Acr-Bis(40%：2%)
SDS-PAGE原理
丙烯Байду номын сангаас胺
(acrylamide)
丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯 酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品 在高温（ 120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺。 研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙 烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。 丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收 最快。进入人体内的丙烯酰胺约90％被代谢，仅少量以原形经尿液排出。 丙烯酰胺进入体内后，会在体内与DNA上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致 遗传物质损伤和基因突变。 对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明， 丙烯酰胺具有神经毒性作用，但目前还没有充足的证据表明通过食物摄入 丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显关系。
过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统 ：在Acr 和Bis的溶液中放入这个
催化系统后，过硫酸铵[（NH4）2S2O8]产生出游离氧原子使单体成为具有 游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方
根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH 8.8条件下7
％的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕；在 pH 4.3时聚合很慢，要90分钟 才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升 高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近0℃的地方，就能延缓聚合。一 般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为 了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气， 然后再混合。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
SDS聚丙浠酰胺凝胶电泳原理
采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋
ABO血型基因型检测实验步骤
ABO血型基因型检测实验【实验材料】pBR322/Msp I Marker；ABO基因复合PCR扩增产物。
【实验准备】1. 器材：电泳仪、垂直板电泳槽系统、脱色摇床、涡旋混合仪等；2. 试剂：生工PCR试剂盒、引物由生工合成、NEB内切酶AluI和KpnI-HF、DNA加样缓冲液(6×)、10×TBE电泳缓冲液(贮存液)、40%丙烯酰胺预混液(Acr-Bis 液，19∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、10%(M/V)过硫酸铵(APS)、GeneGreen核酸染料等；2.1 染色液：用0.1g AgNO3定溶于100mL超纯水中，现配现用；2.2 显色液：1.2g NaOH，400μL 37%甲醛溶液定容于100mL预冷的超纯水中，现配现用；2.3 固定液：10%冰乙酸，10mL冰乙酸定容于100mL超纯水中。
【实验步骤】一、ABO血型基因多重PCR扩增技术多重PCR反应混合体系配制(表1、表2)：在冰上放置0.2mL PCR管，根据总体积(50μL)加入无菌ddH2O，将PCR试剂解冻后置于冰上操作，可按体积由大到小顺序依次加入相关成分，配制反应混合体系；表1 多重PCR引物引物序列碱基数浓度预计产物1：5'-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3' 20bp 5μM200bp (A和B等位基因)2：5'-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3' 20bp 5μM199bp (O等位基因)3：5'-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3' 21bp 5μM159bp (A、B和O等位基因) 4：5'-CACCGACCCCCCGAAGAA-3' 18bp 5μM表2 多重PCR混合体系(50μL)组别DNA模板10×buffer MgCl2dNTPs 引物1 引物2 引物3引物4Taq酶ddH2O 实验组5μL5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL26.7μL 对照组—5μL3μL4μL2μL2μL1μL1μL0.3μL31.7μL 终浓度20~500ng 1× 1.5mM 0.2mM 0.2μM0.2μM0.1μM0.1μM 1.5U —将配制好的混合液轻轻混匀并轻微离心，在PCR扩增仪上按下表编入程序(表3)：表3 PCR程序设定参数预变性变性退火延伸延伸保存温度95℃95℃60℃72℃72℃4℃时间2min 30s 30s 30s 3min 备用循环数 1 30 1 ∞编完反应程序后，置PCR管于PCR扩增仪反应孔中，开动机器。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量
(4)聚丙烯胺凝胶的生成：
四、实验步骤：
1、贮液的配制：
2、凝胶的制备： 2.1 胶板的制备： 2.2 分离胶的制备： 2.3 浓缩胶的制备：
3、蛋白样品的制备：
4、装槽、点样： 5、电泳： 6、剥胶、染色、脱色：
2.1 胶板的制备：
3、植物组织蛋白质提取：
称取大豆叶片1g放在研钵中用液氮研磨，加
第二、不连续系统中的三种物理效应：
①电荷效应：
②分子筛效应: ③浓缩效应:
三、实验材料、仪器和试剂：
1、实验材料：黄瓜叶片(芽黄叶和正常叶)
2、仪器、器皿：
(1)垂直板电泳装置
（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (2)稳流稳压电泳仪； （4）电子天平； （6）瓷盘、微量进样器； （3）高速冷冻离心机； （5）电冰箱；
②光聚合：
催化剂是核黄素（VB2 ），在痕量氧存在下，核黄素光
解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发 生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制 备大孔径的浓缩胶。
5)聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：
① 聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长 链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；
⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）
SDS-PAGE原理(中)
电荷效应：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动 电荷效应：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子， 速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。 速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一 的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种 的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同， 蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。 电泳中， 蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。但在 SDS-PAGE电泳中， 电泳中 由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使 由于 这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物， 这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物 蛋白质分子带负电荷， 蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差 别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的 从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外， 蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为 结合后都解离成亚单位， 破坏了蛋白质氢键、 蛋白质和 结合后都解离成亚单位 这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、 破坏了蛋白质氢键 疏水键等非共价键。与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液 疏水键等非共价键。 结合的蛋白质的构型也发生变化， 结合的蛋白质的构型也发生变化 蛋白质复合物都具有相似的形状， 中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得 蛋白质复合物都具有相似的形状 使得SDS-PAGE电泳的泳动 电泳的泳动 率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合 率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种 蛋白质复合 物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。 物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。
碱性蛋白质活性电泳胶配置
碱性蛋白质活性胶的配置Shmily2012逍遥居士各种蛋白质分子由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，因而有各自的等电点。
凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，如组蛋白、精蛋白等。
反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性，人体体液中许多蛋白质的等电点在pH5.0左右，所以在体液中以负离子形式存在。
从某种意义上来讲，碱性蛋白质也就是其等电点大于7.0，在碱性范围内。
所以，碱性蛋白质活性胶电泳，我们应该用酸性缓冲液的活性胶，因为在酸性缓冲液下，碱性蛋白质带正电荷，从电泳槽的阳极向阴极移动。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
碱性蛋白质活性胶即酸性缓冲液的活性胶---低pH的缓冲液系统。
配方如下：β-Ala NH2CH2CH2COOH=89.09甲基绿Methyl Green分子式：C27H35Cl4N3Zn分子量：608.78酸性非变性电泳工作液配制：40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）4×分离胶Buf(pH4.3,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH,以HAc调pH至4.3，Milli-Q 定容至100ml。
4×堆积胶Buf(pH6.8,0.24M KOH-HAc)：1.346g KOH,以HAc调pH至6.8，Milli-Q 定容至100ml。
5×电泳Buf（pH4.4,β-Ala-H Ac）：35.64gβ-Ala，以HAc调pH至4.4，dH2O定容至1L。
即0.4M的丙氨酸缓冲液，1×buffer的为0.08M。
2×甲基绿上样Buffer：1ml1×（pH4.4,β-Ala-HAc）电泳缓冲液，3ml甘油，1ml0.4g/L 甲基绿，5ml dH2O；-20℃贮存。
western-blot步骤
western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。
1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。
2、4℃，1000rpm,5min。
弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。
3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。
（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。
若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。
2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。
稀释液与样品的溶解液相同。
3、待测蛋白做相应的稀释。
（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。
5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。
五种电泳技术的比较
五种电泳技术的比较SDSPAGE名词解释：相对迁移率（Rf）问答题:1.简述SDS-PAGE的基本原理。
2.影响SDS电泳的关键因素有哪些？AGE名词解释1.迁移率2.电渗3.电泳问答题1.影响电泳迁移率的因素有哪些？2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。
CAME1.CAME的基本原理是什么？2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？PAGE名词解释1.凝胶总浓度2.交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。
2.试比较CAME与PAGE操作的区别。
3.简述不连续PAGE的原理。
1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel ElectrophoresisGel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。
特点（characteristic）：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。
2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。
3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。
4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。
（一）优点（advantage)1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。
2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。
4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。
5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。
6.有热可逆性。
（二）缺点(disadvantage)1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。
4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。
应用1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标影响迁移的因素the size of the moleculeconformation of the moleculethe agarose concentration of a gelVoltage百分浓度和分辨率限制Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白原理：血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。
根据电泳图谱判断胶体分子量的大小
根据电泳图谱判断胶体分子量的大小直接用环状的质粒跑电泳是很难判断其分子量的。
一般来说要先找到上面的一个相应的酶切位点（这个酶在这个质粒上只有一个识别域）.把质粒完全切开后再跑琼脂糖凝胶电泳,配合适当的marker就可以比较准确的判断质粒的分子量.常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。
为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。
快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。
低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。
这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。
当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。
夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。
浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。
凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面.一、基本原理免疫电泳法是将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双向免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉底弧。
将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。
二、类型一）流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIEP）即双扩+电泳技术，用途：同双扩，优点：快、敏感性高，缺点：分辨力低二）火箭免疫电泳（roket immunoelectrophoresis，RIE）即：单扩+电泳用途：定量抗原优点：快缺点：影响因素多，不常用三）免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）即：电泳后进行双相琼脂扩散实验用途：定性实验，主要用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定。
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北京雷根生物技术有限公司
Acr-Bis(40%：2%)
简介：
丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液又称Acr-Bis ，最常用的是30%Acr-Bis(29:1)即为含30% Acrylamide-Bisacrylamide 的水溶液，其中Acrylamide 和Bisacrylamide 的比例为29:1，丙烯酰胺的总比例为30%。
Leagene Acr-Bis(40%:2%)中Acrylamide 和Bisacrylamide 的比例为, 丙烯酰胺总量为，常用于配制丙烯酰胺凝胶(PAGE 胶)，如SDS-PAGE 胶等，可以用于蛋白或核酸的分离。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、因具体实验而异，可以参考SDS-PAGE 凝胶配制的说明。
注意事项：
1、 Acr-Bis(40%:2%)对人体有一定神经毒性，请注意适当防护。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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编号 名称 PE0130 Storage Acr-Bis(40%：2%) 500ml 4℃ 避光 使用说明书
1份 编号 名称 DH0006 苏木素伊红(HE)染色液 NR0001
DEPC 处理水(0.1%) PE0025
SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(5×) PE0080
Tris-HCl 缓冲液(1mol/L,pH6.8) PT0001
BCA 蛋白定量试剂盒 PT0013
考马斯亮蓝快速染色液 TC0699 植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)。