成多倍化。
常用的辐射源包括 X 射线、γ 射线、紫外线等。
4. 细胞学处理：通过细胞培养技术，可以利用化学物质、温度或辐射等对植物细胞进行处理，再通过诱导分化和植株再生获得多倍化植株。
二、鉴定同源多倍体的方法1. 核型分析：利用生物学核型技术，可以观察染色体数目和结构是否有变化。
常用的核型分析方法有染色体计数法和比较基因组杂交法。
2. 组织学观察：通过石蜡切片技术，观察植物组织的细胞形态和染色体数目。
不同倍化水平的同源多倍体在细胞外观和染色体数目上会有明显差异。
3. 分子标记分析：利用分子标记技术，如RAPD、SSR等，可以对同源多倍体的基因组进行分析，寻找遗传多样性和差异。
4. 表型观察：观察同源多倍体在形态、生理和生殖方面的变化，通过与野生型或同源单倍体进行比较，寻找差异。
结论：通过化学诱导、温度诱导、辐射诱导和细胞学处理等方法可以实现同源多倍体的诱发，而通过核型分析、组织学观察、分子标记分析和表型观察等方法可以对诱发的同源多倍体进行鉴定。
这些方法的综合应用可以帮助我们更好地理解同源多倍体的形成机制和遗传特征，为植物进化和育种工作提供理论和实践上的指导。
参考文献：1. 黄凤林, 柯华军, 林一明. 植物同源多倍体的诱导及鉴定[J].热带农业科学, 2007, 27(3): 202-207.2. 吴访苏, 韦佳伟, 郭少婵, 等. 植物染色体工程方法优化及染色体在植物生产中的应用[J]. 生物技术通讯, 2020, 31(6): 716-721.3. Li H, Li W, Hu G, et al. Advances on Induction and Identification of Autotetraploid Plants[J]. Molecular Plant Breeding, 2021, 19(4): 1929-1937.4. Jiang J, Gill B S. Different Species-Specific Chromosome Translocations in Triticum timopheevii and Triticum turgidumSupport the D-RNA Model for Nonhomologous Chromosome Synapsis[J]. Genetics, 1994, 15(1): 215-227.。
不同植物同源多倍体的诱发与鉴定实验设计
不同植物同源多倍体的诱发与鉴定实验设计要诱发和鉴定不同植物的同源多倍体，可以采用以下实验设计：1. 选择合适的植物材料：选择目标植物的种子、嫩芽或离体培养的组织为实验材料。
确保材料的品种和来源可靠。
2. 细胞处理：将植物材料经过适当的处理来诱导多倍体形成。
常用的处理方法包括化学处理、物理处理和生物处理等。
- 化学处理：使用合适的化学物质，如染色剂（如染色体特异性染料）或化学诱导剂（如某些植物生长调节剂），浸泡、喷洒或处理材料，以促进细胞的多倍化。
- 物理处理：利用离子辐射（如X射线或γ射线）或化学物理处理（如温度、压力）等方法，对植物材料进行处理，诱发细胞的多倍化。
- 生物处理：利用植物病原微生物（如农杆菌）或共生微生物（如植物内生菌）等与植物进行交互作用，诱导细胞多倍化。
3. 培养条件的优化：根据目标植物的生长习性和需要，对培养基的成分、光照条件、温度和湿度等进行优化调整，以促进多倍体形成和生长。
4. 细胞倍化检测：使用适当的细胞学方法来检测和鉴定多倍体细胞。
常用的方法包括：- 核型分析：通过染色体制备和染色，观察细胞的染色体数目和结构，来确定是否形成了多倍体。
- 流式细胞术：利用流式细胞仪分析细胞的DNA含量，多倍体细胞的DNA含量会相应增加。
- 核型鉴定：利用核型学方法，如比较基因组杂交或分子标记技术，检测植物材料的基因组组成和倍性。
5. 多倍体植株的筛选与培养：鉴定出多倍体细胞后，将其分离培养，筛选并培养出稳定的多倍体植株。
在进行实验设计时，应注意对照组的设置，以确保结果的可靠性和准确性。
同时，要充分记录实验过程和结果，以便进行数据分析和后续研究。
此外，还应考虑实验的重复性和统计学分析，以提高实验结果的可信度。
实验五 植物多倍体的诱导及细胞学鉴定
实验五植物多倍体的诱导及细胞学鉴定一、实验目的（1）掌握人工诱导多倍体的方法和技术，观察多倍体的特点及染色体加倍后的细胞学表现。
（2）了解染色体数目变异的鉴定方法二、实验原理生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，但在特定的条件下，染色体的数目变异可分为整倍体变异和非整倍体变异，以体细胞中的染色体数（2n）为基础增减了个别染色体就是非整倍体变异，如单体2n-1、缺体2n-2（1）、三体2n+1、双三体2n+1+1、四体2n+2（1）等。
以染色体组或组内染色体基数（x）为基础成倍地增减，这是整倍体变异，如一倍体x、二倍体2x、三倍体3x四倍体4x等。
三倍体以上的生物体统称多倍体。
多倍体又可分为同源多倍体和异源多倍体。
同源多倍体是指具有三个或三个以上相同染色体组的细胞或个体，其增加的染色体组来自同一物种，一般是由二倍体的染色体直接加倍产生的。
异源多倍体是指增加的染色体组来自不同物种，一般是由不同种属间的杂交种通过染色体加倍而形成。
自然界有许多植物是多倍体，是变异发生的重要途径之一。
多倍体可自然发生，也可人工诱导。
人工诱导多倍体可以采用物理方法(如高温、低温和射线等处理)和化学方法(如秋水仙碱、植物激素等处理)。
其中，应用最广泛的是秋水仙碱处理。
秋水仙碱处理的有效质量浓度为0.1~4g/L，常用2g/L秋水仙碱溶液浸泡、涂抹或点滴等方式处理植物的分生组织。
不同植物材料的最适处理质量浓度和时间不同，需通过试验来确定。
多倍体的鉴定方法主要有细胞学鉴定和形态学鉴定。
细胞学鉴定是观测根尖、茎尖分生组织或花粉母细胞的染色体数目，是一种直接的鉴定方法；形态学鉴定是观测叶片气孔保卫细胞的大小及其叶绿体数目，花、果实、种子的形态，花粉粒的大小和姓等性状的变异，是一种间接的鉴定方法。
通常多倍体植物的气孔、花器、花粉种子，果实等明显变大，气孔数目减少而密度变稀，同源多倍体可形成部分畸形的不育花粉粒，育性有一定的降低。
三、实验材料洋葱（2n= 16）、小麦（ 2n= 42）、玉米（2n=40）、水稻（2n=24）、蚕豆（2n=12）等植物的种子均可作为实验材料。
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案一、研究目的本试验的目的是通过多倍体诱导和鉴定，获得蚕豆的多倍体植株，并分析其对产量和抗逆性能的影响。
二、试验方法1.材料准备选取蚕豆品种，如“春蚕”等，作为试验材料。
选取健康、无病虫害的蚕豆种子作为试验材料。
2.多倍体诱导将种子表面用70%酒精消毒，然后用1%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后用无菌水洗净。
将种子置于层析纸上进行萌发，待种子萌发出完整的胚芽后，将其转移到含有2mg/L 2,4-D的MS培养基中进行培养。
培养基的pH值为5.8，培养温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光周期为16h 光照/8h黑暗。
3.多倍体鉴定对培养基中生长的组织进行染色体观察，以确定其倍性。
通过标准的细胞学方法，如根尖细胞准备、染色、显微镜观察等进行多倍体鉴定。
4.产量和抗逆性能测试将多倍体和野生型蚕豆植株种植在相同的环境条件下，每个处理设置3个重复。
在不同的生长期，如花期、结荚期和成熟期，对植株进行测量和观察。
测量产量指标，如单株产量、荚果长度、荚果宽度等，同时评估抗逆性能，如抗病性、抗旱性等。
三、数据分析收集产量和抗逆性能的数据，并进行统计分析。
使用SPSS等统计软件进行方差分析，比较多倍体和野生型蚕豆之间的差异。
根据数据分析的结果，评估多倍体对蚕豆产量和抗逆性能的影响。
四、预期结果预期多倍体蚕豆较野生型蚕豆在产量和抗逆性能方面有所提高。
通过多倍体诱导和鉴定试验，可以得到具有更高产量和更强抗逆性的蚕豆品种。
五、试验注意事项1.培养基的配制和无菌操作要严格遵守操作规程，以保证试验的准确性。
2.多倍体鉴定时，要充分观察染色体的形态和结构，进行准确的判定。
3.每个处理的重复应设置合适，以提高结果的可靠性。
4.在进行抗逆性能测试时，要注意环境条件的一致性，以消除环境因素对结果的影响。
六、试验的意义通过多倍体诱导和鉴定试验，可以培育出具有良好产量和抗逆性能的蚕豆品种。
这对于提高农作物产量和抗病虫害能力具有重要意义，也为蚕豆的栽培和利用提供了有效的技术支持。
低温诱导植物细胞染色体数目加倍
低温诱导植物细胞染色体数目加倍一、实验目的1．了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的作用。
2．应用植物染色体制片技术，鉴别诱导后染色体数目变化。
3．学会探究性实验的设计方法。
二、实验原理通过低温阻碍细胞内酶促反映的进行，从而导致细胞分裂时形成纺锤体所需ATP的供应途径受阻，使细胞分裂过程中完成染色体加倍而细胞不能分裂，达到染色体数目加倍。
从理论上讲，观察染色体数目的最佳时期是分列中期，可当纺锤体的行成受到抑制时，细胞分裂就停止在了前期，不再出现中期、后期，只有当细胞分裂进入到第二周期的中期时，才能确保低温诱导染色体数目变化的成功。
因此，低温处理的时间至少要有一个半周期的时间。
低温抑制了纺锤体的形成，同时也降低了酶的活性，细胞分裂的速度减慢，细胞周期会延长。
三、实验仪器与试剂1.材料：蚕豆2.试剂：秋水仙素3.仪器：超低温冰箱四、实验步骤与方法（1）培养根尖蚕豆种子于 30℃～ 40℃水浴中浸种 3 ～ 4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每 2d 换一次水。
注意水要浸过蚕豆种子体积的 1/3。
(2)低温诱导处理待实验材料长出约 1cm 左右根时，将实验材料平均分两组: 实验组于2℃的冰箱中进行低温诱导培养 36h 后( 换水时注意用 2℃的水，减小实验的误差) ，于15℃～20℃恢复常温培养 10 ～12h( 即小于实验材料一个细胞周期的时间) 。
对照组于15℃～ 20℃常温进行培养，注意经常换水。
(3)取材、固定、解离、漂洗与染色常规“植物细胞有丝分裂”制片方法［1］。
(4)显微观察与数据统计分析随机观察并统计10 个视野中分裂期和非分裂期细胞，计算分裂指数( mitotic index，MI) 。
细胞分裂指数 = 分裂期细胞数/全部细胞数×100%。
统计数据进行卡方检验。
五、实验记录( 1) 培养根尖蚕豆种子于 30℃～ 40℃水浴中浸种 3 ～ 4h 后，取出放入带有湿润纱布的培养皿中于10℃培养，每 2d 换一次水。
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蚕豆多倍体植物的诱导及其鉴定实验方案
实验组成员：姚燕兵李水琴
刘保兵郭欢
指导老师：许东风王安萍
一、实验目的：
通过实验掌握植物多倍体的方法和技术，掌握诱发多倍体的一般方法和观察植物染色体数目的变化引起植物和其他器官的变异。
了解人工诱导多倍体的原理，方法及其在植物育种上的意义
二、实验原理：
生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。
多倍体是细胞中具有3个或3个以上的染色体组的生物体。
自然界中有许多植物是多倍体，也是变异发生的重要途径之一。
多倍体在形态较二倍体植物个体大，叶片上的气孔也很大，较易辩认。
多倍体研究在育种具有重要的意义。
利用一些诱发因素可以人工诱导植物产生多倍体。
这些因素包括物理的因素、化学因素等。
其中最为有效是化学药品是秋水仙素。
秋水仙素能够抑制细胞有丝分裂时形成的纺锤体，染色体虽然完成了复制，但是不能形成两个子细胞，因而使染色体的数目加倍。
含加倍的染色体的体细胞再分裂出来的子细胞，染色体数目都比原来的体细胞增加了一倍，就形成了一个多倍体植株。
鉴定多倍体可分为直接和间接鉴定：直接鉴定是将经过秋水仙素溶液处理的根尖，茎尖进行染色体计数。
间接鉴定是根据多倍体植物
外部形态变化的主要特征是巨大性这一点提出的。
花粉粒和气孔的增大常作为染色体数目加倍的辅助性指标。
三、实验试剂和用具：
秋水仙素：0.05%-0.1%浓度。
卡诺固定液：3份95％酒精与1份冰醋酸配制而成。
龙胆紫溶液：将0.5克龙胆紫溶解在100毫升，2％醋酸溶液中配制成0.5％龙胆紫溶液。
醋酸洋红溶液：将1克洋红与100毫升冰醋酸混合后煮沸，煮时可加锈铁钉一枚，略具铁质的1％醋酸洋红染液能增强染色效果。
搪瓷盘、镊子、剪刀、烧杯、培养皿、恒温水浴锅、纱布、试管，载玻片，盖玻片，显微镜，吸水纸。
四、实验材料：
发芽的蚕豆，蚕豆幼苗
五、实验方法及步骤：
（一）蚕豆种子的处理和多倍体直接鉴定:
1、种子的萌发先将种子用清水洗净，浸种。
待露白后置于培养皿
中发芽；
2、预处理当根长1cm左右时，取出洗净用吸水纸吸干，再用
0.05-0.1%秋水仙素溶液浸泡处理24-36小时，然后用
蒸馏水冲洗三次，继续用培养皿培养一周；
3、多倍体检测剪取根尖（或胚芽）2-3mm,投入盛有10%HCL的
培养皿中解离10min，再清水漂洗2次。
将漂洗后的根
尖（或胚芽）放入0.5％龙胆紫溶液或1％醋酸洋红溶
液中染色3-5min，制片，然后镜检观察染色体的倍性。
（二）蚕豆幼苗的处理和多倍体间接鉴定:
（1）蚕豆幼儿苗的处理：
在蚕豆幼苗的幼芽长到3-5mm时，用解剖刀在芽上作一纵切，然后用一浸有秋水仙素(0.05%浓度)溶液的纱布条包在切口处,纱布条的另
端浸在一个盛有秋水仙素水溶液的小烧杯内, 烧杯的口用封口膜封
好以防处理液蒸发,处理12h.隔天后再处理1次,然后将幼苗洗干净,种到花盆内或地里。
同时种植没有处理过的幼苗作为对照。
（2）形态观察和细胞学鉴定：
比较处理与对照的外部形态有什么差异，将叶面的表皮撕下，在显微镜下观察，多倍体植物的气孔和花粉粒比二倍体大很多，叶片也比较肥厚。
用根尖压片法制成染色体载玻片标本，在显微镜下认真观察和计数，与对照进行对比。
六、注意事项：
1、本实验所用的秋水仙素溶液具有强致癌性，请在使用过程中务
必注意安全，尤其是不能乱倒废液。
2、由于本实验涉及的时间较长，应认真记录各时期植物变化情况。
七、作业及思考题：
1、与对照植物相比，处理后的植物有哪些不同特征？
2、使用秋水仙素诱导多倍体应注意哪些问题？。