血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
ALT活性测定
血清中丙酮酸2,4-二硝基苯腙
505nm处有强吸光度
临床意义：
ALT在肝、肾、心和骨骼肌中含量丰富，其中ALT在肝细胞中的 浓度比血清高7 000倍，且主要位于肝细胞的可溶性部分。当肝 脏受损、肝细胞膜通透性增加时ALT或AST释放入血可导致血清 中该酶活性增加，因此，ALT常用于肝脏疾病的诊断。主要应用 于以下几种肝脏疾病的检测： 急性病毒性肝炎； 慢性活动性肝炎、脂肪肝、恢复期的急性病毒性肝炎患者； 肝硬化、肝癌；
实验八、血清丙氨酸氨基转移酶 （ALT）活性测定 ——赖氏法（比 色法）
目前测定ALT的方法主要有两大类：
分光光度法（速率法）
比色法（赖氏法）
实验目的
实验原理
实验步骤
结果分析
实验报告
实验目的：
熟悉ALT活性测定的方法
掌握ALT活性测定的临床意义
实验原理：
红棕色
丙酮酸2,4-二硝基苯腙的颜色深浅与丙酮酸的生成量成正比； 反应体系中丙酮酸的量与血清中ALT的活性成正比。
0.1
0.5
2,4-二硝基苯肼溶液 ALT 底物缓冲液
0.5 0.5
0.5 —
混匀，置37℃保温20min 0.4mol/LNaOH溶液 5.0 5.0
混匀，室温放置10min,于30min内比色(505nm)
结果分析：
1.以吸光度值为纵坐标，对应的ALT活性单位为横坐标，
作图，绘制标准曲线；
2.根据测得标本的吸光度值，从已经绘制好的标准曲 线中查得标本中ALT的卡门单位。
由其它原因引起的肝脏损害等。
实验步骤：
1.ALT标准曲线绘制
试剂(ml)/管号 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液 ALT底物缓冲液 2,4-二硝基苯肼溶液 0 0.10 0.00 0.50 0.50 1 0.10 0.05 0.45 0.50 2 0.10 0.10 0.40 0.50 3 0.10 0.15 0.35 0.50 4 0.10 0.20 0.30 0.50
实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定
（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号 血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值， 对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。 故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死； 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞； 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作； 熟悉ALT标准曲线的绘制； 熟悉酶活力概念； 了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性 的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定-精品文档
【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） 分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如 下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。，要求各S管和U管进行双管平行操
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶推选资料
注意事项
➢ 黄疸、高脂血症、溶血应做血清对照。 ➢ 测定值超过200单位时，应将标准稀释后再进行测定。 ➢ 控制好测定时的温度和保温时间。 ➢ 丙酮酸钠的纯度，对曲线也有影响。纯度低，曲线
斜率就低，所查得的酶活力单位可显著增加。所以 如果丙酮酸钠变黄应不用。 ➢ 0.4MnaOH和2.4-二硝基苯肼的配制要准确。
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
[实验器材]
✓ 恒温水浴箱 ✓ 分光光度计
[实验试剂]
✓磷酸盐缓冲液 ✓基质缓冲液 ✓2.4-二硝基苯肼溶液 ✓0.4mol/l NaOH溶液 ✓丙酮酸标准液
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
1. 绘制标准曲线
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
2. 将基质缓冲液和血清在37摄氏度水浴预温5分钟
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
生物化学检验教研室
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验目的
掌握： 赖式法测定血清丙氨酸氨基转 性肝炎、胆管及胆囊炎
4-二硝基苯腙✓在碱性条件下显红棕色。
移酶的原理。 赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶 混匀37摄氏度水浴准确保温30分钟
临床意义
ALT增高
✓传染性肝炎及其他肝胆疾病:如肝癌、中毒 性肝炎、胆管及胆囊炎
✓心血管疾病:心肌梗塞、心肌炎、脑出血 ✓骨骼疾病:多发性肌炎、肌营养不良等
课后思考
血清ALT测定的实验原理是什么？ 血清ALT测定的临床意义是什么？
赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶
纯度低，曲硝线基斜率苯就低肼，，所查作得的用酶生活力成单位丙可酮显著酸增加。
移酶标准曲线的绘制。
赖式法测定2.血4清-丙二氨酸硝氨基基转苯移酶腙。2.4-二硝
赖氏法实验报告
1. 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的原理和方法。
2. 学会操作赖氏法测定ALT活性的实验步骤。
3. 熟悉ALT测定的临床应用及注意事项。
二、实验原理赖氏法是一种常用的酶偶联速率法，用于测定血清中ALT活性。
该方法利用ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸在磷酸盐缓冲液中进行反应，生成L-丙酮酸和α-酮戊二酸，同时NADH被氧化为NAD+。
在特定波长下，NADH的吸光度与ALT活性呈线性关系，通过测定吸光度变化，计算出ALT活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本（2）赖氏法ALT测定试剂盒（3）磷酸盐缓冲液（4）L-丙氨酸（5）α-酮戊二酸（6）NADH（7）NAD+（8）分光光度计2. 实验仪器：（1）恒温水浴箱（2）移液器（3）离心机（4）微量滴定板1. 样本处理：取血清样本，按照试剂盒说明书进行稀释。
2. 标准曲线制备：（1）取6个微量滴定板，分别加入不同浓度的标准ALT溶液。
（2）向每个板中加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀。
（3）加入一定量的L-丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。
（4）将滴定板放入恒温水浴箱中，设定反应时间。
（5）反应结束后，加入一定量的NADH和NAD+，混匀。
（6）在特定波长下测定吸光度，以ALT浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样本测定：（1）按照标准曲线制备的步骤，向微量滴定板中加入血清样本。
（2）按照标准曲线制备的步骤，进行反应和测定吸光度。
（3）根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性。
五、结果与分析1. 标准曲线制备：根据标准曲线，得出线性方程为y=0.0068x+0.0015，其中y为吸光度，x为ALT浓度。
2. 样本测定：根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性为40 U/L。
六、讨论1. 赖氏法测定ALT活性的原理和步骤简单，操作方便，准确度高。
2. 实验过程中，要注意反应时间的控制，以保证反应充分进行。
3. 标准曲线的制备是实验的关键环节，要确保标准曲线的线性关系良好。
血清丙氨酸氨基转移酶
医学ppt
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实验试剂：
（1）ALT底物液【2 mmol/Lα-酮戊二酸 , 20 mmol/L丙
氨酸】
（2）pH=7.4的PBS
（3）丙酮酸标准液[2 mmol/L] （4）2,4二硝基苯肼
溶液【1 mmol/L]
(5) 0.4 mmol/L NaOH
制（ 作）
活 力 的 测 定 标 准 曲 线 的
？
答：α-酮戊二酸因其量不多，加之对520nm的 吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强 ，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单 位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖 氏法一些固有弊端，α-酮戊二酸对于结果影响 不大，测定结果也比其他比色法（金氏法（King法
）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法））
体内，可引起高铁血红蛋白血症，出现
紫绀 遇明火极易燃烧爆炸。干燥时
经震动、撞击会引起爆炸。燃烧时放出
有毒的刺激性烟雾。与氧化剂混合能形
成爆炸性混合物。【有害燃烧产物】
医学一pp氧t 化碳、二氧化碳、氮氧化物
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α-酮戊二酸也能与 2,4二硝基苯肼结合成相应的 苯腙，在碱性条件下显色。对实验结果有何影响
卡氏测定ALT活力的原理
答：丙氨酸+ α-酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+
医学ppt
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小结：区别与联系
医学ppt
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实验原理：
医学ppt
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知识链接：
• 转氨基作用
是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨
基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨
实验十五血清ALT测定（赖氏法）
实验十五血清ALT测定（赖氏法）实验十五血清ALT 测定（赖氏法）【目的】1.了解血清ALT 活性测定的原理及测定方法。
2. 掌握血清ALT 活性测定的临床意义。
【原理】丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶（ALT ）的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。
在反应到达规定时间时，加入2，4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
后者在碱性条件下显棕红色。
根据颜色的深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。
反应式如下：C H CH 3NH 2COOHCO CH 2CH 2＋ALTCH 3CCOOHO COOHCHNH 2CH 2CH 2＋丙酮酸α-酮戊二酸丙氨酸谷氨酸C CH 3O ＋CH 3CN NO 2NO 2NH 丙酮酸NO 2NO 2NHN H 22，4-二硝基苯肼丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（红棕色）NaOH-H 2O【器材】试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。
耗材：血清，座标纸等。
【试剂】1. 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4）称取磷酸氢二钠(Na 2HPO 4，AR)11.928g ，磷酸二氢钾(KH 2PO 4，AR)2.176g ，加少量蒸馏水溶解并稀释至1 000ml 。
2. ALT 底物液称取α-酮戊二酸29.2mg ，DL 丙氨酸1.79g 于烧瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后冷却，用1mol/L NaOH调节pH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml，混匀，加氯仿数滴，置冰箱可保存数周。
3. 丙酮酸标准液（2μmol/ml）精确称取丙酮酸钠(AR)22.0mg于100ml容量瓶中，加0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
4. 2，4-二硝基苯肼溶液称取2，4-二硝基苯肼19.8mg，用10mol/L盐酸10 ml溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
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授课对象：06级检验1-5班
课时：2学时
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）
目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项
2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线
3.规范地进行ALT测定
4.了解血清ALT测定的临床意义
实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等
原理：
丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：
1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）
2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于
100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：
血清ALT测定步骤（赖氏法）
加入物（mL）R B
血清0.1 0.1
ALP基质液0.5 —
混匀，置37o C水浴30min
2.4-二硝基苯肼0.5 0.5
ALP基质液—0.5
混匀，置37o C水浴20min
0.4mol/L NaOH 5.0 5.0
将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
血清ALT测定步骤（赖氏法）标准曲线制作：
加入物（ml）0 1 2 3 4 5
2mmol/L丙酮酸标准液0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 ALP基质液0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.1mol pH7.4磷酸盐缓冲液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
混匀，置37o C水浴30min
2.4-二硝基苯肼溶液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，置37o C水浴20min
0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于ALT单位0 28 57 97 150 200 混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，将各管之系光度减去0号管吸光度值后，以吸光度为纵坐标，各管相应的ALT单位为横坐标，绘制标准曲线。
结果报告：
被检者———————
血清ALT——————U——[＜35U]
报告者————————————年————月————日
临床意义：
1．赖氏法的酶活力单位是用卡门法所测出的酶活力单位相当于用本法所生成的丙酮酸量的相关系数套用卡门单位而来，卡门单位的定义：在规定表件下（血清1ml，反应液总量3ml，在25o C下作用1min，用内径1cm 的比色杯），测定340nm波长处吸光度减少值（A），每减少0.001为一个酶活力单位。
2．血清对照管吸光度基本相同，因此同一批标本只做2～3个血清对照管求其平均即可。
亦可以空白管替代对照管。
但脂血、溶血和黄疸血清应单独做对照管。
3.测定结果超过200卡门单位时，应将血清稀释后在进行测定，结果乘以稀释倍数。
4. 酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温度（要求准确到37±0.5o C），并准确掌握保温时间。
5. 配制底物液时，如改用改L—型丙氨酸，则应按上法减半量用（因ALT只作用与L-型丙氨酸）。
6. 丙酮酸钠的纯度，对曲线有明显影响，纯度低曲线斜率就低，使查得的酶活力单位显著增高。
故应选择外观洁白、干燥的丙酮酸钠使用。
7. 丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换时重新制作标准曲线。
8．于α-酮戊二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用生成苯腙而显色，为了减少其对丙酮酸测定的干扰作用，底物中α-酮戊二酸的浓度很低，不能保证酶反应的充分进行；且2.4-二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲线不呈直线。
课后小结：。