医学培训资料—丝状真菌的鉴定
丝状真菌的鉴定
鉴定得分
数量及 百分比(%)
使用布鲁克丝状真菌库
v1.0 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
联合布鲁克和BMU数据库 ≥2.0 ≥1.7 ＜1.7 错误
55 67 37 7
90 104 0 7
(49.5) (60.4) (33.3) (6.3) (81.1) (93.7) (0) (6.3)
111株毛霉：根霉属(48)，毛霉属(41)，横梗霉属(11)，根毛霉属(4)，小 克银汉霉属(5)，共头霉属(2)
染色：乳酸酚棉兰染色
02 丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定
MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌
样品制备 ➢ 直接转移法 ➢ 甲酸提取法—推荐
数据库 ➢ 商业数据库 ➢ 补充数据库
其他影响因素 ➢ 黑色素抑制 ➢ 沙氏葡萄糖液体培养基旋转培养
MALDI-TOF MS-毛霉目真菌的鉴定
• Centraalbureau voor Schimmelcultures (hppt://www.cbs.knaw.nl)
04 常见丝状真菌鉴定
曲霉-直接镜检
曲霉-分生孢子头
分生孢子 瓶梗 顶囊 分生孢子柄
梗基
足细胞
烟曲霉 Aspergillus fumigatus
黄曲霉 Aspergillus flavus
毛霉目真菌-直接镜检
孢囊孢子
柱孢囊
囊轴
囊托
顶囊 孢囊梗
匍匐菌丝
单孢囊
假根
厚壁孢子
粉孢子
毛霉目基本结构
接合孢子 茎孢子
Lichtheimia
横梗霉（Lichtheimia）, 毛霉（Mucor）, 根毛霉（Rhizomucor）和根霉（Rhizopus）的孢子囊特征
丝状真菌
丝状真菌（霉菌）分离筛选方法霉菌生长在偏酸性有机质丰富的环境中，种类多，形态各异，细胞结构多样。
霉菌是一些丝状真菌统称，同酵母菌一样不是分类学的名词。
一.丝状真菌（霉菌）分离筛选1.培养基：1.1 PDA 培养基： 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L ）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长，葡萄糖改为蔗糖。
注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 ，河泥 霉变材料 生物膜适用于查氏 马丁培养基或PDA 培养基1.2 察氏培养基：蔗糖30g/L FeSO 4 0.01g/L NaNO 32.0g/L MgSO 4 0.5g/L KC1 0.5g/L K 2HPO 4 1.0g/L PH6.7-7.01.3马丁培养基： 葡萄糖10g/L 蛋白胨5g/L KH 2PO 41g/L MgSO 40.5g/L 孟加拉红（0.1%）3.3mL 灭菌后使用前加入。
临用时每升培养基加入 1.0%链霉素 3.0mL PH 自然。
1.4特定培养基：橘皮培养青霉 甜酒曲培养根霉。
2.分离纯化：混菌和涂布法将样品梯度稀释（10-4、10-5、10-6），混菌和涂布于平板，25-28℃倒置培养3-7d ， 挑取不同典型单菌落孢子或菌丝进行反复划线纯化。
据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次。
对于形成固定菌落的（青霉 曲霉等）可用稀释平板混菌法分离纯化，菌落不定型蔓延繁殖的（根霉 毛霉），两菌落及易接触混杂，分离时采取较高稀释度或以培养16-24h 内生长菌丝接种。
根霉菌分离筛选：属于毛霉目，蔓延繁殖，没有一定的菌落形态，易与其他霉菌混生，故分离时采取大稀释度，早移植，可在培养基添加0.1℅去氧胆酸钠，防止蔓延。
可利用形态特征鉴别。
样品：酒药 培养基：葡萄糖豆芽汁培养基（豆芽汁100mL ，酵母膏2g 葡萄糖3g PH 自然。
豆芽汁制备：黄豆100g ，加水1000mL ，煮30-40min ，取汁备用）。
丝状真菌生长的测定
菌体干重法：液体培养真菌的生长期完成后，过滤菌丝、洗涤、离心、烘
干、称量干重。这种测定法比较直接而可靠，但仅适用于菌体浓度较高的样品， 而且要求样品中不含有菌体以外的其它干物质。 菌体湿重法：也可以采用测定菌丝湿重法，把烘干步骤省去。但无论测定 干重或湿重，大都用于工业发酵过程的检测。 真菌的生长还可用间接的方法测定，如全氮量和核糖核酸的分析，一般干 的菌丝体含氮量是4.5-8.5%，核糖核酸是2.0-4.0%。另外，还可以分析培养基 中糖的消耗量、氧的吸收量等作为测定生长量的指标。这些方法大都是工业生 产中所采用的方法。
（三）直线生长速率的测定 这一方法使用并不广泛。它是在“Ｕ”形培养管中进行的。培养管长40厘
米，内径约1.3厘米，在两端5厘米处弯成45°角，如图所示。
在培养管中加入适量的溶化的琼脂培养基，达到培养管直径的一半，两端加 棉塞后灭菌。凝固后从一端接种，然后按时测定生长距离，并计算生验内容：菌丝顶端延长生长的测定 1．配制 PDA培养基，高压灭菌备用 2．制备PDA培养基平板，在平板中心点接黑根霉，于28℃培养15h左右。 3．用显微镜的镜台测微尺来校对目镜测微尺。镜台测微尺100格共长1mm，每
格为10μm，标定目镜测微尺上每小格表示多少μm。
4．将黑根霉平板放置于显微镜台上，在菌落边缘选择单根菌丝边缘，在低倍镜 下聚焦。 5．将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的位置与目镜测微尺上
细胞质的泡囊起源于高尔基体，高尔基体、核、内质网一起存在于亚顶端部位。
1970年，Grove等人提出了菌丝顶端生长的泡囊假说：
二、菌丝顶端生长的机制 泡囊作用的三重性： 1. 运输细胞壁溶解酶去破坏原来壁 组成之间的键;
2. 运输新的壁物质，并在壁合成酶
【珍藏课件】徐和平：常见丝状真菌鉴定
【珍藏课件】徐和平：常见丝状真菌鉴定真菌是真核细胞型微生物，其种类繁多，自然界估计多达150万种，分类系统较多，根据形态可分为单细胞和多细胞两类。
单细胞真菌主要为酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌有菌丝和孢子组成，菌丝分枝交织成团形成菌丝体，并长有各种孢子，这类真菌被称为丝状真菌，俗称霉菌。
观察其形态、颜色变化以及真菌不同时期的镜下特征对于正确鉴定真菌具有重要意义。
徐和平老师在真菌学方面拥有丰富的临床经验，今天徐和平老师主要分享常见的丝状真菌鉴定。
温馨提示：因本帖中主要是授课视频和大量图片，建议在WIFI环境下学习！文末有干货！曲霉的基本结构：菌丝：有隔、透明，足细胞分生孢子梗：长短、颜色、表面粗糙程度分生孢子头：顶囊、小梗（瓶梗和梗基）、分生孢子其他结构：壳细胞、闭囊壳、厚壁孢子回顾公益学术活动提到真菌学检验，我们必然想到真菌学青年专家、北京协和医院的王澎老师，她曾多次做客“临床微生物论坛”和“QQ大讲堂”，参与公益学术活动，王澎老师已经离开我们一百多天，但她的音容笑貌仍然深深的印在我们的脑海里，她的学术造诣值得我们去研究学习。
下面就回顾一下2016年4月份她的网络公益讲座：《临床罕见真菌感染病例实验室诊断分享》2016年5月份网络公益讲座：《真菌形态学鉴定思路》践行公益活动之助学山区儿童本人系洛阳市第一中医院检验科陈众，为了帮扶河南省洛阳市嵩县旧县镇龙潭村山区学龄儿童，文末设置二维码所收集到费用均用于公益活动，若有大额资金，将交由村委会统一管理。
活动接受社会监督，资金用途将予以公示。
驻村第一书记：宋军利：138****0002洛阳市第一中医院纪律监察室：*************2016年12月份送物资时拍摄2017年5月2日再次来到龙潭村看望孩子们参与公益活动，可以扫描二维码转账，并注明系公益捐款本文编辑：陈众视频来源：。
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌共4页
ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。
丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。
随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。
本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。
1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。
阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。
1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。
1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。
具体步骤如下：①50μl Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR于灭菌的 EP管中。
②用灭菌枪头挑取单菌落，置于EP管中搅动几下后取出。
③80℃热变性 15 分钟后，低速离心，取1～5μl 裂解后的上清液作为 PCR 反应的模板。
1.4 真菌ITS2序列扩增通用引物序列[3]ITS86-F：5'-gtgaatcatcgaatctttgaac-3'，ITS4-R：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'，目的片段194bp～494bp。
PCR反应总体积50μl，10×buffer 5μl ，dNTP终浓度为200μmol/L，上下游引物终浓度分别为0.2μmol/L， DNA 模板5μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，加入灭菌去离子水至50μl。
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验
丝状真菌的快速鉴定及药敏试验彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【摘要】Objective To evaluate the application of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology in the identification of filamentous fungi,and analyze the susceptibility of filamentous fungi to commonly used antibiotics.Methods A total of 100 strains of filamentous fungi were collected and identified rapidly by MALDI-TOF MS.The obtained results were compared with those from microscopic examination.The susceptibility of filamentous fungi was detected by the Etest method.Results Among 100 strains of filamentous fungi identified by MALDI-TOF MS,61 reached to the specieslevel(score≥2.000),36 to the genus level(score between 1.700 and1.999),and 3 failed to be identified (score ＜ 1.700).There was inconsistent results for one strain of filamentous fungi between MALDI-TOF MS and microscopic examination.The MIC90 of amphotericin B against Epidermophytonfloccosum was 0.19 μg/mL,while that against Aspergillus flavus wa s above 32 μg/mL.The MIC90 of itraconazole against Trichophyton tonsurans,Microsporum canis and Epidermophytonfloccosum were all below 0.38 μg/mL,while that against Aspergillus niger was above 32 μg/mL.The MIC90 of fluconazol were above 256 μg/mL for most of strains.The MIC90 of voriconazole and caspofungin against Aspergillus fumigatus,Aspergillus flavus,Aspergillusniger,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans and Microsporumcanis were ≤0.38 μg/mL and ≤ 1 μg/mL,respectively.Conclusion The MALDI-TOF MS technology may be used to identify the filamentous fungi isolated from clinical specimens quickly,accurately and high-throughput.Voriconazole and caspofungin have effective anti-filamentous fungi activity.%目的评估基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术在丝状真菌鉴定中的作用,分析常用抗菌药物对丝状真菌的药敏试验结果.方法收集100株丝状真菌,采用MALDI-TOF MS进行快速鉴定,并与显微镜检查结果进行比对;用E-test法进行丝状真菌药敏试验.结果 MALDI-TOF MS对100株丝状真菌鉴定达到种鉴定水平的有61株(得分≥2.000),达到属鉴定水平的有36株(1.700～1.999),未能鉴定的有3株(＜1.700);与镜检结果不一致的有1株.两性霉素B对絮状表皮癣菌的90％最低抑菌浓度(MIC90)为0.19 μg/mL,而对黄曲霉的MIC90＞32 μg/mL.伊曲康唑对断发毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的MIC90均＜0.38 μg/mL,而对黑曲霉的MIC90＞32 μg/mL.氟康唑对大部分受试菌株的MIC90均＞256μg/mL.伏立康唑和卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、红色毛癣菌、断发毛癣菌和犬小孢子菌的MIC90分别≤0.38μg/mL和≤1μg/mL.结论 MALDI-TOF MS技术可快速、准确、高通量检测临床分离的丝状真菌.伏立康唑和卡泊芬净对丝状真菌具有较好的抗菌活性.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)007【总页数】5页(P486-490)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;真菌药敏试验【作者】彭阳;许超;王玉月;何彩珍;许昕;毛易捷;史伟峰【作者单位】苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院检验科,江苏常州213003【正文语种】中文【中图分类】R446.5近年来，由于器官移植、免疫抑制剂使用、侵入性治疗、恶性肿瘤、HIV感染等患者逐年增多，以及广谱抗菌药物的广泛应用，丝状真菌的感染比例呈上升趋势。
眼部丝状真菌感染的诊断与致病菌分离鉴定
眼部丝状真菌感染的诊断与致病菌分离鉴定杨惠英1,索继江1,陈世平1,邢玉斌1,贾 宁1,魏 华1,宋佩茹2(1.解放军总医院,北京100853;2.北京同仁医院,北京100730)摘要:目的 分析眼部丝状真菌感染致病菌的种类和致病特征。
方法 对13例眼部丝状真菌感染患者的临床资料进行分析和致病菌分离鉴定,对眼部丝状真菌感染的致病菌、发病原因、早期诊断方法、丝状真菌与酵母菌眼部感染特征进行分析。
结果 13例患者中11例为真菌性角膜溃疡,2例为真菌性眼内炎;13例15眼标本真菌培养均为丝状真菌,其中痂病镰刀菌3例、尖孢镰刀菌2例、烟曲霉2例、谢瓦曲霉1例、黄曲霉1例、链格孢霉1例、尖端单孢子菌1例、总状毛霉1例、链霉菌1例。
结论 眼部丝状真菌感染仍以镰刀菌、曲霉为主,但有明显的多样化趋势;确定诊断须真菌检查,早期诊断是预后良好的关键。
关键词:真菌感染;分离鉴定;角膜炎;眼内炎中图分类号:R379 文献标识码:A 文章编号:100524529(2002)0520332203Fa l i m en tous Funga l I nfection i n Eyes and Pa thogen ic Fungus Iden tif ica tion YAN G H u i2ying,SU O J i2jiang,CH EN Sh i2p ing,X I N G Yu2b in,J I A N ing,W E I H ua,SON G Pei2ru(Genera l H osp ita l,PL A,B eij ing100853,Ch ina)Abstract:OBJECTIVE To find ou t the fungu s and characteristic of pathogen icity abou t filam en tou s fungal infecti on in eyes.M ETHOD S Pathogen ic fungi co llected from15eyes of13patien ts w ith filam en tou s fungal infecti on w ere iso lated fo r cu ltu ring and iden tificati on.T he patien ts clin ical data w ere analysed.Pathogen ic fungi,pathogen ic facto rs,m ethods of early diagno sis,featu re of infecti on in eyes of filam en tou s fungal and yeast w ere discu ssed.RESUL TS E leven cases of13patien ts w ere w ith filam en tou s fungal keratitis,tw o cases w ere w ith filam en tou s fungal endoph thal m itis.F ifteen speci m en s of eyes from13cases w ere po sitive w hen they had been cu ltu red in fungal lab.T he fungal species iden tified included F usa rium solan i(3cases),F.oxy sp orum(2 cases),A sp erg illus f um ig a tus(2cases),A.cheva lieri(1case),A.f lavus(1case),A lterna ria sp(1case), M onosp orium ap iosp er m um(1case),M ucor race m osus(1case),S trep ro m y ces sp(1case).CONCL USI ONSF usa rium and A sp erg illus w ere m ain pathogen ic filam en tou s fungi in eyes.sofarvbu t w ith the obvi ou s diversifiedtendency.D iagno sis has to depend on fungal exam inati on.A co rrect early diagno sis is the key fo r p roper therapy and i m p roving p rogno sis.Key words:Fali m en tou s fungu s;Infecti on;Keratitis;Endoph thal m itis 真菌性眼部感染是一种致盲率较高的眼部疾病,最常见的是角膜真菌感染(fungal keratitis, FK),其次是真菌性眼内炎,而后者较为少见。
真菌的鉴定及药敏试验分析
真菌的鉴定及药敏试验分析真菌对人类健康的危害包括由病原性真菌、条件致病真菌所致的深部真菌病和浅部真菌病；由气传真菌所致的变态反应真菌症即过敏；由污染真菌产毒所致的真菌中毒症。
随着医学的发展，特别是抗生素的广泛使用，大量治疗手段的开展，免疫障碍疾病的大量发生，使真菌感染的情况日益增加，医院感染中的真菌感染也不断增加，因而，掌握真菌检验的方法就成为检验工作中的一个重要组成部分。
1 材料与方法1.1 真菌来源收集临床送检标本所分离出的真菌120例，男性84例，女性36例，其中痰液96株，粪便11例，咽拭子12例、尿液5例、血液4例，分泌物3例。
1.2 采集及处理根据真菌侵犯组织和器官的不同而采集不同的标本，而采集最合适的标本是决定能否找到病原性真菌的关键，要尽量用消毒方法采集标本以免污染。
深部真菌病的标本如血液、脑脊液、脓液、尿、痰等应及时收集检查，一般不超过1～2h，以免变质污染，标本采取前，应忌用药。
为避免污染杂菌，在收集标本时，应严格无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。
1.3 检验方法1.3.1 酵母样菌的检验直接涂片法各类标本，除脑脊液、尿、胸水、腹水等需离心沉淀后取沉淀物作涂片外，其他均可用生理盐水或10％～40％KOH作涂片后直接镜检或用革兰、墨汁、0.1％甲苯胺蓝染色后镜检。
分离酵母样菌所选用的培养基为沙保弱固体或液体培养基，在培养基中可加入各种抗生素抑制细菌的生长、有利于真菌生长含抑制剂的霉菌琼脂。
将备类标本直接接种上述培养基，除新型隐球菌需同时接种两支培养基；一支孵育于37℃，另一支孵育于22～28℃，其他酵母菌均孵育于22～28℃。
每日观察生长情况。
根据酵母菌在培养基上的菌落特征及在玉米粉吐温80培养基上生长物在显微镜下生长情况可作初步鉴定。
1.3.2 丝状真菌的检验某些丝状真菌如孢子丝菌或荚膜组织胞浆菌的直接涂片，必须染色后检查。
真菌的形态和结构通过染色更为清楚，不染色涂片不易保存，染色涂片可长期保存。
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丝状真菌的鉴定
北京大学第一医院皮肤科
主讲人：余进
⏹北京大学第一医院
⏹教授、博士生导师
⏹中国微生物学会临床微生物学委
员会青年委员会副主任委员及真
菌学组副组长
⏹中国微生物学会医学微生物学与
免疫学专委会真菌学组副组长余进
主任医师
01
0504 02
03
目录
丝状真菌形态鉴定
丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌DNA测序鉴定
常见丝状真菌鉴定
总结
丝状真菌形态鉴定01
⏹培养基、培养时间、温度
⏹菌落：平皿培养
颜色：正面、背面、产色素
质地：粉末状、颗粒状、羊毛样、天鹅绒样、棉毛样、绒毛样等 生长：限制性生长、扩展性生长
双相真菌
⏹菌丝
有隔菌丝、无隔菌丝、透明菌丝、暗色菌丝
螺旋菌丝、结节状菌丝、鹿角样菌丝
⏹孢子
无性期孢子：大分生孢子、小分生孢子、关节孢子、孢囊孢子、厚壁孢子
有性期孢子：子囊孢子、接合孢子
⏹孢子发生
产孢结构、孢子排列
如何观察显微镜下形态
⏹选择易于产孢的培养基：皮肤癣菌（SDA或OA）、子囊菌（OA)、其他真菌（PDA）
⏹制作可供观察的玻片
挑片法
胶带法
小培养法
⏹染色：乳酸酚棉兰染色
丝状真菌MALDI-TOF MS鉴定02
直接转移法
甲酸提取法—推荐
⏹数据库
商业数据库
补充数据库
⏹其他影响因素
黑色素抑制
沙氏葡萄糖液体培养基旋转培养
使用布鲁克丝状真菌库
v1.0
联合布鲁克和BMU数据库鉴定得分≥2.0≥1.7＜1.7错误≥2.0≥1.7＜1.7错误
数量及
百分比(%)
55
(49.5)
67
(60.4)
37
(33.3)
7
(6.3)
90
(81.1)
104
(93.7)
(0)
7
(6.3)
111株毛霉：根霉属(48)，毛霉属(41)，横梗霉属(11)，根毛霉属(4)，小
克银汉霉属(5)，共头霉属(2)
Shao J, Wan Z, Li R, Yu J. J Clin Microbiol. 2018, 26;56(4): e01886-17.
MALDI-TOF MS-
毛霉目真菌的鉴定
03
丝状真菌DNA测序鉴定
核糖体基因SSU 5.8S ITS2LSU ITS1D1/D2IGS2IGS1
5S -通用基因-不编码蛋白质，无进化压力，相对保守
-多拷贝-无基因家族-具有可变区和保守区
•rRNA(rDNA)gene -Small Subunit (SSU) rDNA (18S)-Large Subunit (LSU) rDNA (26S, 28S)-Internal Transcribed Spacer (ITS)-Intergenic Spacer (IGS)
常选用的目的基因
多基因（位点）分析
⏹ITS
⏹18s or 28srDNA D1/D2
⏹β-tubulin (β-TUB)
⏹elongation factor (EF-1α)
⏹calmodulin ( CAL)
⏹RNA polymerase II second largest subunit (RPB2)⏹actin
⏹IGS
数据库
•GenBank(hppt://)
•European Molecular Biology Laoratory nucleotide sequence database
( hppt:///embl/)•Centraalbureau voor Schimmelcultures
(hppt://www.cbs.knaw.nl)
常见丝状真菌鉴定04
曲霉-直接镜检
曲霉-分生孢子头
分生孢子
瓶梗
顶囊
分生孢子柄
足细胞
梗基
烟曲霉Aspergillus fumigatus。