感受态细胞和质粒DNA的转化
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
感受态细胞和质粒DNA的转化(C)
质粒DNA可以用于基因治疗， 将正常的基因导入病变细胞， 纠正或补偿缺陷基因。
质粒DNA可以用于构建转基因 植物、动物和微生物，用于生 物工程领域的研究和应用。
03
感受态细胞与质粒DNA的转化过程
转化方法
CaCl2法
通过使用CaCl2处理细胞，使 细胞处于易于吸收外源DNA的 状态，然后加入质粒DNA进行 转化。
在基因工程领域的应用
基因克隆与鉴定
将目的基因插入质粒中，通过转化感受态细胞实 现基因克隆与鉴定。
基因敲除与突变
利用感受态细胞将突变基因导入细胞，实现基因 敲除或突变。
基因表达分析
通过将目的基因导入感受态细胞，分析目的基因 的表达情况，研究基因功能。
转化技术的发展与展望
技术优化
不断优化感受态细胞的制备和转化条件，提高转化效率和稳定性。
应确保质粒DNA的浓度、纯度和分子量符合要求，以提高 转化效率。
转化液的选择
根据不同的转化方法选择适当的转化液，如CaCl2溶液或电 穿孔缓冲液。
转化效率
影响因素
感受态细胞的制备、质粒DNA的质量、转化液的选择、温度、pH 值等都会影响转化效率。
提高转化效率的方法
优化感受态细胞的制备条件、选择高质量的质粒DNA、调整转化 液成分、控制适宜的温度和pH值等。
感受态细胞和质粒DNA的转化
目
CONTENCT
录
• 感受态细胞介绍 • 质粒DNA介绍 • 感受态细胞与质粒DNA的转化过程 • 转化后的筛选与鉴定 • 感受态细胞与质粒DNA转化的应用
与展望
01
感受态细胞介绍
感受态细胞的定义
感受态细胞是指在特定条件下，能够接受外源DNA并使其转化进 细胞内的细菌细胞。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理是通过一种称为转化的机制进行的。
转化是细菌之间通过吸收外源DNA并将其融合到自身基因组中的过程。
感受态细菌是对外源DNA（如质粒）具有接受能力的细菌。
转化包括以下几个步骤：
1. 准备感受态细菌：通常使用复苏液处理细菌，复苏液中包含一些醣化剂或离子（如Ca2+）等物质，可以使细胞膜变得更容易渗透。
2. 吸收外源DNA：将质粒与感受态细菌一起暴露在低温、高电压或添加特定溶液条件下，使质粒能够进入细菌细胞。
3. DNA融合：在感受态细菌内，外源DNA通过DNA酶等酶的作用，与细菌染色体发生重组。
这样，外源DNA的片段可以被整合进细菌基因组中。
通过上述步骤，质粒可以被转入感受态细菌中。
感受态细菌在接受外源DNA后，它可能会表达质粒中的基因，从而产生质粒编码的特定蛋白质。
这种转化的机制被广泛应用于基因工程和遗传学研究中。
直接给出感受：通过质粒转化的过程，感受态细菌可以获得质粒中所携带的额外基因信息，这些额外基因信息可以被细菌利用，产生新的蛋白质，赋予细菌新的
功能或性状。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞和质粒DNA的转化
⑨ 取100~200uL，臵于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻
璃棒涂匀；静臵5~10分钟。
⑩ 倒臵37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增， 提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。 并设下列对照： A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。ห้องสมุดไป่ตู้B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好
抗生素的配制
抗生素
工作浓度 松驰型质粒 60ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水） 氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan)
34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）
170ug/mL 50ug/mL
25ug/mL 10ug/mL
链霉素(Sm)
四环素(Tc)
10mg/mL（水）
处使DNA鲜旋。 ③ 线状DNA 琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分 开，Agrose电泳中 cccDNA位置最前。
二、阅读微生物的基因型符号
在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表 现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映 的是可观察到的特性。 1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在 描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不 必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给 出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和 metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然 正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因 (如trp) 时，可以用 trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到 它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示 lon基因的缺失突变。
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Phagemid
-20℃
Enzyme
-20℃
Buffers
-20℃
Primer
-4℃
Thiodeyivatives
-20℃
Ribonucleotides
-20℃
Helper phage
-4℃
置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次
抗生素的配制
抗生素
工作浓度
松驰型质粒
严紧型质粒
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水）
60ug/mL
20ug/mL
氯霉素(Cm)
34mg/mL（乙醇） 170ug/mL
25ug/mL
卡那霉素(Kan) 50ug/mL（水）
50ug/mL
链霉素(Sm)
10mg/mL（水）
50ug/mL
四环素(Tc)
5mg/mL（乙醇） 50ug/mL
10ug/mL 10ug/mL 10ug/mL
大肠杆菌感受态细胞制备和贮存
稳定期(饱和期)，约1×109
~2×108/mL和衰老期。
2. 菌株的保存
大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株 在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同 条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株 比大肠杆菌X1776株保存期长。
所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再 做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生 长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。
琼脂穿刺培养基
琼脂（Difco）
6g
细菌胰蛋白胨
（Difco）
10g
NaCl HCl ddH2O
8g 20mg 至1L
2×冰冻培养基
K2HPO4
12.6g
N++-柠檬酸
0.19g
MgSO4＞H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 甘油 dH2O
0.18g 1.8g 3.6g 88g 至1L
高压灭菌
新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在-70℃干冰或液氮气体 部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。
两种假设：
① CaCl2处理4℃，0.1M低渗CaCl2处理使细菌表面的细胞 壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁， 俗称“打孔”，使DNA分子能够进入细胞内。
具体保存方法： ① LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成 单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔 绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。
E. coli菌株的生存期差别大：有些菌株在液体培养基中， 4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。
② 穿刺琼脂(stab agar)，室温，避光可保存数年。
③ 冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入1050%甘油培养基中，分装，置-20～ -70℃。可经过30次冻融， 细菌仍然存活。
菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速 冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。
菌株保存液的配制
在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体 DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA 复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌 宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大 肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆 菌缺乏天然的转化机理。1970年M. Mandela 和A. Higa提 出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌， 能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞 称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转 化频率。目前对这种机制尚不清楚。
HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL） X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）
④ 细菌培养管取出置水浴中，10~15分钟。 ⑤ 细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清， 留沉淀置于冰浴中。 ⑥ 加0.1mol/L CaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中 20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。 ⑦ 4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，弃上清，留沉淀，置冰浴中。 ⑧ 用预冷的0.1mol/L CaCl2溶液2.5mL，小心轻轻悬浮沉淀，4℃过夜。 可直接使用。 ⑨ 次日加20%(最终浓度)灭菌预冷甘油。 ⑩ 分装成每Eppendorf管200uL。
感受态细胞和质粒DNA的转化
重组DNA分子导入受体细胞
导入大肠杆菌: 氯化钙转化法 electroporation 电击法又叫电穿孔法 体外包装感染法
重组DNA导入哺乳动物细胞:
DNA- 磷酸钙共沉淀、 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导法、 原生质体融合法
酵母菌转化法:
完整细胞转化法 原生质体转化法 电击法
② CaCl2处理使感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的 酶位点，使DNA分子能进入细胞。在细菌中能发展为感受 态细胞占极小数，只有感受态的细胞才能稳定的摄取外来 DNA分子。保持感受态的时间约1~2天，一般出现在生长 对数期的后期。
感受态细胞(Compenent cells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化
到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。 (主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)
① 取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜 (一般16小时)。 ② 取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振 培养，过夜(8~16 小时)。 ③ 取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。 37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)， OD550达0.3~0.5。 注意：不同的大肠杆菌菌株，每mL培养物中细菌存活数与光密度值 间关系不同。
大肠杆菌(EscheEscherichia coli)大约含 3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。
革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度 37℃，PH7.0～7.6 (一般7.4)，保存加 甘油，培养皿密封。
大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期
(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、