药物分析-鉴别试验的条件及方法验证
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药物分析-药物的鉴别试验
一些具有特定结构的官能团、金属阳离子及阴 离子可能存在于多种药物中，为避免重复，中 国药典将此类官能团、阴、阳离子的鉴别试验 列于附录中，此类鉴别试验只能证实是某一类 药物，而不能确定是哪种具体药物，所以称之 为一般鉴别试验。
15
如： 丙二酰脲类鉴别试验只能证实是 巴比妥类药物，但具体是何种巴 比妥类药物不可确定。
5
初熔 终熔
6
3）熔点测定的注意事项：
a. 传温液 mp在80℃以下的，用水； mp在80℃以上的，用硅油或液体石蜡。
b. 毛细管 中性硬质玻璃管，长：9cm 内径：0.9~1.1mm
壁厚：0.10~0.15mm。
c. 升温速度 1~1.5 ℃/min。
d. 温度计 0.5℃刻度，且经校正。
7
（2）凝点
小供试品量，以m表示，单位为µg。 最低检出浓度---在一定条件下能观察出试验结果时
供试品的最低浓度，以1V表示。
25
最低检出量与最低检出浓度之间的关系：
m v 106 V
式中： — 试液的体积（mL）：鉴别时所取试
液的体积
V — 最低检出浓度的体积：指含有1 g 供
试品的溶液体积（mL）
钠盐鉴别试验等。
16
（三）专属鉴别试验
专属鉴别试验（specific identification test）是 证实某一种药物的依据。根据每一种药物化学 结构差异所引起的物理化学特性不同，选用某 些专属定性反应来鉴别药物的真伪。 如： 维生素B1，中国药典（2000年版）—硫 色素反应作为其专属鉴别试验。
m — 最低检出量( µg )。
26
空白试验
目的: 检查试剂和蒸馏水中是否含有待测组分。 方法：用蒸馏水代替试样进行测定。 对照试验 目的: 检查方法的可靠性。 方法: 用标样代替试样进行测定。
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如： 丙二酰脲类鉴别试验只能证实是 巴比妥类药物，但具体是何种巴 比妥类药物不可确定。
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初熔 终熔
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3）熔点测定的注意事项：
a. 传温液 mp在80℃以下的，用水； mp在80℃以上的，用硅油或液体石蜡。
b. 毛细管 中性硬质玻璃管，长：9cm 内径：0.9~1.1mm
壁厚：0.10~0.15mm。
c. 升温速度 1~1.5 ℃/min。
d. 温度计 0.5℃刻度，且经校正。
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（2）凝点
小供试品量，以m表示，单位为µg。 最低检出浓度---在一定条件下能观察出试验结果时
供试品的最低浓度，以1V表示。
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最低检出量与最低检出浓度之间的关系：
m v 106 V
式中： — 试液的体积（mL）：鉴别时所取试
液的体积
V — 最低检出浓度的体积：指含有1 g 供
试品的溶液体积（mL）
钠盐鉴别试验等。
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（三）专属鉴别试验
专属鉴别试验（specific identification test）是 证实某一种药物的依据。根据每一种药物化学 结构差异所引起的物理化学特性不同，选用某 些专属定性反应来鉴别药物的真伪。 如： 维生素B1，中国药典（2000年版）—硫 色素反应作为其专属鉴别试验。
m — 最低检出量( µg )。
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空白试验
目的: 检查试剂和蒸馏水中是否含有待测组分。 方法：用蒸馏水代替试样进行测定。 对照试验 目的: 检查方法的可靠性。 方法: 用标样代替试样进行测定。
药物鉴别技术—药物鉴别试验的条件(药物分析课件)
VB2
滤过
滤液
淡黄绿色
VB6
坦 片
VE,VB1,VB6,谷氨酸…
荧光
VB1
剂
辅料
…
试样现象
VB2对照品现象
稀H2SO4
蓝色荧光
荧光消失
分三份
NaOH溶液
荧光消失
荧光消失
连二亚硫酸钠
荧光消失 黄色褪去
荧光消失
分析原因，排除干扰 对复方中各组分逐一比较 脑蛋白的水解物水溶液呈蓝色
（二）提高反应灵敏度的方法
• 加萃取液提取浓集有色生成物，易于观测。 • 改进观测方法 目视观测溶液的颜色 分光光度计
观测生成沉淀 比浊法
三、鉴别试验条件
（一）溶液的浓度
溶液的浓度主要指被鉴别物质的浓度，其大小影响结果的判断。 （如化学法中要观察沉淀、颜色；UV法中λmax, A, E1%1cm)
（二）溶液的温度
温度过高可使产物分解，导致颜色变浅，沉淀溶解，甚至观察 不到结果，故试验中应注意温度的控制。
（三）溶液的酸碱度
许多鉴别反应都需要在一定酸碱度的条件下进行，溶液的酸 碱度能够使各反应物有足够的浓度处于活化状态、使反应产物处 于稳定和易于观察状态。
（四）试验时间
有机化合物的化学反应较慢，需要一定的反应时间和条件。
Байду номын сангаас（五）干扰成分的存在
药物制剂的鉴别，其它成分则会干扰检查结果的现象观察， 必须选择专属性更高的鉴别方法或将干扰成分分离后鉴别。
复方吡拉西坦片剂中维生素B2鉴别方法的建立
吡拉西坦
脑蛋白水解物
复
方 脑蛋白水解物
吡
拉 西
VB2
取10片
加50ml水
药物分析---典型药物的鉴别试验
2,6-二氯靛酚的氧化型在 H+ 介质中为玫瑰红色，在 OH- 介质中 为蓝色。与VC作用后生成还原型无色的酚亚胺。
氧化型
还原型
实验步骤：
• VC的鉴别：
•
取本品约 0.2g ，加水 10mL 溶解后，分成二等份，在一份中
加 AgNO3 0.5mL , 观察沉淀生成颜色；在另一份中加二氯靓酚钠 试液 1－2滴，观察并记录实验现象。
结构：
VA的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环己烯，具有许多立体异构体。 天然VA主要是反式VA，取代基R不同则可以是VA醇或其酯。
理化性质： 溶解性：脂溶性，溶于乙醚、石油醚等有机溶剂中，在乙醇中微溶，在水中
不溶。
不稳定性：易发生氧化、脱氢、脱水、聚合反应《中国药典》 紫外吸收特性：共轭多烯醇的侧链结构 与三氯化锑呈色 ：VA在氯仿溶液中能与三氯化锑作用，产生不稳定的蓝色。
实验步骤：
• VB1的鉴别：
•
取本品约 5mg ，加 NaOH 试液 2.5 mL溶解后，加 K3Fe(CN)6试液 0.5mL 与正
丁醇 5mL ，强力振摇 2分钟，放置使分层，观察上面的醇层荧光颜色；加稀
HCl 使成酸性，而后再加 NaOH 试液使成碱性，观察并记录实验现象。
ห้องสมุดไป่ตู้
•
K3Fe(CN)6试液配制：取 K3Fe(CN)6 1g , 加水 10mL 使溶解，即得。本液应临
典型药物的鉴别试验
-----维生素类典型药物的鉴别
张丽
实验目的
掌握维生素类典型药物的鉴别原理和鉴别方法：
维生素类典型药物：维生素A , B1 , C
熟悉维生素类典型药物的鉴别实验操作中的基本方法和试剂。
VA 鉴别实验原理
氧化型
还原型
实验步骤：
• VC的鉴别：
•
取本品约 0.2g ，加水 10mL 溶解后，分成二等份，在一份中
加 AgNO3 0.5mL , 观察沉淀生成颜色；在另一份中加二氯靓酚钠 试液 1－2滴，观察并记录实验现象。
结构：
VA的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环己烯，具有许多立体异构体。 天然VA主要是反式VA，取代基R不同则可以是VA醇或其酯。
理化性质： 溶解性：脂溶性，溶于乙醚、石油醚等有机溶剂中，在乙醇中微溶，在水中
不溶。
不稳定性：易发生氧化、脱氢、脱水、聚合反应《中国药典》 紫外吸收特性：共轭多烯醇的侧链结构 与三氯化锑呈色 ：VA在氯仿溶液中能与三氯化锑作用，产生不稳定的蓝色。
实验步骤：
• VB1的鉴别：
•
取本品约 5mg ，加 NaOH 试液 2.5 mL溶解后，加 K3Fe(CN)6试液 0.5mL 与正
丁醇 5mL ，强力振摇 2分钟，放置使分层，观察上面的醇层荧光颜色；加稀
HCl 使成酸性，而后再加 NaOH 试液使成碱性，观察并记录实验现象。
ห้องสมุดไป่ตู้
•
K3Fe(CN)6试液配制：取 K3Fe(CN)6 1g , 加水 10mL 使溶解，即得。本液应临
典型药物的鉴别试验
-----维生素类典型药物的鉴别
张丽
实验目的
掌握维生素类典型药物的鉴别原理和鉴别方法：
维生素类典型药物：维生素A , B1 , C
熟悉维生素类典型药物的鉴别实验操作中的基本方法和试剂。
VA 鉴别实验原理
药物分析第二章药物的鉴别试验
5、芳香第一胺类
供试品 + 稀盐酸 + 亚硝酸钠 + 碱性β 萘酚试液 ----橙黄色到猩红色沉淀
6、托烷生物碱类 供试品+ 发烟硝酸（在水浴上蒸干）---------黄色殘渣（冷却）
乙醇（2D）+氢氧化钾（1粒）
------------------------------------------深紫色 （三）专属鉴别试验 在一般鉴别试验的基础上，证实是某一种药物（详见各论）。
E:制备氧化铝方法代号
原点至色谱斑点中心的距离 (2)比移值Rf == -----------------------------------------原点至展开剂前沿的距离 供试品的Rf值与标准品的Rf值比较,由此确定供试品的成份.
例:硫酸阿米卡星的薄层色谱法鉴别试验(P35) (1)布板:硅胶H (2)配溶液(供试品)
折光率(20℃):指光线在空气中进行的速度与供试品中 进行速度的比值 n t
D
t 比旋度:一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含 [ ]D 有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度
例：称取葡萄糖10.00g，加水溶解并稀释至100.0mL， 于20℃用2dm测定管，测得溶液的旋光度为+10.5°， 求其比旋度？ 解：溶液厚度：2dm: +10.5 ° 1dm: +5.25 ° 浓度：10g/100ml=0.1g/ml 比旋光度： +5.25 °×10=+52.5°
4、核磁共振（NMR） H核或C核的化学位移
(三)X射线粉末衍射法 布拉格方程
（四）色谱鉴别法 1、薄层色谱 将吸收剂或支持剂均匀铺在玻璃板上（或聚酯薄膜塑料或 铝箔上），把要分离分析的样品点在薄层色谱板上，用溶剂展 开，在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、 分析、鉴定目的。 例: 药物中特殊杂质的检查 (醋酸可的松中其他甾体的检查) (1)布板 (2)点样 (3)显色
药物分析 药物分析方法的验证
2. 验证方法
（1） 含量测定
1）基质无（原料药）/可模拟（制剂）
回收率(%)=
测得量 加入量
100
2）基质不可模拟（制剂、中药）
回收率(%)=
测得量 - 本底值 加入量
100
（2） 杂质检查——方法同2）
2. 验证方法（其他方法）
• 可与已知准确度的另一方法的测定结果比较 ——药典标准方法 / 经过验证的方法
• LOD是一种限度检验效能指标， 反映方法的灵敏度
1 直观法
目视法评价的方法: 化学反应 / TLC ——鉴别的显色法； 杂质检查的TLC
2 信噪比法
3 标准偏差/ 标准曲线
显示信号与噪声水平的方法: HPLC ——S/N=3（2） 时的相应浓度或量
其他分析方法: UV-Vis法
LOD 3.3 / S δ空白响应偏差
含量水平
限度（%）
100 % 10 % 1% 0.1%
98~101 95~102 92~105 90~108
0.01 % 10 g/g （ppm） 1 g/g （ppm） 10 g/kg （ppb）
85~110 80~115 75~120 70~125
（二） 精密度
1. 定义 • 同一均匀供试品多次取样测定 所得结果之间的接近程度 • 相对标准偏差（%， RSD）；
• 也可由所测定的精密度、线性和专属性推算 ——原料药含量HPLC测定法
3. 数据要求 • 9个测定结果（n=9）
3水平×3样品 • 化药：1 ︰ 0.8、1 ︰ 1、1 ︰ 1.2 • 中药: 1 ︰ 0.5、1︰1、1︰1.5
3. 数据要求
样品中被测成分的含量水平 与回收率限度 要求的关系
药物分析 第二章鉴别
药品的熔点与分子结构有关，当构成晶 格的单位（对有机化合物来说一般是分子， 无机化合物的是离子或原子组成）受热， 动能增加到足以克服各单位间相互作用力 即格子力，晶格崩溃涣散，这时的 温度 就是固体的熔点。每种纯的固体有机化 合物都有自己的独特的晶型结构和分子间 力，因此要熔化固体，就需要一定的热能， 所以每种固体物质都有独特的熔点。
5、制备衍生物测定熔点法
药物＋试剂 新化合物有一定mp; 药物酸化或碱化生成游离酸或碱。操作繁琐费时 间，应用较少。
二、光谱鉴别法
测定最大吸收波长，或同时测定最小吸收波长 规定浓度的供试液在最大吸收波长测定吸收度 规定吸收波长和吸收系数法 规定吸收波长和吸收度比值法 经化学处理后, 测定其反应产物吸收光谱特性
比旋度：指在一定波长下，偏振光透过1dm且每1ml中含有
旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度。可用于鉴
别药物、检查药物的纯度和含量测定。
[n]TD = 100α/dL 摩尔吸收系数εh.P收载的方法）E1%1cm=A/CL
二、一般鉴别试验 （general identification test）
注意事项：
1、由于受薄层板质量、边缘效应等因素的影响，实际操作 中有时会遇到同一物质在同一薄层板上的Rf值不一的情 况，操作中可增加将供试品溶液与对照品溶液等量混合， 点样后出现单一斑点作为鉴别依据。
2、单独使用TLC鉴别时，需要进行色谱系统适应性试验内 容，对斑点的比移值和分离效能进行考察。必要时进行 灵敏度考察。
（二）提高反应灵敏度方法 1. 加入与水不混溶的有机溶剂提取浓集
2. 改变观测方法
溶解度
物理常数: 相对密度、馏程、熔点、比旋度、吸收系数 、 折光率、黏度、酸值、碘值、皂化值、羟值
药物的鉴别试验 药物分析
的特征谱线的特性，根据供试溶液在特征谱线处的最大吸收和 特征谱线的强度减弱程度进行定性、定量分析。
5. X射线粉末衍射法
第5节 色谱鉴别法
利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱 行为（比移值或保留时间）进行的鉴别试验。 采用与对照品在相同条件下进行色谱分离，并进行比较， 根据两者保留行为和检测结果是否一致来验证药品的真伪。
• 加硝酸银-黄色沉淀不溶于氨水或硝酸溶液； • 通入Cl2，臵换出I2，三氯甲烷吸收显紫色，使淀粉变蓝。
第3节 化学鉴别试验
2. 其他无机酸根离子
硫酸根： • 酸性下加氯化钡-白色沉淀，沉淀酸中不溶解； • 加醋酸铅→白色沉淀，沉淀在醋酸铵或氢氧化钠中溶解； 硝酸盐： • 硫酸介质中，加入硫酸亚铁，接界面-棕色环（Fe(NO)SO4）； • 加硫酸、铜丝，红棕色蒸气（NO2）; 磷酸盐： • 中性条件下，加硝酸银，生成浅黄色沉淀，溶于氨溶液或稀硝酸； • 和氯化铵镁反应—白色结晶沉淀； • 和钼酸铵试液、硝酸反应—黄色沉淀（溶于氨）
HO CH COOH HO CH COOH
+
Ag(NH3)2OH
2 Ag +
HO C COONH4 HO C COONH4
+ 2NH3 + 2H2O
第3节 化学鉴别试验
三、常见有机酸根的鉴别
3. 苯甲酸盐
①
FeCl3反应
COONa 7 3FeCl3 2OH中性 溶液
COO Fe3(OH)2 OOC
USP采用对照品法
试样制备方法： 压片法、糊法、膜法、溶液法
第4节 光谱鉴别法
特征区 指纹区
第4节 光谱鉴别法
3. 近红外光谱法(Near-Infrared spectrometry)
5. X射线粉末衍射法
第5节 色谱鉴别法
利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱 行为（比移值或保留时间）进行的鉴别试验。 采用与对照品在相同条件下进行色谱分离，并进行比较， 根据两者保留行为和检测结果是否一致来验证药品的真伪。
• 加硝酸银-黄色沉淀不溶于氨水或硝酸溶液； • 通入Cl2，臵换出I2，三氯甲烷吸收显紫色，使淀粉变蓝。
第3节 化学鉴别试验
2. 其他无机酸根离子
硫酸根： • 酸性下加氯化钡-白色沉淀，沉淀酸中不溶解； • 加醋酸铅→白色沉淀，沉淀在醋酸铵或氢氧化钠中溶解； 硝酸盐： • 硫酸介质中，加入硫酸亚铁，接界面-棕色环（Fe(NO)SO4）； • 加硫酸、铜丝，红棕色蒸气（NO2）; 磷酸盐： • 中性条件下，加硝酸银，生成浅黄色沉淀，溶于氨溶液或稀硝酸； • 和氯化铵镁反应—白色结晶沉淀； • 和钼酸铵试液、硝酸反应—黄色沉淀（溶于氨）
HO CH COOH HO CH COOH
+
Ag(NH3)2OH
2 Ag +
HO C COONH4 HO C COONH4
+ 2NH3 + 2H2O
第3节 化学鉴别试验
三、常见有机酸根的鉴别
3. 苯甲酸盐
①
FeCl3反应
COONa 7 3FeCl3 2OH中性 溶液
COO Fe3(OH)2 OOC
USP采用对照品法
试样制备方法： 压片法、糊法、膜法、溶液法
第4节 光谱鉴别法
特征区 指纹区
第4节 光谱鉴别法
3. 近红外光谱法(Near-Infrared spectrometry)
药物分析药物的鉴别试验
➢ 规定λ和Aλ1/Aλ2 ➢ 经化学处理后，测定其反应产物的吸收光谱 特性。
2021/3/11
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2021/3/11
55
2021/3/11
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例1：布洛芬
【鉴别】 (1) 取本品，加0.4％氢氧化钠溶液 制成每1ml中含0.25mg的溶液，照分光光度 法（附录Ⅳ A）测定，在265nm与273nm的 波长处有最大吸收，在245nm与271nm 的波 长处有最小吸收，在259nm的波长处有一肩 峰。
2021/3/11
20
2.有机酸盐
水杨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、 枸橼酸盐
2021/3/11
21
（1）水杨酸盐
① FeCl3反应
COOH
6
OH+FeCl3
弱酸性
COO-
O- Fe 2
Fe
+ 12HCl
3
中性
②加稀HCl，即析出白色沉淀；分离，沉淀溶
于醋酸铵溶液。
2021/3/11
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例：水杨酸镁
【鉴别】 (1) …… (2)取本品约0.3g，置洁净 的试管中，加水10ml溶解，加硝酸银试液过 量，即生成白色沉淀，滴加氨试液恰使沉淀溶 解后，将试管置水浴中加热，银即游离并附在 管的内壁成银镜。
2021/3/11
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3.芳香第一胺
NH2
重氮化-偶合反应
R
取供试品约5mg，加稀盐酸1ml，必要时缓缓
+NaCl + H2O
2021/3/11
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氨苯砜
【鉴别】 (1) 本品显芳香第一胺类的鉴别 反应（附录Ⅲ）。 (2) ……。
2021/3/11
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第四节 鉴别试验的条件及方法验证
一、溶液的浓度
溶液的浓度主要指被鉴别物质的浓度，其大小影响结 果的判断。
（如化学法中要观察沉淀、颜色；UV法中λmax, A, E1%1cm)
二、溶液的温度
温度过高可使产物分解，导致颜色变浅，甚至观察不 到结果。
三、溶液的酸碱度
反应物处于活化状态、反应产物处于稳定Βιβλιοθήκη 以观 察状态。四、试验时间
有机化合物的化学反应较慢，需要一定的反应 时间和条件。
五、鉴别方法的验证
专属，耐用
• 示例2-39 复方吡啦西坦片剂中维生素B2鉴别 方法的建立。
方法设计 阳性对照：被测组分的原料药或纯品 空白试验：缺被测物的空白复方制剂
维生素B2片与其原料药鉴别试验
稀硫酸 氢氧化 Na2S2O4 钠试液
对照品液（黄绿色荧光）-
-
-
供试品液（黄绿色荧光）+ -
-
练习与思考
1．药物的鉴别包括哪些项目？ 2．药物的鉴别可采用哪些方法？
一、溶液的浓度
溶液的浓度主要指被鉴别物质的浓度，其大小影响结 果的判断。
（如化学法中要观察沉淀、颜色；UV法中λmax, A, E1%1cm)
二、溶液的温度
温度过高可使产物分解，导致颜色变浅，甚至观察不 到结果。
三、溶液的酸碱度
反应物处于活化状态、反应产物处于稳定Βιβλιοθήκη 以观 察状态。四、试验时间
有机化合物的化学反应较慢，需要一定的反应 时间和条件。
五、鉴别方法的验证
专属，耐用
• 示例2-39 复方吡啦西坦片剂中维生素B2鉴别 方法的建立。
方法设计 阳性对照：被测组分的原料药或纯品 空白试验：缺被测物的空白复方制剂
维生素B2片与其原料药鉴别试验
稀硫酸 氢氧化 Na2S2O4 钠试液
对照品液（黄绿色荧光）-
-
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供试品液（黄绿色荧光）+ -
-
练习与思考
1．药物的鉴别包括哪些项目？ 2．药物的鉴别可采用哪些方法？