纤维素酶固体发酵工艺的改良研究

纤维素酶固体发酵工艺的改良研究（生命科学学院，生物技术专业黄泽锦）（学号：2000302063）摘要：纤维素酶的固体发酵对发酵培养基的要求是很严格的，如培养基灭菌，无菌操作的等等，都是限制纤维素酶应用于生产的一个重要原因。

本实验通过一种对细菌抑制效果强，但对霉菌抑制能力一般的抑制剂对发酵过程进行控制，运用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）来测定羧甲基纤维素酶活（CMCase）及滤纸糖酶活（FPA,FPase）。

探讨是否能够实现在培养基未灭菌或者在有菌操作下实现纤维素酶的固体发酵，简化实验对培养基和操作过程的操作要求，进而为纤维素酶的工业化生产提供一定实验依据。

关键词：纤维素酶，抑菌剂，CMCase，Fpase，酶活力教师点评：本论文应用了自制的抑菌剂于纤维系酶的固体发酶工艺中，有一定抑制细菌的能力，但又不影响霉菌的产纤维素酶的活性，为简化固体发酵工艺探索了一条新的途径，有一定的实用参考价值。

（点评教师：余少文，副教授）一．前言纤维素占全球植物总干重的30%—50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]，但是，纤维素分子是由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，每个大分子中含的葡萄糖残基数一般为8000--12000个。

天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30%—80%之间。

在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。

纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。

据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55x109t，其中有89%尚未被利用或未被合理利用（如直接焚烧）目前全世界被开发利用的农林纤维副产物不足2%，我国约有50%以上的农林废弃物在田间地头被白白烧掉。

全世界每年因农林废弃物焚烧不仅造成直接的经济损失达数十亿元，而且由于焚烧而产生的滚滚浓烟及排放的大量有害气体严重影响了公路、航空的安全，污染了环境，对气候、生态等也造成了严重的影响。

而同时在另一方面，世界上还有十多亿人口由于粮食不足而遭受饥饿、营养不良。

灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁；随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题；由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略已在世界各国逐步展开。

植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。

经过多年的实验研究，虽然取得不上成果，但是实验的成本却总是居高不下，使得实验成果不能很好的应用到生产中，本实验通过研究抑菌剂对霉菌的影响，实现的对实验要求的降低。

本测试方法对纤维素工业应用中，对控制生产过程、产品质量及降低成本具有一定的实际指导意义。

1.1. 纤维素酶的概述1.1.1 纤维素酶的组分：一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同而能相互协同催化水解纤维素的三类酶组成，即(1)内切葡萄糖苷酶(endo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．4，简称EG、Cx)。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β—1，4—糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。

(2)外切葡萄糖苷酶(exo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．91，C1)，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)。

这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β—1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。

(3) β—葡萄糖苷酶(β—glucosidase，EC3．2．1．21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

1.1.2 纤维素酶的性质：纤维素酶是将纤维素水解成葡萄糖的一组霉的总称，它不是单种酶，主要有3个组分组成：1，内切葡聚糖酶，即Cx酶；2，纤维二糖水解酶，即C1酶；3，β－葡萄糖苷酶。

在适当的条件下，它们协同作用，将天然纤维素水解成葡萄糖。

一般纤维素霉的分子量在45000－75000之间，最适作用温度在50度左右，最适ph4－5之间，由不同的产生菌种所产的纤维素酶在分子量、含糖量、等电点、最适ph、最适温度等方面又有所不同，有的甚至相差较大，而且纤维素酶的各组分大多数是糖蛋白，含糖的比例很不同，糖和蛋白之间的结合方式也不同，有的是通过共价键连接，有的则是可解离的复合物。

纤维素的来源非常广泛，昆虫，软体动物，原生动物，细菌，放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。

目前研究较多的是霉菌，其中酶活较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里氏木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较好的纤维素霉产生菌。

细菌中酶活力较强菌种有纤维粘菌属，生孢纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线菌，玫瑰色放线菌，纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。

天然纤维素的结构即纤维素酶的作用方式：纤维素从组成上来说和淀粉一样，都是由葡萄糖组成，但它是由β－D-1,4-葡萄糖苷键组成的多糖，所以在性质上与淀粉有显著的区别。

天然纤维素以直链式结构存在，链与链之间有一定的晶状结构；许多纤维素分子以定形或无定形方式组合成微原纤维，许多微原纤维集束成微纤维，微纤维穿插于填充性物质――半纤维素和木质素之中。

纤维素分子是分子很大的多糖，分子量可达数十万甚至百万，不能为微生物细胞直接利用。

纤维素酶的作用方式：首先由内切葡聚糖酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多末端供外切型酶作用，纤维二糖水解酶从非还原性末端依次分解，产生纤维二糖，然后，部分降解的纤维素进一步由内切葡聚酶和纤维二糖水解酶协同作用，分解成纤维二糖，三糖等低聚糖，最后由β－葡萄糖苷酶作用分解成葡萄糖。

1.1.3 纤维素酶的测定方法：纤维素酶是一种复合酶，由内切葡聚糖酶(EG或Cx)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶（CBH， EC或C1）和纤维二糖酶(CB，β—葡萄糖苷酶)的协同作用下才能水解成葡萄糖。

其中各种酶的活性测定方法，目前尚无国家标准。

依照酶反应动力学的原则，酶活力的测定是在底物过量存在的条件下，测定酶促反应的初速度，用以表征酶活力1.1.3.A.测定原酶液中单一纤维素酶组分活力的方法简介1.1.3.A1.葡聚糖纤维二糖水解酶（CBH）活力测定：Desphander等以合成的P—nitrophonyl—β—D-cellobiose(PNPC)为底物用于检测CBH活力，由于β—葡萄苷酶可水解对硝基苯酚环上键合的纤维二糖，需同时加人β—葡萄苷酶抑制剂。

刘洁等提出一种简易测定CBH的方法．它是基于CBH,EG和CB三类组分在棉纤维上吸附和脱吸附能力不同而设计的，日本还采用微晶纤维素(Avicel)为底物水解得还原糖量计算酶活力，称Avicelase或指CBH活力。

但EG组分对Avicel水解程度高，对原配液而言，它反映的是CB，EG和CBH的协同作用结果，对单一组分来说，它是某些EG组分活力。

1.1.3.A2.内切葡聚糖酶（EG）活力的测定以还原糖的生成量来表示EG组分活力可以用磷酸膨胀纤维素、羧甲基纤维素或烃乙基纤维素等无定形纤维素为底物，以还原糖生成量表征EG酶活力。

特别是羧甲基纤维素价廉易得，且应用广，俗称CMCase或Cx酶活力。

粘度法测EG酶活力利用测定高分子溶液粘度从而导出其聚和度和分子量的方法来表征EG活力，它可测得初速度，因而确切反映EG活力，灵敏度较高。

1.1.3.A3.纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶，CB）活力测定从纤维素酶解机制上考虑，以纤维二糖为底物酶解后测葡萄糖生成量表征酶活力，由于纤维二糖和葡萄糖都具有还原性，通常定糖方法无法区分，常用人工合成的糖昔化合物，如对硝基酚—β—葡萄糖苷(PNPG)、水杨素等作底物测定产生的对硝基酚或葡萄糖。

由于各种β—葡萄糖苷酶组份对糖基和糖苷配基专一性的要求有差别，因此得到的结果通称为β—葡萄糖苷酶活，与纤维二糖酶活有所不同。

1.1.3.B.测定纤维素酶液中的糖化或降解活力方法简介滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法得到广泛应用，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活(FPA)。

目前酶活力的测定方法大致有粘度法、浊度法、滤纸崩溃法和3，5－二硝基水杨酸（DNS）比色法。

前两种方法较为复杂而且精密度较差（偏差为10％左右）。

本实验对Cx酶活性的DNS比色测定法和滤纸酶活的DNS比色测定法进行了研究。

其原理均系利用纤维素酶催化水解纤维素，从而产生纤维多糖，二糖及葡萄糖等还原性糖，与显色剂发应以分光光度计比色，求出还原糖的浓度，间接求出酶的活力。

作为底物的滤纸其结构较为松散，可及区较多，非还原性末端也较多，容易同时被内切酶和外切酶降解，再由β－葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖，用比色法定量测定还原糖的生成量，可反映纤维素酶的总酶活力，由于外切酶对纤维素链专一性高，而内切酶专一性较低，在降解羧甲基纤维素（CMC）时，主要是反映内切酶的活力。

1.1.4 纤维素酶的应用：纤维素酶在植物纤维再生利用方面起着重要作用。

1.2 里氏木酶：里氏木酶是真菌的一种，属于半知菌类、丝孢纲、木酶属。

木酶的菌落生长迅速，棉状或致密丛束状。

菌丝透明，有隔，分枝茂密。

木酶广布于自然界。

在腐烂的木材，种子，植物残体，有机肥料，土壤和空气都能分离到。

木酶的利用范围很广泛，某些种和菌株含有强的纤维素酶。

一般情况下，在木酶生长的第二天起，由于受到诱导物的作用，就会有纤维素酶的出现，而到了第三天，纤维素酶的量就会开始增加、囤积、到了第五、六天，纤维素酶就会出现最大值。

之后，随之菌种的死亡，纤维素酶的量也会随之减少。

固体发酵：1.3固体发酵流程：菌种平板――摇瓶――种曲――固体发酵固体发酵条件环境更接近于自然状态下的木酶生长习性，使其产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素。

1.4 酶活：在规定条件下，0.5g固体酶曲1min内由底物产生底葡萄糖微克数。

二．实验材料与方法1．主要仪器与试剂1．1 主要仪器HZS-H水浴振荡器，HZQ-C空气浴振荡器，HZQ-F160全温振荡培养箱，SW-CF-IF洁净工作台，TGL-16G高速台式冷冻离心机，PB203-N电子天平，752N型紫外可见分光光度计，电炉。

1．2 主要试剂1． DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸试剂）将7.5g的3，5-二硝基水杨酸和14.0g的氢氧化钠充分溶解于1000ml水中，加入216酒石酸钾钠，5.6ml（或5g）预先在50°C水浴中熔化的苯酚，以及6.0g偏重亚硫酸钠，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置3~5d后使用。