体内药物分析方法的建立与验证
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体内药物分析方法
（一）在新药评价 和开发中的意义 1．全面质量控制 2．新药报批 3．为设计新药提供信息 ①从代谢产物中开发新药 保泰松→羟基保泰松（作用强、副作用小） 非那西丁→扑热息痛 ②前药设计 ③新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等 以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决
（二）临床合理用药中的意义
1．血药浓度与药理作用
（7）药物的吸附 ①玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯
硅烷 ②血浆
2．液固萃取
固相萃取[solid phase extraction SPE] 针管式 抽空减压 加压 过滤
（1）固相萃取步骤
①固相选择 样品1ml 1ml规格固相 1~25ml 3ml规格固相 ②固相处理
反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态 ③上样 ④分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 ⑤洗脱待测物 改变pH或极性
2．血浆蛋白结合率
Df+P
Db
K=
•[P]·[Df ] •Db
血浆蛋白结合率：
Β= •Db =
•1
•Db+Df
•1+K/np+Df/np
解离常数
结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞 争蛋白是药物相互作用类型之一。 由此可见，K、np是影响β的重要因素
np↓ β↓ K↓ β↑ 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高 ，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物 血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。
五、药物代谢与体内药物分析的关系
1．样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，
酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。 2．分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法 3．样品的提取、分离法
（二）临床合理用药中的意义
1．血药浓度与药理作用
（7）药物的吸附 ①玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯
硅烷 ②血浆
2．液固萃取
固相萃取[solid phase extraction SPE] 针管式 抽空减压 加压 过滤
（1）固相萃取步骤
①固相选择 样品1ml 1ml规格固相 1~25ml 3ml规格固相 ②固相处理
反相C18 固定相的6~10倍体积甲醇洗柱，使溶剂化 6~10倍水缓冲服液冲洗达分离状态 ③上样 ④分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相 ⑤洗脱待测物 改变pH或极性
2．血浆蛋白结合率
Df+P
Db
K=
•[P]·[Df ] •Db
血浆蛋白结合率：
Β= •Db =
•1
•Db+Df
•1+K/np+Df/np
解离常数
结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞 争蛋白是药物相互作用类型之一。 由此可见，K、np是影响β的重要因素
np↓ β↓ K↓ β↑ 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高 ，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物 血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。
五、药物代谢与体内药物分析的关系
1．样品的保存 样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，
酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。 2．分析方法选择 光谱法 色谱法 免疫法 3．样品的提取、分离法
体内药物分析方法和方法的设计和评价
为：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、
毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等
速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几
年来在体内药品分析中均得到不一样程度应
用。 体内药物分析方法和方法的设计和评价
第14页
体内药物分析方法和方法的设计和评价
第15页
• 选取何种方法进行体内药品分析为好呢？普通 要依据药品理化性质、结构持征、药品浓度大 小、干扰成份多少、预处理方法、试验目标以 及试验室条件等原因综合起来进行考虑。
体内药物分析方法和方法的设计和评价
第9页
1、HPLC法
• HPLC法在体内药品分析中应用已大大超出其 它分析方法，成为体内药品分析中应用最广泛 技术之一。与GC法相比，它含有以下优点：
• (1)适用范围广，可在室温下进行检测。对于 挥发性低，热稳定性差，分子量大以及离子型和评价
（一）以纯品进行测定
• 取药品或其代谢物纯品适量，按确定方法测 定，求得浓度与测定响应值之间关系，进行线 性范围、最适测定浓度、检测灵敏度、测定最 适 条 件 ( 如 pH 值 、 温 度 、 反 应 时 间 等 ） 等 选 择。
体内药物分析方法和方法的设计和评价
第21页
(二)空白样品测定
• 取空白生物样品，按确定方法进行处理，测定 空白值(或色谱图)。空白值高低或色谱图情况 将影响到方法灵敏度和专属性，应力争将空白 值降低。在色谱分析中应力争降低体内样品中 内源性杂质峰，对无法消除内源性杂质峰应设 法使其从待测物色谱区域内移开。能否取得良 好样品空白试验结果，是决定测定方法实际可 行性主要步骤，必须设法处理。
• 另外，还有一些含抗生素类药品生物样品，它 们可用微生物方法测定，利用抗生素在琼脂培 养基内扩散作用，比较样品与药品标准品二者 对接种试验菌产生抑菌圈大小，借以测定样品 内抗生素药品浓度。
体内药物分析概述
患者白蛋白为20g/L(正常范围是34~48g/L)，于是建议检查患者游离苯妥英 钠浓度。结果显示游离苯妥英钠浓度为4.9 μg/ml（游离药物治疗浓度范 围1~2 μg/ml ），判定患者苯妥英钠中毒，建议降低剂量为250mg/d。
体内药物分析的任务：内源性物质检测
体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌 酐、草酸、尿酸等。
喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓 度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。—— 浓度依赖性
时间依赖性——杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时 间的长短有关。β-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。
乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）
用法用量：
口服。成人常用量：
1. 支气管感染、肺部感染： 药物随着血液到各个组织
2.体内样品的种类、采集与贮存
2.1体内样品的种类与采集
血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳 汁、脑脊液等均匀生物样品
心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品 样品选取原则 （1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系； （2）易于获得； （3）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。
0.3-0.4g/日
2. 急性单纯性下尿路感染： 0.2g/日 药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用
3. 细菌性前列腺炎： 0.4g/日 药物随着血液到前列腺组织
测定血液、尿液甚至
组织中的药物浓度
1.概述
1.1体内药物分析的定义
体内样品（生物体液、器官或组织）中药物 及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、 定量分析。
CuSO4-Na2WO4
ZnSO4-NaOH
每1容积血浆加入沉淀剂容积
0.2
体内药物分析的任务：内源性物质检测
体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌 酐、草酸、尿酸等。
喹诺酮类药物对致病菌的杀菌作用取决于药物血药浓 度的峰浓度，即药物浓度越高，杀菌作用越强。—— 浓度依赖性
时间依赖性——杀菌活性与药物浓度维持在MIC以上时 间的长短有关。β-内酰胺类、林可霉素类等抗生素。
乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）
用法用量：
口服。成人常用量：
1. 支气管感染、肺部感染： 药物随着血液到各个组织
2.体内样品的种类、采集与贮存
2.1体内样品的种类与采集
血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳 汁、脑脊液等均匀生物样品
心、肝、脾、肺、肾、脑等非均匀生物样品 样品选取原则 （1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系； （2）易于获得； （3）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。
0.3-0.4g/日
2. 急性单纯性下尿路感染： 0.2g/日 药物通过尿液排泄在下尿路发挥治疗作用
3. 细菌性前列腺炎： 0.4g/日 药物随着血液到前列腺组织
测定血液、尿液甚至
组织中的药物浓度
1.概述
1.1体内药物分析的定义
体内样品（生物体液、器官或组织）中药物 及其代谢产物或内源性生物活性物质的定性、 定量分析。
CuSO4-Na2WO4
ZnSO4-NaOH
每1容积血浆加入沉淀剂容积
0.2
体内药物研究分析的方法和重要性
体内药物分析的方法和重要性————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：2浙江大学远程教育学院本科生毕业论文（设计）开题报告题目体内药物分析的方法和重要性专业药学学习中心衢州姓名袁奕艺学号710013222002指导教师周新高2012 年03月24日一、文献综述体内药物分析是指通过分析手段了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药物动力学的各种参数，以及药物在体内转变、代谢的方式、途径等信息。
从而为药物的生产、医疗临床、实验研究等方面对所研究的药物做出估计与评价，对药物改进和发展做出贡献。
随着体内药物分析的深入，必将对药物和人的内在关系作出更准确的表达和描述。
体内药物分析的首要任务是为临床药学和临床实际工作提供分析数据，这就决定了其独特的分析方法。
1样品必须净化。
供分析的样品来自不同生物体，组成复杂，干扰物质多。
如体液和组织中的内源性物质的成分可以与药物结合，且干扰测定。
因此测定前需进行不同程度分离、纯化，方可进行测定。
2样品浓缩。
一般而言，能供分析的样品量较少，其中所含药物及其衍生物的量更少，实际进行的是微量分析，另外，样品不易重新获得，所以经进化后的样品还应进行必要浓缩。
3方法简便、快速和准确。
样品若是临床药物浓度监测的分析，由于工作量大，故分析方法越简单越好；若为有关科研提供数据，则要准确性高；若与中毒解救有关，则要求越迅速越佳。
4还需有一定为检测服务的仪器设备。
总之体内药物分析的首要是适合体内样品中药物的灵敏性高、选择性好、准确可靠地分析方法。
生物样品经过适当的前处理后，选择合适的方法进行定性定量分析。
常用的体内药物分析方法包括：色谱法、各种联用技术、免疫分析法、光谱分析法、放射性核素标记法和微生物法等，其中色谱法和色—质联用技术是体内药物分析的最常用方法。
1色谱法包括高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法等，是分析混合组分最有效的方法，尤其是当色谱与质谱、色谱与核磁共振波谱联用时，更显示出其强大的分离分析、定性定量的功能。
体内药物分析
性和分析目的， 选择合适的分析方法进行分 析。
数据分析和解释
通过统计学和模型建立等方 法，对分析结果进行解释和 评估。
体内药物分析的未来发展趋势
随着技术的不断进步，体内药物分析将更加精准和高效。人工智能和大数据分析将在药物研发和个体化 用药中起到重要作用。
结论和总结
体内药物分析是现代药物研发和临床实践中不可或缺的一部分。通过准确评 估药物的代谢和药代动力学，可以实现个体化治疗和提高治疗效果。
常用的体内药物分析方法
液相色谱法
通过分离和测定药物成分，快速和准确地分析 药物浓度。
质谱法
通过分析药物的质谱图谱，检测药物的代谢产物。
免疫分析法
利用抗体和抗原的特异性反应，检测药物的含 量和浓度。
药动学分析
通过建立数学模型，研究药物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄。
体内药物分析的应用领域
1
药物研发
体内药物分析
体内药物分析是研究药物在人体内的分布、代谢和排泄的过程。它在制药行 业和临床实践中起着至关重要的作用。
药物分析的定义
分析药物成分
通过分离和定量测量药物的化学成分，确定 药物的纯度和质量。
检测药物浓度
测定血浆或尿液中的药物浓度，评估药物的 吸收、分布和排泄。
研究药物代谢
追踪和测量药物在体内的转化和代谢途径， 了解药物的药代动力学。
监测治疗效果
评估药物治疗效果和安全性，为个体化用药 提供依据。
体内药物分析的重要性
1 个体差异
不同个体对药物的代谢和反应有所不同，体内药物分析可以实现个性化治疗。
2 疗效优化
通过监测药物浓度，调整剂量和给药方案，最大限度地发挥药物疗效。
3 安全性评估
数据分析和解释
通过统计学和模型建立等方 法，对分析结果进行解释和 评估。
体内药物分析的未来发展趋势
随着技术的不断进步，体内药物分析将更加精准和高效。人工智能和大数据分析将在药物研发和个体化 用药中起到重要作用。
结论和总结
体内药物分析是现代药物研发和临床实践中不可或缺的一部分。通过准确评 估药物的代谢和药代动力学，可以实现个体化治疗和提高治疗效果。
常用的体内药物分析方法
液相色谱法
通过分离和测定药物成分，快速和准确地分析 药物浓度。
质谱法
通过分析药物的质谱图谱，检测药物的代谢产物。
免疫分析法
利用抗体和抗原的特异性反应，检测药物的含 量和浓度。
药动学分析
通过建立数学模型，研究药物在体内的吸收、 分布、代谢和排泄。
体内药物分析的应用领域
1
药物研发
体内药物分析
体内药物分析是研究药物在人体内的分布、代谢和排泄的过程。它在制药行 业和临床实践中起着至关重要的作用。
药物分析的定义
分析药物成分
通过分离和定量测量药物的化学成分，确定 药物的纯度和质量。
检测药物浓度
测定血浆或尿液中的药物浓度，评估药物的 吸收、分布和排泄。
研究药物代谢
追踪和测量药物在体内的转化和代谢途径， 了解药物的药代动力学。
监测治疗效果
评估药物治疗效果和安全性，为个体化用药 提供依据。
体内药物分析的重要性
1 个体差异
不同个体对药物的代谢和反应有所不同，体内药物分析可以实现个性化治疗。
2 疗效优化
通过监测药物浓度，调整剂量和给药方案，最大限度地发挥药物疗效。
3 安全性评估
药品质量标准分析方法验证的内容有
体内药分作业J药剂0901 3091158012 钱晨药品质量标准分析方法验证的内容有：准确度，精密度(包括重复性，中间精密度和重现性)，专属性，检测限，定量限，线性，范围和耐用性。
一、专属性1、体内：必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物不得干扰样品的测定。
对于色谱法至少要提供空白生物样品色谱图，空白生物样品外加对照色谱图记用药后的生物样品色谱图。
对于复方制剂应特别加强专属性研究，以排除可能的干扰。
2、体外：专属性系指在其他成分（如杂质，降解产物，辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。
鉴别反应，杂质检查和含量测定方法，均应考察专属性。
如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。
A、鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似的化合物区分。
不含被测物成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应。
B、含量测定和杂质测定色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并标明诸成分在图谱中的位置，色谱中的分离应符合要求。
二、标准曲线和线性范围1、体内：根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线。
标准曲线高低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应达到实验要求的精密度和准确度。
必须用至少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，线性范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将线性范围外推求算未知样品的浓度。
标准曲线不包括零点。
标准曲线上各浓度点的实测值与标示值的偏差（bias）在可接受范围内时，可判定标准曲线合格。
回归值系将各浓度点的响应值代人标准曲线计算所得的浓度值；标示值系指制备标准曲线时，各相应浓度点的配制浓度，标准曲线上各浓度点偏差的可接受范围一般规定为：最低浓度点的偏差在±20%以内，在其余各浓度点的偏差在±15%以内。
只有合格的标准曲线才能用于临床待测样品的浓度计算。
当线性范围较宽时，推荐采用加权最小二乘法（weighted least square method）进行同归计算2、体外：线性是只在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。
体内药物分析方法的建立和验证
4）加量为生物样本体积的2% 5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干 6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加 7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为2 2.内标物溶液的配制 1）精称内标物适量，配内标物贮备液 2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液 3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度 3.标准系列模拟生物样品的配制 1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入内标液适量），混匀
2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和 内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质 4.标准曲线的绘制 1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比（A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性良好。
5.限度要求 1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1， HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100） 三）准确度 指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰 B:比较的内容 Tr；n；TБайду номын сангаасR 2.代谢产物干扰 比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T； R），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.配伍用药的干扰 A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检测信号
2）标准系列模拟生物样品高低浓度比1/10-1/20 3）同时配制空白样C=0 4）防止生物基质中加入过多溶剂，干扰测定，可将标准液和 内标液先加到试管中，蒸干后加生物基质 4.标准曲线的绘制 1）以待测物的响应值（A；h）或与内标物的响应值的比（A1/A2；h1/h2）为（y）对浓度（x），回归得y=a+bx及r。绘 制标准曲线。 2）回归分析时在至少7个浓度构成的标准曲线中，至多2个浓度点数据因确切原因“离群”，可剔出，余至少5点数据线性良好。
5.限度要求 1）标准曲线5-8浓度，最高和最低浓度比1/10-1/20 2）回归方程a应近于零，斜率b接近1或大于1，系数R接近1， HPLC R>0.99；生物学法R>0.98。 3）需分区制备标准曲线（最高和最低浓度比>100） 三）准确度 指用该法测得的生物样；样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度。 1.测定法 取空白生物基质数份，照“标准曲线下”配制，至少选标准 曲线的高、中、低3个浓度样品。每个浓度5个平行样，每个 样测定一次。与随行的标准曲线同测定
A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测 信号，确证内源性物质对分析物有无干扰 B:比较的内容 Tr；n；TБайду номын сангаасR 2.代谢产物干扰 比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T； R），确证代谢产物对分析物有无干扰 3.配伍用药的干扰 A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检测信号
体内药物分析方法的建立和验证
HPLC是一种常用的分析方法，通过溶剂和柱型 的选择，实现对药物成分的分离和测定。
气相色谱-质谱联用法（GC-MS）
GC-MS结合气相色谱和质谱技术，可用于药物 的定性和定量分析。
毛细管电泳法（CE）
CE方法基于电解质溶液中的荧光物质的运移差 异，对药物进行定量分析。
液相色谱-质谱联用法（LC-MS）
体内药物分析方法的建立 和验证
在本次演讲中，我将介绍体内药物分析方法的重要性以及建立与验证这些方 法的步骤。我们还将探讨常见的分析方法，并分享一些实际样品分析的案例 研究。
研究目的和背景
我们的研究旨在提高体内药物分析的准确性和可靠性。了解药物在体内的代谢和排泄过程对药物疗效评估至关 重要。
建立药物分析方法的重要性
1 提高药物治疗效果
通过建立准确和可重复的药物分析方法，我们可以优化药物的剂量和给药方式，以提高 治疗效果。
2 保证药物安全性
合适的药物分析方法可以帮助我们检测潜在的药物代谢产物和有害副作用，确保药物的 安全性。
3 促进新药开发
通过建立高效的药物分析方法，我们可以更好地评估新药的代谢特性和药代动力学特征， 从而推动新药的研发。
质量控制和质量保证
我们使用建立和验证的分析方法， 在血浆样品中测定药物的浓度， 以评估药物的相应效应和剂量控 制。
通过分析代谢产物，我们可以进 一步了解药物的代谢途径和体内 转化过程，为合理用药提供支持。
使用建立和验证的分析方法，我 们能够监控药物制剂的质量并确 保合格产品的生产。
总结和展望
通过建立和验证准确可靠的药物分析方法，我们能够更好地理解药物在体内 的代谢和作用机制，并为药物治疗提供科学依据。
建立与验证方法的步骤
1
气相色谱-质谱联用法（GC-MS）
GC-MS结合气相色谱和质谱技术，可用于药物 的定性和定量分析。
毛细管电泳法（CE）
CE方法基于电解质溶液中的荧光物质的运移差 异，对药物进行定量分析。
液相色谱-质谱联用法（LC-MS）
体内药物分析方法的建立 和验证
在本次演讲中，我将介绍体内药物分析方法的重要性以及建立与验证这些方 法的步骤。我们还将探讨常见的分析方法，并分享一些实际样品分析的案例 研究。
研究目的和背景
我们的研究旨在提高体内药物分析的准确性和可靠性。了解药物在体内的代谢和排泄过程对药物疗效评估至关 重要。
建立药物分析方法的重要性
1 提高药物治疗效果
通过建立准确和可重复的药物分析方法，我们可以优化药物的剂量和给药方式，以提高 治疗效果。
2 保证药物安全性
合适的药物分析方法可以帮助我们检测潜在的药物代谢产物和有害副作用，确保药物的 安全性。
3 促进新药开发
通过建立高效的药物分析方法，我们可以更好地评估新药的代谢特性和药代动力学特征， 从而推动新药的研发。
质量控制和质量保证
我们使用建立和验证的分析方法， 在血浆样品中测定药物的浓度， 以评估药物的相应效应和剂量控 制。
通过分析代谢产物，我们可以进 一步了解药物的代谢途径和体内 转化过程，为合理用药提供支持。
使用建立和验证的分析方法，我 们能够监控药物制剂的质量并确 保合格产品的生产。
总结和展望
通过建立和验证准确可靠的药物分析方法，我们能够更好地理解药物在体内 的代谢和作用机制，并为药物治疗提供科学依据。
建立与验证方法的步骤
1
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体内药物分析
14
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
(一)检测条件的筛选
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 —— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度 HPLC —— 调整检测器(类型、条件) 色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度) 流动相(组分及其配比)及其流速 柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 —— 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR)
药物的萃取回收率等各项技术指标
——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的 其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性
2013-8-21
体内药物分析 20
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
色谱分析法
——进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的
分离情况
2013-8-21
体内药物分析
16
第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
1．空白溶剂试验
待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） ——采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） ——测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高） 考察目标 ——方法的特异性 ——空白值应尽可能小，并能有效校正
实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试
考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况 ——进一步验证方法的可行性
2013-8-21
体内药物分析 22
第四章 分析方法的建立与验证
第三节
分析方法 验证的内容与要求
用于实际生物样品分析之前 ——验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法 ——所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等) 使用的技术指标 ——效能指标 使用的样品
体内药物分析
2013-8-21
25
第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
一、方法特异性(专属性或选择性)
方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用
——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力
专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 特异性——函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性
——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS、EIA等分析检测技术
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
二、分析测定的目的与要求
体内药物分析的目的——影响分析方法的应用
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程
——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物 要求 ——同时测定原形药物和代谢产物
考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
1. 内源性物质的干扰
比较——待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）
——如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致
二、分析方法的建立
初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件
同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的 ——为便于讨论而分别叙述
分析方法的建立步骤
第一步：检测条件的筛选 第二步：分离条件的筛选
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
色谱分析法
——可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的 极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用 量等），甚至检测器类型 ——空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5） 本步骤主要考察 ——需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品 的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验
及与内源性物质色谱峰的 R 确证——内源性物质对分析方法有无干扰
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
2. 代谢产物的干扰
比较——模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号 与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增加)的 R
如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
验证的效能指标与基本要求
1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围——覆盖所有浓度范围 3．准确度——与实际状况相符 4．精密度——结果可重现
5．定量限——达到峰浓度的1/10～1/20
6．稳定性——确保所有样品准确测定 7．提取回收率——确保准确度
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
2. 空白生物基质试验
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标
——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）
——色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 ——内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
4. 实际生物样品的测试
空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)
确证——其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定 ——必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性 对于结构未知的代谢产物的测定
——可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况
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——通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品
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第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求
验证步骤
首先为分析方法的验证
——特异性、精密度与准确度、回收率
定量限与检测限、溶液稳定性
其次为生物基质中待测药物稳定性的验证
——室温放臵、冷冻（或冷藏）、冻-融循环
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC检测 用RIA分析 ——样品的预处理方法可较为粗放 ——经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” （信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
3. 模拟生物样品试验
模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物 ——照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度
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第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据
(一)待测药物的理化性质
药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或 衍生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂
二、分析测定的目的与要求
临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度
方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定
——大多采用UV、RIA或EIA等
中毒患者的临床抢救 药物浓度极高
方法——不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 ——大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
二、分析方法的建立
分析方法建立之前
Байду номын сангаас
查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤
一、分析方法的选择
二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤