MiRNA-125a-5p对大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障及运动功能的影响
miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用
miRNA-136-5p对急性脊髓损伤模型大鼠炎症因子的作用邓贵营;曾高峰;岑忠喜;高云兵;曹百川;黄建华;宗少晖【摘要】背景:miRNA-136-5p对脊髓损伤后病理改变、炎症反应和再生修复产生重要的调节作用.目的:观察miR NA-136-5p对大鼠脊髓损伤后血清细胞炎性因子、脊髓组织NF-κB蛋白的影响, 探讨其作用分子机制.方法:SPF级雄性SD大鼠36只, 购买于广西医科大学动物实验中心.制备慢病毒载体系统转染脊髓损伤大鼠.改良Allen's法成功建立36只大鼠脊髓损伤模型, 对大鼠进行Basso Beattie Brenham (BBB) 评分, 随机分成正常对照组、模型组 (LV-ctrl+脊髓损伤组) 、过表达组 (脊髓损伤+LV-miRNA-136-5p) 、抑制组 (脊髓损伤+LV-sponge抑制组), 每组9只.手术前7 d及手术当天过表达组、抑制组在损伤区连续注射慢病毒悬液, 正常对照组、模型组注射等量生理盐水.各组在第1, 3, 7天分别处死3只大鼠, 取血、脊髓组织.ELISA测定大鼠血清白细胞介素1β, 白细胞介素6和干扰素α表达水平;Western Blot和双重免疫荧光检测NF-κB蛋白的表达.结果与结论:①术前BBB评分结果无显著差异 (P＞ 0.05);脊髓损伤模型组大鼠活动表现为俯卧位缓慢行走, 出现不同程度的尿潴留, 双后肢的运动、感觉功能完全丧失, 肌肉力量为0, 出现脊髓休克;②与正常对照组相比, 其他3组炎症因子水平均有升高 (P ＜0.05), 过表达组各种炎症因子水平升高更加明显;各组炎症因子水平分别按过表达组、模型组、抑制组顺序逐渐递减;③Western Blot、双重免疫荧光检测NF-κB蛋白表达水平, 模型组、过表达组、抑制组均高于正常对照组 (P ＜0.05), 其中过表达组表达水平最高;④结果提示, miRNA-136-5p对急性脊髓损伤大鼠炎症因子、NF-κB可产生影响.%BACKGROUND: miRNA-136-5 p plays a crucial regulatory role in pathological changes, inflammatory response and regeneration after spinal cord injury. OBJECTIVE: To investigate the effect of miRNA-136-5 p on theexpression of cytokines in serum and NF-κB protein in spinal cord in rats with spinal cord injury and to explore the molecular mechanism. METHODS: Thirty-six male Sprague-Dawley rats, of SPF grade were provided by Laboratory Animal Center of Guangxi Medical University. The lentiviral vector system was prepared and transfected into spinal cord injured rats. Thirty-six rat models of spinal cord injury were established by modified Allen's method. Basso Beattie Bresnahan scores were performed. Rats were randomly divided into normal control, modeling (LV-ctrl plus spinal cord injury), overexpression (spinal cord injury plus LV-miRNA-136-5 p), and inhibition (spinal cord injury plus LV-sponge) groups (n=9/group). Seven days before surgery and the day of surgery, the overexpression and inhibition groups were continuously injected with the lentivirus suspension into the injured area, and the normal control and modeling groups were injected with the same amount of normal saline. Three rats were sacrificed at 1, 3 and 7 days, and blood and spinal cord tissues were taken. The levels of interleukin-1β, interleukion-6 and interferon-α in rat serum were determined by ELISA. The expression of NF-κB protein was detected by western blot assay and double immunofluorescence. RESULTS AND CONCLUSION: (1) There was no significant difference in preoperative Basso Beattie Bresnahan scores (P＞ 0.05). In the modeling group, the rats showed prone walking, vary degrees of urinary retention, and spinal shock, with complete loss of function of both hind limbs and muscle strength of 0.(2) Compared with the normal control group, the levels of inflammatory factors in the other groups were increased significantly (P ＜ 0.05). Theexpression levels of inflammatory factors were highest in the overexpression group, followed by modeling group, and lowest in the inhibition group. (3) Results of western blot assay and double immunofluorescence showed that the expression level of NF-κB protein in the modeling, overexpression and inhibition groups was significantly higher than that in the normal control group (P ＜ 0.05), and the level was highest in the overexpression group. (4) In summary, miRNA-136-5 p can affect inflammatory factors and NF-κB in rats with acute spinal cord i njury.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2019(023)015【总页数】6页(P2397-2402)【关键词】miRNA-136-5p;脊髓损伤;NF-κB;炎症因子【作者】邓贵营;曾高峰;岑忠喜;高云兵;曹百川;黄建华;宗少晖【作者单位】广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市530021;广西生物医药协同创新中心, 广西医科大学, 广西壮族自治区南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院, 广西壮族自治区南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科, 广西壮族自治区南宁市 530021【正文语种】中文【中图分类】R446;R3180 引言 Introduction脊髓损伤引起原发性脊髓组织坏死、细胞溶解及继发性损害，对中枢神经系统造成严重影响，降低患者的生活质量。
外泌体miRNAs在脊髓损伤中的研究进展
·综述·外泌体miRNAs在脊髓损伤中的研究进展周孝敏1,2，鱼丽萍2作者单位1.陕西中医药大学第二临床医学院陕西咸阳7120002.咸阳市第一人民医院神经内科陕西咸阳712000收稿日期2022-11-26通讯作者鱼丽萍135****6941@ 摘要脊髓损伤（SCI）常会导致损伤节段以下严重的运动、感觉以及自主功能障碍，甚至导致死亡。
由于其病理机制复杂多样，目前尚无成功的临床治疗方法。
近年来，微小RNA（miRNAs）在SCI的治疗中受到越来越多的关注。
外泌体是转移核酸、蛋白质、脂质的细胞和组织之间通信的关键介质，同时miRNAs作为外泌体主要内容物参与SCI相关的多种病理生理过程。
大量研究表明外泌体miRNAs不但治疗SCI效果显著，而且可以作为早期诊断SCI的生物标志物。
关键词外泌体；微小RNA；脊髓损伤；综述中图分类号R741；R741.02；R744文献标识码A DOI10.16780/ki.sjssgncj.20210926本文引用格式：周孝敏,鱼丽萍.外泌体miRNAs在脊髓损伤中的研究进展[J].神经损伤与功能重建,2023, 18(8):480-483.Research Progress of Exosome miRNAs in Spinal Cord Injury ZHOU Xiaomin1,2,YU Liping2.1.The Second Clinical School of Medicine,Shaanxi University of Chinese Medicine,Shanxi Xianyang712000,China;2.Department of Neurology,Xianyang First People’s Hospital,Shanxi Xianyang712000,ChinaAbstract Spinal cord injury(SCI)often results in severe motor,sensory,and autonomic dysfunction below the injured level,and even death.Due to the complexity and diversity of its pathological mechanism,there are no successful clinical treatments.In recent years,microRNAs(miRNAs)have received more and more attention in the treatment of SCI.Exosomes are the key communication media between cells and tissues that transfer nucleic acids,proteins and lipids.miRNAs,as the main contents of exosomes,participate in various pathophysiological processes of SCI.A large number of studies have shown that exosomal miRNAs are not only effective in the treatment of SCI,but also could be used as biomarkers for the early diagnosis of SCI.Keywords exosome;microRNA;spinal cord injury;review脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是指由于各种因素导致的中枢神经系统创伤，可引起损伤平面以下运动、感觉和括约肌等功能障碍。
MicroRNA—125 的生理功能及其在疾病中的作用
MicroRNA—125 的生理功能及其在疾病中的作用MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA分子，其可以在转录后水平调节基因表达。
miR-125是在不同种属生物中高度保守的miRNA。
miR-125家族的成员已经被证实能够在多种不同类型的疾病中表达改变，并调控疾病的发生。
此外，miR-125在免疫宿主防御，尤其是在对细菌或病毒的感染中起到至关重要的作用。
本文着重总结了miR-125家族的生理功能以及其在肿瘤以及免疫系统疾病、造血系统恶性疾病、心血管疾病中的作用，也讨论了miRNA家族在未来作为生物标志物和治疗靶点的发展前景。
[Abstract] MicroRNAs （miRNAs）are emerging as small non-coding RNA molecules that regulate gene expression at a post-transcriptional level. miR-125 is a highly conserved miRNA throughout diverse species. Members of miR-125 family have been validated to be changed，exhibiting its different roles in many different types of diseases. Furthermore，miR-125 plays a crucial role in immunological host defense，especially in response to bacterial or viral infections. In this review，summarizes the pathophysiological functions of miR-125 family in various diseases，focusing on carcinoma and host immune responses，malignant diseases in hematopoietic system，cardiovascular diseases and so on，also discuss the potential of miRNA family as promising biomarkers and therapeutic targets for different diseases in future.[Key words] miR-125；Carcinoma；Autoimmune disease；Malignant diseases in hematopoietic system；Cardiovascular diseaseMicroRNAs（miRNAs）是一类18～25 nt长度的小分子非编码单链RNA，miRNAs通过不完全或完全结合到靶基因mRNA的3′非翻译区（3′UTR），从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译，实现对靶基因表达水平的转录后调控，从而参与调控个体发育、细胞代谢、增殖、分化和凋亡等多种生物学过程[1-3]。
miR-125a-5p抑制肝细胞癌的发生（启因生物客户文献系列）
miR-125a-5p抑制肝细胞癌的发⽣（启因⽣物客户⽂献系列）⽂章信息1.研究背景miR-125a-5p在肝细胞癌（HCC）和其他癌症中是⼀种肿瘤抑制因⼦，但在HCC肿瘤发⽣过程中其作⽤机理仍然未知。
2.⽅法2.1 来⾃HCC患者的8对肝癌组织和邻近正常组织使⽤miRNA芯⽚（Shanghai Wcgene Biotech, Shanghai, China）⽐较miRNA的表达情况2.2 细胞转染，对转染后的细胞进⾏qRT-PCR分析，CCK8和菌落形成试验，Western blot分析，以及免疫荧光分析。
2.3 利⽤数据库预测miR-125a-5p的靶基因2.4 建⽴⼩⿏肿瘤模型3.结果3.1 miR-125a-5p在HCC组织和细胞系中下调使⽤微阵列⽐较⼋对HCC组织和邻近正常组织中的miRNA表达。
结果表明，与邻近的正常组织相⽐，HCC组织中的miR-125a-5p表达降低。
此外，qRT-PCR表明miR-125a-5p在HCC细胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表达低于正常肝细胞系（L02）。
图1. （A）在⼋对匹配的HCC组织和相邻正常组织中差异表达的miRNA的热图。
（B）qRT-PCR表明，与邻近的正常组织相⽐，HCC组织中的miR-125a-5p表达下调。
（C）与Starbase中TCGA中相邻的正常组织相⽐，HCC肿瘤组织中的miR-125a-5p表达下调。
（D）qRT-PCR表明，miR-125a-5p在HCC细胞系（Bel-7404，SK-Hep1，Bel-7404和MHCC-97H）中的表达低于正常肝细胞系（L02）。
（E）Kaplan-Meier曲线表明，HCC患者的总体⽣存率与miR-125a-5p表达⽔平⽆关。
3.2 miR-125a-5p在体外抑制HCC细胞增殖并诱导其凋亡分别通过⽤miR-125a-5p模拟物和抑制剂转染，在Bel-7404和SK-Hep1细胞中过表达和敲低miR-125a-5p。
miR-125a-5P
Ｋｉ － ６ ７ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ， ｃ ｅ ｌ ｌ ｍｉ ｇ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｗｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ， ａ ｎ ｄ ｔ ｕ ｍｏ ｒ ｉ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｄ ｂ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ ｙ ｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ｍｉ Ｒ・ － １ ２ ５ ａ ・ ・ ５ ｐ ｏ ｎ ｍｅ ｄ ｕ ｌ ｌ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｏ ｍａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｖ ｏ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｍｉ ｎｏ ｒ ｂ ｅ ａ ｒ ｉ ｎ ｇ ｍｉ ｃ ｅ ｍｏ ｄ ｅ １ ． Ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｆ ｍｉ Ｒ－ １ ２ ５ ａ 一 ５ Ｐ ｉ ｎ ｍｅ ｄ ｕ ｌ ｌ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ ｏ ｍａ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ｓ ｗａ ｓ ｓ ｉ ｇ ｎ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｎ ｔ ｌ ｙ
・
９ ４・
临床儿科杂 志 第 ３ ３ 卷第 １ １ 期 ２ ０ １ ５ 年 １ １ 月 Ｊ Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｐ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ Ｖ ｏ １ ． ３ ３ Ｎｏ ． １ １ Ｎ ｏ ｖ ． ２ ０ １ ５
ｄ ｏ ｉ ： １ ３ ９ ６ ９ ／ １ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ Ｏ Ｏ ０ — ３ ６ ０ ６ ． ２ ０ １ ５ ． １ １ ． ０ １ ４
miRNA在急性脊髓损伤病理生理调节机制中的作用研究进展
为 三类 ： பைடு நூலகம் １ ） 表达 上调 ； （ ２ ） 表 达下调 ； （ ３ ） 损 伤后 早期 （ ４ ｈ
能恢复 ， 并 且 在 中 枢 神经 系统 纤 维 化 中起 重 要 作 用 １ ８ １ 。 Ｓ ｕ ｎ ｇ
等［ ９ １ 发 现 Ｒｈ ｏ Ａ 在斑 马 鱼 Ｓ ＣＩ 后 出现 基 因 表 达 上 调 且 可 抑
制 损 伤 后运 动功 能 的恢 复 。 通 过下 调 Ｓ Ｃ Ｉ 后 ｍｉ Ｒ 一 １ ３ ３ ｂ的 表达可导致 Ｒ ｈ ｏ Ａ 基 因 表 达 水 平 较 对 照 组 明显 升 高 ， 从 而 抑制斑马鱼 Ｓ Ｃ Ｉ 后 轴 突再 生 ， 减缓 运 动 功 能 的 恢 复 。 相反 ，
１ ０ ２ ２
中国脊柱脊髓杂志 ２ ｏ １ ３年第 ２ ３卷第 １ １ 期 Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆＳ ｐ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ Ｓ ｐ ｉ ｎ ａ ｌ Ｃ ｏ ｒ ｄ ， ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ３ ， Ｎ ｏ ． １ １
Ｓ Ｃ Ｉ 后 尝 试 抑 制 对 损 伤 修 复 的 不 利 因 素 ．然 而 因 为 某 种 原
因这 种 尝 试失 败 了。 总之 ． Ｓ Ｃ Ｉ后 ｍｉ Ｒ一１ ３ ３ ｂ可 通 过 对
Ｒ ｈ ｏ Ａ蛋 白的 调 控影 响轴 突 再 生 从 而 在 损 伤 后 修 复 过 程 中 发 挥作 用 。
ｍＲ Ｎ Ａ的３ 非 翻 译 区 相应 碱 基 配 对 ，导 致 靶 ｍＲ Ｎ Ａ 的 降 解 或 者 抑 制 其 翻译 过 程 ，从 而 对 基 因 表 达 进 行 转 录 后 调
控。 近 年来 研 究 发 现 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ广 泛 参 与 炎 症 、 发育 、 凋亡 、 肿 瘤 等 多 种病 理 生 理 过 程 的 调 节 ＿ ３ １ １ ， 且有 相关 文献 报道 在 急 性 Ｓ Ｃ Ｉ 后可继发多种 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 的表 达 失 调 ｌ 引 ，提 示 ｍ ｉ Ｒ Ｎ Ａ
miR-125a-5p在消化及呼吸系统肿瘤中表达水平及在肿瘤发生发展的作用
miR-125a-5p在消化及呼吸系统肿瘤中表达水平及在肿瘤发生发展的作用MicroRNA(miRNA)一种成熟的、小的、非编码的、单链、高度保守的内源性RNAs，通过与靶信使RNA(mRNA)3'端的非翻译区(3'UTR，untranslated regions)，近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而抑制靶蛋白编码基因的翻译及表达。
到目前为止，人们已经发现了几百种miRNA。
在人类的所有基因谱中，miRNA具有多种生物学功能，调控多种生物学过程，参与细胞的发育、代谢、分化、增殖、自噬和凋亡等。
越来越多的研究表明: miR-125家族在很多实体肿瘤中发挥抑癌基因功能，因靶基因的不同，miR-125a的表达水平不一致。
在不同肿瘤中表达程度亦不相同，提示miR-125a在不同肿瘤的发生发展过程中可能发挥不同的作用。
在多种实体肿瘤中检测到miR-125a的表达减少，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及胶质母细胞瘤。
miR-125a与肿瘤细胞的生长、分化及转移存在密切的关系，但在不同的癌组织中存在上调或下调不一致表达的现象。
目前，对于miR-125a研究多集中miR-125a-5p,为明确其在肿瘤发生发展中的作用，探寻肿瘤治疗的新靶点提供理论依据，寻求肿瘤诊断及预后判断新的生物标志物。
1. miR-125a-5p在胰腺癌中的表达水平及促进癌细胞恶性转化作用胰腺癌发病隐匿，早期诊断率低，大约95％的胰腺癌患者在明确诊断时己进入中晚期，是导致其高死亡率的主要原因。
因此急需寻找一种可以用于胰腺癌早期诊断的标志。
最新的研究结果显示，循环miRNAs尤其是外周血中的miRNAs稳定表达，其表达谱在疾病状态下出现异常改变，可能成为潜在的疾病检测评估指标及治疗靶点。
贾丛伟等人研究发现， 4个胰腺癌细胞系miR-125a-5p的表达均高于癌旁正常组织，下调miR-125a-5p的表达水平可抑制Pane-1、MIA PaCa-2两个细胞系的生长及增殖能力。
科技期刊出版中伦理问题的基本要求
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社长的话 From President科技期刊出版中伦理问题的基本要求2018年11月发生的“人类基因编辑婴儿”事件，引发了全社会范围对科学研究伦理问题的关注与担忧。
随着生物医学科学研究的快速发展和生物医学研究伦理审查工作的逐步深入，迫切需要加强科研伦理管理。
除了各大科研高校以及教学医院外，科技期刊出版过程也与科研伦理息息相关。
文章将从4个部分分别介绍科技期刊出版中的伦理问题。
1、科研伦理的法律法规现代生物医学技术的飞速发展为诊断治疗疾病、增进人类健康提供了新的手段，同时，因生物医学新技术临床研究风险和技术难度大，存在较多不可预料或不可控风险，当实施、管理不当时，便可能出现威胁公共安全、危害受试者健康权益的情况。
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MiRNA-125a-5p对大鼠脊髓损伤后血脊髓屏障及运动功能的影响Dai Guoyu;Liu Jisong;Li Jian;Liu Wenrui;Li Gang;Bi Yunlong;Cao Yang【摘要】目的:通过干预大鼠脊髓中miRNA-125a-5p的表达量,探讨miRNA-125a-5p在脊髓损伤(SCI)后对血脊髓屏障(BSCB)的作用及对大鼠运动功能的影响.方法:SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、miRNA空载组(NC组)和miRNA-125a-5p agomir鞘内注射组(miRNA组).RT-PCR检测miRNA-125a-5p在各种大鼠脊髓中的表达,免疫印迹和免疫荧光实验检测脊髓微血管内皮细胞间紧密连接蛋白(ZO-1)表达,尼氏染色观察脊髓前角运动神经元的数量以及通过BBB评分评价大鼠运动功能恢复.结果:MiRNA组的miRNA-125a-5p 的相对表达量明显高于SCI组,且ZO-1的mRNA的相对表达量和相对蛋白质表达量较SCI组和显著增加.MiRNA组的脊髓前角运动神经元相对数量明显多于SCI 组.MiRNA组大鼠脊髓损伤后1d、3d、7d、14d、21d和28 d运动功能恢复明显优于SCI组.结论:MiRNA-125a-5p可以有效保护脊髓损伤大鼠的血脊髓屏障功能并促进运动功能恢复.【期刊名称】《解剖学杂志》【年(卷),期】2019(042)003【总页数】6页(P225-230)【关键词】脊髓损伤;血脊髓屏障;miRNA-125a-5p;紧密连接蛋白ZO-1【作者】Dai Guoyu;Liu Jisong;Li Jian;Liu Wenrui;Li Gang;Bi Yunlong;Cao Yang【作者单位】;;;;;;【正文语种】中文脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）主要包括原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤主要是指脊髓受到直接的外力作用而造成的脊髓机械性损伤并伴有直接的肢体感觉异常和运动障碍[1]。
继发性损伤主要是指在脊髓损伤后损伤部位向头尾纵轴方向蔓延并继发性出血水肿以及炎症浸润等不良反应所造成的损伤[2-3]。
在继发性损伤中血脊髓屏障（blood spinal cord barrier，BSCB）内皮细胞功能的减弱直接导致了脊髓血管通透性增加造成脊髓微环境的改变；有害物质大量沉积再次加重脊髓的损伤；这些情况对脊髓损伤的预后产生了极其不良的影响[4]。
因此在治疗原发性脊髓损伤的同时，有针对性的维持BSCB的功能可能是治疗脊髓损伤的切入点[4-5]。
但目前能够改变BSCB作用的有效方法很少。
MicroRNA-125a-5p （miRNA-125a-5p）是miRNA-125家族中的一员，它是1种大小约22个碱基组成的单链小分子内源性具有调控功能的非编码RNA[6]。
目前研究表明miRNA-125a-5p在脊髓损伤后72 h明显下调，此时也是脊髓损伤后BSCB开放的高峰期，因此推测miRNA-125a-5p可能与BSCB的作用有关[7-8]。
本研究是在大鼠鞘内注射miRNA-125a-5p的模拟物（miRNA-125a-5p agomir）增加脊髓的miRNA-125a-5p的含量后检测紧密连接蛋白（tight junction protein，ZO-1）的表达、前角神经元数量和对大鼠进行BBB评分，观察和评价miRNA-125a-5p在大鼠脊髓损伤中的作用，为脊髓损伤的研究提供新的方向。
1 材料和方法1.1 实验动物及分组48只150～180g SPF级SD大鼠由锦州医科大学实验动物中心提供。
大鼠随机分为假手术组（Sham组）、脊髓损伤组（SCI组）、miRNA空载组（NC组）和miRNA-125a-5p agomir鞘内注射组（miRNA组），每组12只。
采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，注射剂量为3 μl/g，其中Sham组为只去除第11胸椎（T11）节段椎板暴露第10胸椎（T10）节段脊髓且不对脊髓进行打击的空白对照组；SCI组为去除椎板暴露T10节段脊髓后用自制的Allen打击器进行脊髓打击的单纯脊髓损伤的对照组；NC组为在脊髓打击前3 d每隔24 h注射1OD无功能miRNA空载基因的鞘内注射的阴性对照组，miRNA组为脊髓打击前3 d每隔24 h注射1OD的miRNA-125a-5p agomir的miRNA-125a-5p高表达组。
其中miRNA空载组是含miRNA成熟体的双链无功能基因序列并不表达基因功能，miRNA-125a-5p agomir是根据miRNA-125a-5p成熟体设计并针对提高体内稳定性而进行化学修饰合成的双链miRNA模拟物，agomir是在miRNA反义链上进行化学修饰，3'端胆固醇修饰，5'端2个硫代修饰，3'端4个硫代修饰的1种新型的miRNA模拟物。
miRNA-125a-5p agomir由江苏吉玛生物公司提供。
注射部位为大鼠第3腰椎与第4腰椎椎骨间隙。
打击方式均对暴露节段中心进行垂直打击，打击重量为20 g、打击高度为2 cm，打击后大鼠双侧后肢和尾部均有强直而后瘫痪，造模时对不标准的模型给予剔除并及时添加。
待各组实验动物苏醒后安放回鼠笼，正常水食精心饲养72 h，其中每组各随机抽取3只饲养至28 d并按时间点记录大鼠运动功能的变化情况。
1.2 RT-PCR检测1.2.1 miRNA-125a-5p 造模后72 h取各组损伤点前后1 cm的新鲜脊髓液氮研磨，TRIzol法分别提取总RNA后分别进行miRNA和mRNA的检测，miRNA逆转录成cDNA，体系为20 μl。
以cDNA为模板，再以miRNA-125a-5p和U6的引物进行扩增，体系为50 μl。
扩增后取产物20 μl行RNA凝胶电泳并观察凝胶成像结果。
所用引物序列如表1。
表1 引物序列Tab1 Sequences of the primersGene Primer sequenceMiRNA-125a-5p Forward：5'-CACAGTTCCCTGAGACCCT-3'Reverse：5'-TATGGTTGTTCTGCTCACTGTCTC-3'U6 Forward：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'Reverse：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCATC-3' 1.2.2 ZO-1 mRNA mRNA的逆转录以随机引物为模板逆转录合成cDNA，体系为20 μl，以此cDNA产物为模板以ZO-1和β-actin的引物扩增，体系为50 μl。
取产物20 μl进行RNA凝胶电泳并成像观察结果。
所用引物序列如表2。
表2 引物序列Tab2 Sequences of the primersGene Primer sequence ZO-1 Forward：5'-ATCCCACAAGGAGCCATTCC-3'Reverse：5'-GTCACAGTGTGGCCAAGCGTA-3'β-actin Forward：5'-CTCTGTGTGGATTGGTGGCT-3'Reverse：5'-AGCTCAGTAACAGTCCGCCT-3' 所有引物均由北京鼎国昌盛公司提供，TRIzol、miRNA和mRNA的逆转录和扩增试剂盒购于TaKaRa公司。
1.3 免疫印迹法检测ZO-1蛋白的表达72 h取损伤点脊髓在RIPA裂解液中匀浆、提取总蛋白，定量后制备样品。
样品采用6%SDS-PAGE电泳，时长90 min，0.45 μm孔径的PVDF膜湿转150 min 继而用1%胎牛血清白蛋白封闭2 h，1∶250的ZO-1一抗和1∶1 000的β-actin一抗4℃孵育过夜。
次日TBST洗5 min×3次，二抗室温孵育2 h，化学发光法显色。
1.4 免疫荧光组织化学法检测ZO-1蛋白的表达72 h后取各组大鼠3只麻醉，左心室插管灌注预冷的0.9%生理盐水待流出液清澈后4%多聚甲醛灌流直至大鼠颈部强直四肢尾部僵硬。
取材浸泡于4%多聚甲醛中48 h后于30%蔗糖溶液中待组织悬浮。
擦干组织OTC包埋后速冻，徕卡冰冻切片厚度为6 μm。
取切片恢复至室温，10%山羊血清封闭2 h，1∶50的ZO-1 一抗4℃孵育过夜。
滴加1∶50的FITC标记的二抗，室温避光孵育2 h。
DAPI染色1 min并用50%甘油封片。
荧光显微镜下观察荧光强度和血管形态。
1.5 尼氏染色取冷冻切片室温干燥1 h后浸染于60℃焦油紫染液1 h。
取出切片蒸馏水洗涤3 min×2次后擦去多余染液，浸入分化液分化，分化时间根据染色程度进行调整，通常情况下不超过3 min。
分化后依次乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜镜下观察。
1.6 BBB评分取各组大鼠3只标记后混合单盲法观察分别在1、3、7、14、28 d 5个时间点观察其爬行并记录各组大鼠髋、膝、踝关节活动度每项计2分；记录大鼠步态的协调能力计5分；躯体的负重能力计5分以及后肢小关节精细运动能力计5分。
根据BBB评分核定后肢各功能情况总分为21分，计算各组大鼠BBB分数进行统计分析。
在观察前需排空大鼠膀胱，观察地点应选取宽敞无障碍且清洁的空地。
1.7 统计学处理采用SPSS16.0软件分析处理，所有数据均采用±s表示，利用Image J软件求出各组灰度值，PS6.0统计荧光强度，并用GraphPad软件做出相应统计图并计算P 值。
两组之间采用t检验。
2 结果2.1 miRNA-125a-5p的相对表达水平脊髓损伤后的SCI组中miRNA-125a-5p的相对表达量明显低于Sham组。
SCI 组和NC组miRNA-125a-5p的相对含量差异没有统计学意义（P＞0.05）。
脊髓鞘内注射miRNA-125a-5p agomir后，脊髓损伤部位的miRNA-125a-5p相对含量为1.37±0.04，是SCI组（0.55±0.06）的2.4倍，差异具有统计学意义（P ＜0.05，图1）。
2.2 ZO-1 mRNA的相对表达水平损伤后ZO-1 mRNA的相对表达量明显下调；SCI组和NC组的ZO-1 mRNA的相对表达量差异没有统计学意义。
MiRNA组中ZO-1的mRNA相对表达量为0.90±0.10，是SCI组（0.55±0.06）的1.6倍，且二者之间的差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。
图1 大鼠脊髓miRNA-125a-5p相对表达量的RT-PCR分析Fig1 RT-PCR analysis of the relative expression of miRNA-123a-5p in the spinal cord of each group of rats*P＜0.05 vs SCI group2.3 ZO-1的蛋白表达水平图2 大鼠脊髓紧密连接蛋白ZO-1相对表达量的RT-PCR分析Fig2 RT-PCR analysis of the relative expression of tight junction ZO-1 gene in the spinal cord of each group of rats*P＜0.05 vs SCI group免疫印迹法结果显示ZO-1的相对表达量同ZO-1 mRNA的相对表达量趋势相同，Sham组ZO-1的相对表达量为1.46±0.25。