PCR技术详细步骤.
pcr的基本步骤
pcr的基本步骤
PCR是一种基因扩增技术，可在特定的温度下，通过DNA聚合酶酶解DNA链，将DNA复制。
PCR的操作步骤非常关键，下面我们将一一介绍。
1. 提取DNA样品
PCR前需要从不同来源提取DNA样品。
例如，可以从口腔、血液、组织和细胞等不同来源中提取DNA样品。
2. 设计引物
PCR过程中，引物起到非常重要的作用，它们在扩增DNA时起到定位特定目标序列的作用。
通过设定引物可以扩增对人类、动植物种群的分子分析、遗传诊断、DNA指纹技术、疾病检测等。
3. 反应液配制
PCR反应液配制非常重要，因为处理步骤、试剂品质、试剂纯度、水平等因素直接影响PCR扩增。
在反应液组成方面，PCR反应液一般包括低盐缓冲液、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板DNA等。
4. PCR反应
PCR反应是PCR的核心步骤。
反应可分为三个步骤：起始温度循环、加温（单样本）、退温和延伸步骤。
这三个步骤会在PCR循环中进行，就像一个复杂的化学机器，大幅缩短了扩增的模板DNA。
5. 电泳分析
电泳分析是一种确定PCR反应是否成功的重要方法。
在PCR反应后，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶上，然后通过电场通过凝胶，最终产生电泳图像，以确定扩增的DNA大小，是否纯净、其质量，以及PCR 扩增率高低。
当然了，电泳分析也可以分辨出皮肤受伤时留下的DNA。
总的来说，PCR技术可以说是生命科学中最重要的技术之一。
科学家们可以使用PCR技术直观地观察、修改、了解PCR。
事实上，随着PCR技术的使用逐年增多，它也为生命科学的重要发展带来了很多的帮助和作用。
pcr四个步骤
pcr四个步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的生物分子扩增技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、犯罪调查等领域。
PCR通常包括四个关键步骤：变性、退火、延伸和终止。
下面将详细介绍PCR的四个步骤及其在实验中的应用。
第一步：变性（Denaturation）变性是PCR的第一步，其目的是将DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步通常在94-98℃的高温条件下进行，高温能够破坏DNA 的氢键，使DNA解开。
变性步骤在PCR中非常重要，因为它为后续步骤提供了单链DNA 模板。
在变性后，每个DNA模板都可以与引物（引导DNA扩增的短DNA片段）结合形成PCR产物。
第二步：退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板序列特异性结合。
在退火步骤中，温度降至50-65℃左右，使引物与DNA模板的互补碱基序列相互结合。
引物是为了扩增目标DNA序列而设计的短DNA片段，通常包含20-30个碱基。
引物的互补碱基序列与目标DNA序列的两个末端相对应，使引物能够与目标DNA序列的两个末端结合。
第三步：延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是通过DNA聚合酶酶活性，在引物的引导下合成新的DNA链。
在延伸步骤中，温度通常在65-75℃之间，取决于所使用的DNA聚合酶。
DNA聚合酶是一种酶，能够识别引物与DNA模板结合的区域，并在该区域上合成新的DNA链。
延伸步骤会在每个引物结合的DNA模板区域合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
第四步：终止（Termination）终止是PCR的最后一个步骤，其目的是阻止DNA链的继续合成。
在终止步骤中，温度通常在72℃左右，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
终止步骤中使用的方法是在PCR反应体系中加入一种特殊的终止试剂，该试剂能够在DNA合成链上添加一个无法与其他核苷酸连接的特殊核苷酸。
这样，当DNA链合成到终止试剂所添加的核苷酸时，DNA聚合酶无法进一步合成，从而终止了DNA的扩增。
PCR原理和步骤
PCR原理和步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA的特定区域，它主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR的原理是通过DNA复制过程的模拟，在体外扩增DNA片断。
PCR 的基本原理可以归结为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
1.PCR反应的第一步是变性。
在变性步骤中，PCR反应混合液中的DNA双链会在高温条件下被分离成两条单链。
这一步骤通常在94-96°C 的高温下进行，以破坏DNA的氢键，并使DNA分离成两条单链。
2. PCR反应的第二步是退火。
在退火步骤中，PCR反应混合液中的引物（primers）会结合到DNA模板的特定区域。
引物是一小段具有互补序列的单链DNA片段，可以识别并结合到目标DNA区域。
退火温度一般在40-60°C之间，可根据引物序列的碱基组成和长度进行调整。
3. PCR反应的第三步是延伸。
在延伸步骤中，引物结合到DNA模板的3'端后，DNA聚合酶会在引物的引导下，在引物的3'端延伸新的DNA 链。
反应液中通常包含一种热稳定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
这种酶可以耐受高温，因此可以在反应温度为72°C时进行DNA延伸。
上述三个步骤组成了PCR的一个循环。
在一次循环之后，生成的DNA 分子数目增加一倍，而每个新的DNA分子都可以被用作下一轮PCR反应的模板。
通过连续进行PCR循环，可以迅速、精确地扩增目标DNA片段。
PCR反应混合液中的其他成分包括缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）、Mg2+（镁离子）、引物和模板DNA。
缓冲液提供适当的pH和离子环境，为酶活性提供最佳条件。
dNTP是构建新DNA链所需的四种脱氧核苷酸单元。
Mg2+是DNA聚合酶的辅因子，促进酶的活性。
引物是特异性结合到目标DNA片段的短DNA片段。
模板DNA是PCR扩增的起始材料。
PCR的应用十分广泛。
pcr操作过程
pcr操作过程
PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于扩增特定DNA片段。下 面是PCR操作的一般步骤：
1. 样本准备：收集需要扩增的DNA样本，并进行必要的预处理，如提取DNA、纯化等。
2. PCR反应液的制备：根据PCR反应的要求，准备PCR反应液。PCR反应液通常包括 DNA模板、引物（前向和反向引物）、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs（四种脱氧核苷酸） 和水。
5. 结果分析：PCR反应完成后，可以通过凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析。凝胶 电泳可以用来检测扩增的DNA片段的大小和纯度。
pcr操作过程
需要注意的是Байду номын сангаасPCR操作过程中应严格遵守无菌操作、避免污染，以保证PCR反应的准确 性和可靠性。此外，根据具体的实验目的和要求，可能需要进行一些额外的步骤，如设计引 物、优化PCR反应条件、进行质控等。
pcr操作过程
3. PCR反应条件的设置：根据目标DNA片段的长度和引物的特性，设置PCR反应的温度 和时间参数。通常包括初始变性步骤（94-98°C，几分钟）、循环扩增步骤（变性、退火和 延伸，通常在50-70°C之间，时间取决于引物和目标片段的长度）、最终延伸步骤（72°C， 几分钟）。
4. PCR反应的进行：将PCR反应液加入PCR反应管或板中，放入热循环仪中进行PCR反应 。热循环仪会根据设置的温度和时间参数，自动进行PCR反应的循环。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
PCR技术详细步骤.
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂 三，PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 四，PCR步骤 1， 准备100ul EP管 2， 依次在管中加入：（50ul反应体系） ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？ 25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3， 稍离心 4， 100℃沸水浴1分钟 5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作） 6， 再加入50ul液体石蜡封闭 7， 10000rmp离心1分钟 8， PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec 进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。 9，10000rmp离心5min 10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。 6 电泳鉴定 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）吸头：20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个
Hale Waihona Puke 至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量 ×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积） 1， 准备0.65ml的EP管 2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA， 1uldNTP，短暂离心。 3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。 4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。 5， 短暂离心 6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。 7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8， -20℃保存，或立即进行PCR。 用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积） 1， 准备0.65mlEP管 2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3， 稍离心，100℃沸水裕1min 4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6， 100℃沸水裕3min灭活AMV 7， 立即PCR或-20℃保存。 5 聚合酶链式反应（PCR） 二，准备工作 8， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、100ul 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增DNA片段，能在短时间内从极少量的DNA样本中大量产生目标DNA片段。
PCR的原理和操作步骤如下：PCR原理：PCR是通过逐渐增加的方式在体外复制DNA片段的技术，它包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将含有目标DNA的样本加热至94-96℃，使DNA双链解开，产生两个单链DNA。
2. 退火（Annealing）：将温度降至50-65℃，引入一对寡核苷酸引物/引模，它们在目标DNA的两个末端特异性结合。
引物的设计与目标DNA的序列互补。
其中的一段是在目标DNA序列的正向链上引物，另一段是在反向链上的引物。
3. 延伸（Extension）：将温度升至72℃，引入热稳定的DNA聚合酶，使其延伸引物，生成新的DNA链。
延伸的速度约为300-1000个碱基每分钟。
如此一来，经过一次PCR循环，两条由引物引导的DNA链将被复制一次，重复进行多次PCR循环，DNA量会呈指数增长。
PCR操作步骤：1.DNA模板制备：从细胞中提取DNA，常用方法有裂解法和酶切法。
通过这些方法获得的DNA片段可作为PCR的模板。
2.引物设计：根据所需扩增的DNA序列设计引物。
引物通常由15-30个核苷酸组成，选择引物时要注意避免二聚体形成和引物之间的副产物形成。
3.反应体系设置：将PCR反应液配置至PCR试管或96孔板中，反应体系一般包括PCR缓冲液、dNTPs、模板DNA、引物、Mg2+离子和聚合酶等成分。
4.PCR循环程序：通常包括初步变性程序、循环变性程序和末端延伸程序。
初步变性程序为94-96℃，1-3分钟；循环变性程序为94-96℃，10-30秒；退火温度为50-65℃，20-60秒；延伸温度为72℃，20-60秒，延伸时间根据目标片段的长度确定，每一循环的延伸时间通常为片段长度的1-2秒。
PCR技术包括哪三步程序和步骤及步骤
PCR技术包括哪三步程序和步骤及步骤引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项常用的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、犯罪学等领域。
PCR技术的原理是通过复制和扩增DNA片段，使得少量的DNA可以被快速增加到大量，从而方便后续的实验分析。
本文将介绍PCR技术的三个步骤，并详细描述每个步骤的具体操作。
PCR技术的三个步骤PCR技术一般包括三个步骤，分别是变性、退火和延伸。
下面将对每个步骤逐一进行介绍。
1. 变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，其目的是将DNA模板的双链分离为两条单链DNA。
在PCR反应中，常用的变性温度为94-98摄氏度。
变性温度的选择取决于所用的DNA模板的GC含量和所需扩增片段的长度。
变性步骤通常在PCR反应器中进行，将PCR反应器置于热循环仪中，温度快速升至变性温度并保持一段时间，通常为30秒至1分钟。
2. 退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板的单链DNA片段结合。
引物是PCR反应中的关键组分，它们是一对具有互补碱基序列的短DNA片段。
在PCR反应中，引物的选择和设计非常重要，其碱基序列应与待扩增的目标DNA片段的两端相互匹配。
退火步骤通常在低温条件下进行，温度通常为50-65摄氏度。
在退火温度下，引物与DNA模板的单链DNA片段发生互补碱基序列的结合，形成引物-模板复合物。
退火时间一般为20-30秒。
3. 延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是将引物-模板复合物延伸为双链DNA。
延伸步骤是通过加入DNA聚合酶酶和适当的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）来实现的。
延伸步骤通常在较高温度下进行，温度通常为72摄氏度。
在延伸温度下，DNA聚合酶将dNTPs逐个加入到引物末端，以聚合成一条新的DNA链。
延伸时间的长度取决于所需扩增片段的长度，通常为1-2分钟。
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三，抽提步骤 1． 匀浆化作用 取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨 组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗， 后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。 2． 分离阶段 每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分 混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。 3． RNA的沉淀 将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙 醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。 3 4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤 RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。 5． RNA的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA 沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶 性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。 6，RNA的保存 提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 TRIzol法抽提总RNA 细胞1×107 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓
至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量 ×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积） 1， 准备0.65ml的EP管 2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA， 1uldNTP，短暂离心。 3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。 4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。 5， 短暂离心 6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。 7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8， -20℃保存，或立即进行PCR。 用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积） 1， 准备0.65mlEP管 2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3， 稍离心，100℃沸水裕1min 4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6， 100℃沸水裕3min灭活AMV 7， 立即PCR或-20℃保存。 5 聚合酶链式反应（PCR） 二，准备工作 8， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、100ul 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定
RNA抽提 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1） 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 吸头：1ml、200ul、20ul （3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个 （4） EP管1.5ml、100ul （5） 玻璃研磨器 （6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用） 2， 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置 于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 （2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器） 先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用 蒙锡纸包裹送至干烤3次。 （3） 金属制品：（镊子等） 先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水） 3， 试剂配制和准备： （1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加 1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水 的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至 高压。 （2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC 水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 （4） 氯仿：放入棕色瓶 （5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃ 二，抽提时注意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接 触可疑污染物。
4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓ 转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时 ↓ 4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500rmp，5分钟 ↓ 弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，<10分钟助溶） ↓ 立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录 4 逆转录（RT） 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1.5ml、100ul （4）水浴箱 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置 于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备： （1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加 1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC 水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送
（5）琼脂糖 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头等） 送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。 （2）电泳板及电泳槽： 用自来水冲洗干净备用 3, 试剂配制和准备： (1) 电泳缓冲液（TAE）： 先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水 中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需 4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。 再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml 冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保 存。 （2）琼脂糖溶液（1.0％）： 50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮 至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混 匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左 右后进行电泳。 （3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）： 在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器 或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。 （4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer 二，电泳鉴定时注意事项： 佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新 的，不要超过两周。 五，电泳步骤 1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸 后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。 9， 用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电 泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。 10， 加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE 混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul 样品DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 11， 接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。 12， 入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂 三，PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 四，PCR步骤 1， 准备100ul EP管 2， 依次在管中加入：（50ul反应体系） ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？ 25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3， 稍离心 4， 100℃沸水浴1分钟 5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作） 6， 再加入50ul液体石蜡封闭 7， 10000rmp离心1分钟 8， PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec 进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。 9，10000rmp离心5min 10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。 6 电泳鉴定 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）吸头：20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个