第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC填料
保护柱填料一般与分析柱填料相同。
Hypersil 填料Hypersil 填料是基于粒度为3um 、5um和10um, 孔径为120A的硅胶为基质的HPLC填料其生产过程的质量控制标准非常严格全世界数千个实验室使用Hypersil色谱柱已长达20多年很多应用实例可以从多种文献及著名杂志上查到。
大量的试验测试已经证实Hypersil ODS2填料是替代Waters Spherisorb ODS2的最佳填料无论是在酸性还是碱性样品的分析上选择性与峰型几乎与其保持一致。
Hypersil BDS填料尽管常规填料色谱柱具有优异的选择性和较长的色谱柱寿命且对于简单的两元流动相如甲醇/水当样品为酸性中性和弱碱性化合物时均可获得较佳的峰不对称度但当分析药物等样品中的强极性含氮的化合物时样品峰型就极差拖尾严重并导致定量分析精度下降时常会出现一些小峰埋没于前一拖尾峰的尾巴中造成该现象的原因是固定相上尚有残余的硅羟基尽管很多厂家对硅胶表面作了第二次反应即所谓的封尾以减小残余硅羟基的作用但往往都不能完全消除残余的硅羟基的影响Hypersil公司开发的将残余的硅羟基降至极限的Hypersil BDS (Base Deactived Silica碱钝化硅胶)系列产品并用现代衍生反应技术生产出特别适用于碱性化合物的真正均一反相填料。
Hypersil BDS 填料的特征*对碱性化合物有更好的峰型 *更长的柱寿命 *更好的稳定性*同碱性化合物一样酸性和中性化合物也有非常优异的峰型真正的通用柱填料。
尽管常规填料色谱柱具有优异的选择性和较长的色谱柱寿命。
且对于简单的两元流动相(如甲醇/水)，当样品为酸性、中性和弱碱性化合物时均可获得较佳的峰不对称度。
但当分析药物等样品中的强极性含氮的化合物时，样品峰型就极查，拖尾严重，并导致定量分析精度下降，时常会出现一些小峰埋没于前一拖尾峰的尾巴中，造成该现象的原因是固定相上尚有残余的硅羟基。
尽管很多厂家对硅胶表面作了第二次反应，即所谓的“封尾”，以减小残余硅羟基的作用，但往往都不能完全消除残余的硅羟基的影响。
生物工程下游技术第十第十三章+液相色谱用填充材
一、基本概念
• 羟基磷灰石是一种弱阳离子或弱 阴离子交换层析材料。
• 优点:能精确地分离、纯化结构 上只有微小差别的生物大分子。
问题
• HAP是什么原理的色谱?为什么HAP具 有比较高的分辩力?
• HAP色谱填料的主要特点?
第十三章 径向色谱柱的发展与应用
传统色谱存在的问题
• 放大过程的困难； • 保证生物物质活性的困难：生物样品
的分离纯化过程对环境的要求较严， 生物组成成分复杂，分子量较大，比 较敏感，增加其使用的难度； • 生产效率的问题。
• HAP的色谱机理可能包括以下几个方面:
1. 存在两种不同的吸附晶面; 2. 两种不同晶面吸附方式不同; 3. 两种不同吸附点的起因:Ca2+离子和PO43-; 4. 色谱历程为离子间的竞争过程。
HAP在生化产物分离中的应用
• 一般应用领域:糖类,多肽,蛋白质,酶, 核糖核酸。
• 单克隆抗体的分离纯化。 • 结构差异很小的蛋白质分离。
二、HAP的性能
1. 高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可
以耐受几十MPa的压力。
2. 高柱效:球形HAP颗粒大小、形状及孔隙大小均适合
HPLC的要求，其颗粒及孔径小，有比较高的柱效。
3. 化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中
性和碱性水相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高, 可采用高温制备方法生产。
1. 采用径向流技术,可以在较小的柱床层 高度时使用较大的流动相速度。
高分子有机填料属性及特点
高分子有机填料的属性及特点高分子有机填料是由聚氨脂和一定比例的多种金属氧化物配比加工而成。
规格：1×1cm，填料的孔隙率为：90%～95%，密度略大于水。
填料具有良好的弹性，在水力、气流的搅拌、冲击下，填料自身形状会发生微小变化，此形状变化保证了填料内部、外部之间形成良好物质交换条件，这个过程又称之为高效生物亲和性填料的“自呼吸”作用。
填料中含有的多种金属氧化物促进了微生物的生化反应。
实验性中试和工程实际应用中，在反应器内投加高效生物亲和性填料的外形尺寸数量都有明确的规定。
高效生物亲和性填料在微生物附着生长的情况下，会自发形成一个“上浮—沉降“的循环过程。
填料投加到生化反应池初期，填料上附着生长着少量的微生物，填料在反应池内呈悬浮生长状态。
随着填料上微生物的逐渐增加，填料整体的比重增加，此时填料沉淀于反应池的底层。
沉淀于底层的填料上微生物由于物质传递减弱和产生厌氧反应，产生小量气体，逐渐又恢复到悬浮状态，重复着“上浮—沉降”循环过程。
工艺的优点主要有：(1).由于使用了脉冲布水技术和构造独特的有机高分子厌氧填料，能保持和显著提高厌氧系统的污泥量和污泥活性，保证该系统的稳定运行。
(2).实现了新鲜污水与生物载体快速均匀的混合，大大提高了反应速度。
在脉冲流化床中CODcr去除率可达到2—5 kg/m3•d。
(3).由高效可变微孔曝气系统和构造独特的高分子有机好氧填料组成的循环流化床系统，CODcr去除率可达3—8 kg/m3•d，是一般生物反应器所不能比拟的。
(4).高分子有机填料添加了生物亲和剂和增强剂，具有比表面积大，可达到2000~3500 m2/m3，在反应体系中成为生物良好的寄居载体，并且具有水力学性能好和使用寿命长等优点。
(5).高效生物载体填料在流化过程中具有自呼吸功能、功能自定位趋向和对气体的吸收功能，并且对气体产生阻尼性能。
该系统使曝气气体在水体中的停留时间大大延长，使溶氧率比一般好氧生化系统提高30—60%，大大降低了生化系统的耗能。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝，无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀；有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯，有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1、基质的种类：1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布，与比表面积成反比。
③比表面积：在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）：在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性：在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾：在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状：硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差，后者无此缺点。
⑧硅胶纯度：对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC法
高效液相色谱仪
2．色谱柱(column)：一般直径2-6mm,柱长10-50cm色谱 柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不 同： ① 常 规 分 析 柱 （ 常 量 柱 ） ， 内 径 2~5mm （ 常 用 4.6mm，） ② 窄 径 柱 （ narrow bore ， 又 称 细 管 径 柱 、 半 微 柱 semi-microcolumn ） ， 内 径 1~2mm ， 柱 长 10~20cm ③ 毛 细 管 柱 （ 又 称 微 柱 microcolumn ） ， 内 径 0.2~0.5mm； ④半制备柱，内径＞5mm； ⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；
28
• P230高效液相色谱 仪 • 产品编号： C10372 • 产品型号： P230 • 原产地： 大连
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（一）输液系统
高效液相色谱仪
1、高压输液泵(pump)：泵的种类很多，按输液性质可分为
恒压泵和恒流泵。
恒压泵：指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱
系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，流量精度
11
3 .离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成 的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离
子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不
同而得到分离。 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换 色谱法来进行分离。 不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物 的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子
高效液相色谱固定相和流动相
高压液相色谱HPLC培训教程(六)IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC的固定相和流动相
HPLC的固定相和流动相IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC原理及基本操作
HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。
它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。
1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。
流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。
2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。
这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。
3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。
流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。
4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。
5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。
6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。
固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。
7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。
HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。
2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。
3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。
4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。
5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。
6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。
7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。
8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。
9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。
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不同填料的化学结构是通过对基质材料的 化学改性而实现的。
第十章有机高分子基质HPLC填料
离子交换色谱填料
颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强 弱阴阳离子集团。
反相色谱填料
C18、C8烷基等疏水性集团
正相色谱填料
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避
多糖型凝胶 高聚物树脂
➢基质微球——天然多 糖或合成单体或交联剂 ➢负载样品的能力强， 色谱容量高 ➢耐酸碱、具化学稳定 性，柱寿命长，易再生 ➢不易产生非特异性吸 附作用
无机基质
硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石
石墨化碳黑
第十章有机高分子基质HPLC填料
一、HPLC色谱柱的关键在于填料
• 物理结构→色谱动力学
第十章有机高分子基质HPLC填料
三、填料性能评价
• 填料的物化性质指标 • 填料的色谱性能表征
第十章有机高分子基质HPLC填料
1、物化性质指标:
a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度ρg(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、
溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度Ψ； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。
羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团
亲和色谱填料
蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异 性的配基
第十章有机高分子基质HPLC填料
二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂
基质材料决定填料物理结构和化学结构:
颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构 形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接 影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。
底宽度一半之和的比值。
第十章有机高分子基质HPLC填料
四、反相HPLC高分子填料
Reversed Phase Chromatography,RPC
反相色谱（原理参照P237） ：非极性
固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主， 特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。
分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作 参数选择广泛;
分离纯化+分析检测; 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监
测和自动化操作。
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC的关键设备
① 专用的高压输液系统; ② 高灵敏检测系统; ③ 高效分离柱
• 其中分离柱是色谱的中心, 是最为关键的部分
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章 有机高分子基质的高效液 相色谱分离柱填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
首先回顾几个问题
• HPLC方法的主要特点有那些？ • HPLC的主要设备分哪几部分？
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC方法的主要特点
分离效率高，选择性好，适于各种多元组 分复杂化合物的分离;
应用范围广：无机物—有机物，天然物质 —合成产物，小分子---大分子，一般化合 物到生物活性物质;
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、色谱性能表征:
① 保留值：
保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)
② 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动
相及温度有关。
③ 柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。 ④ 填充柱的总空隙度和穿透性： ⑤ 分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰
与经典色谱的比较
色谱法 固定相粒度 柱长及内径 采用压力 分析速度 经典 大于 100μm 10-100cm φ2-5cm 常压 几十小时 高效 5－10μm 10-30cm φ1-5mm 107Pa 几分钟
第十章有机高分子基质HPLC填料
第十章有机高分子基质HPLC填料
HPLC分离填料：
有机基质
Superdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速 Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶
第十章有机高分子基质HPLC填料
（二）聚合物型基质材料
• 交联聚苯乙烯树脂:
苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)， 是应用最为广泛的一类基质树脂。
• 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:
以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、 环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。
第十章有机高分子基质HPLC填料
2.琼脂糖系:
① Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝 胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)
② 高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow
(Sepharose 6FF, Sepharose 4FF)
③ 高效琼脂糖凝胶Sepharose high Performance
免复杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
第十章有机高分子基质HPLC填料
常见的液相色谱填料类型
多孔型
分：小孔（<10nm）、中 孔（10-30nm）、大孔 （>30nm）和超大孔 （>100nm），应用占主 导地位
非多孔型
整体颗粒无孔
薄壳型
颗粒表面层多 孔，内部无孔。以合成树脂来自基质的产 品，颗粒在10µm左右
可分为:
多糖型 聚合物型
第十章有机高分子基质HPLC填料
（一）多糖型基质材料
1.葡聚糖系:
① 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小 而且分布范围窄（10~23µm）;
Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和
高效色谱 ② 烯丙基葡聚糖与N,N`-亚甲基双丙烯酰胺交联共
聚而成的凝胶。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属 于高效凝胶，较高流速下使用
以多糖凝胶为基质的产 品，颗粒都>20µm左右
以合成树脂为基 质的产品，颗粒 <7µm
同左
第十章有机高分子基质HPLC填料
目前的主要发展方向(研究热点):
① 颗粒单分散的填料; ② 贯穿性超大孔结构的填料; ③ 小颗粒的非多孔填料。
第十章有机高分子基质HPLC填料
2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求