TF-1细胞凋亡相关基因的研究
TFF1在肺癌中的表达及作用研究
TFF1在肺癌中的表达及作用研究刘开泰;陆妙珍;褚宇东【摘要】目的研究三叶因子1(TFF1)在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达、甲基化状态及其功能.方法选取98例非小细胞肺癌患者手术切除的肺癌组织,采用RT-PCR、MSP检测TFF1在肺癌组织中的表达与甲基化状态,分析其与患者临床特点的相关性,以及检测肺癌细胞株H23、H1299、L78、H446、H157及95D中TFF1的表达和甲基化状态以及5-aza-2'-deoxycy-tidine(DAC)处理后细胞株中TFF1表达的变化.TFF1转染H23细胞株,MTT法及克隆形成实验检测其增殖能力和克隆能力的变化,细胞凋亡实验及Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3表达水平.结果 TFF1在肺癌组织中的甲基化率为56.1％(55/98).TFF1甲基化与肺癌患者的TNM分期和淋巴结转移显著相关(P＜0.001).TFF1在H23和H157中无表达,在H1299、H446及95D中表达较低,在L78中表达较高.DAC处理后,细胞株TFF1表达的变化分别为表达恢复(H23、H157),表达增强(H1299,H446,95D)和无明显改变(L78).恢复表达TFF1后,H23细胞株的增殖及克隆形成能力明显减弱(P＜0.05),细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3活性片段的表达明显增加.结论 TFF1在肺癌组织中的甲基化状态与肺癌的TNM分期和转移密切相关.TFF1在肺癌细胞中的表达受DNA甲基化的调控.肺癌细胞株H23中恢复表达TFF1可以抑制其增殖和克隆能力,促进其凋亡.【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2015(037)004【总页数】5页(P283-286,294)【关键词】TFF1;肺癌;DNA甲基化;表观遗传学【作者】刘开泰;陆妙珍;褚宇东【作者单位】315040 宁波市医疗中心李惠利医院放疗科;315040 宁波市医疗中心李惠利医院放疗科;315040 宁波市医疗中心李惠利医院肾内科【正文语种】中文1.1 人组织标本及细胞系 98例肺癌及癌旁组织来自宁波李惠利医院胸外科手术切除的肺癌患者，其中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期60例。
北医免疫课程PDCD5-研究思路
12
Construction of pcDITFAR19
fi ori Bgl II
CMV Intro
Nhe I EcoRI
LacZ
pGEM-TTFAR19
EcoR I
TFAR19
pcDI-IL-6
Sal I
IL-6 cDNA
EcoRI
EcoR I
ori
NeoR
XhoI BGH poly A
EcoR I
MS2
PDCD5 ORF PCR Product (410bp)
Xho I
pMTY-4
EcoR I Thrombin Linker Stu I
Xho I Pst I Klenow Xho I T4 Ligase pL Stu I Xho I
MS2
pMTY-TFAR19
EcoR I Thrombin Linker
TAA AAA AAT AAA CTT GTT ATG CAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 540
PDCD5编码蛋白结构比较简单,全长125个氨基酸，不含二硫键， pI 5.65 ; 无信号肽，无跨膜序列，与已知人类蛋白无同源性;S118可以被CK2磷酸化
8
PDCD5基因结构图
EcoRI
NeoR
NeoR 13
PDCD5过表达促进 HeLa和 MGC-803 细胞撤除血清诱导的凋亡
14
PDCD5对各种细胞具有促凋亡效应,但单独不能诱导凋亡
细胞种类
TF-1 HL60，MGC-803，HEK293，HeLa Jurkat
诱导凋亡因素
GM-CSF withdrawal Serum withdrawal Serum withdrawal, VP16, FAS Ab
程序性细胞死亡分子5(PDCD5)研究进展
·综 述·程序性细胞死亡分子５（ＰＤＣＤ５）研究进展杨丰赫１ 叶菁菁２ 郑 铭１，△（１北京大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系，北京１００１９１；２北京大学人民医院中心实验室和临床分子生物学研究所，北京１０００４４）摘要 程序性细胞死亡分子５（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ５，ＰＤＣＤ５）在人体各种组织中广泛存在，可以通过多种凋亡通路促进细胞凋亡，其在大部分肿瘤中低表达，对肿瘤化疗具有增敏效应。
近年发现，除了在细胞凋亡过程中发挥作用外，ＰＤＣＤ５在多种疾病的病理进程中发挥重要作用，如：肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病、脑缺血再灌注损伤及动脉粥样硬化等。
ＰＤＣＤ５蛋白结构简单，无二硫键，其重组蛋白药物开发较便利，具较高的药物基因组学应用价值。
本文主要介绍近２０年来ＰＤＣＤ５的研究进展及其在肿瘤、免疫系统疾病、心血管系统疾病中可能的应用、存在的不足、以及在其他方面的应用前景。
关键词 ＰＤＣＤ５；凋亡；肿瘤；心血管系统疾病中图分类号 Ｒ３６３ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰＤＣＤ５ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＩｔｓＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｌｅｖａｎｃｅ ＹＡＮＧＦｅｎｇ Ｈｅ１，ＹＥＪｉｎｇＪｉｎｇ２，ＺＨＥＮＧＭｉｎｇ１，△（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１９１Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ＆ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４４Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＣｅｌｌＤｅａｔｈ５（ＰＤＣＤ５）ｉｓｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ，ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｍｕｌｔｉｐｌｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｐａｔｈｗａｙｓ；ＰＤＣＤ５ｈａｓｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｉｎｍｏｓｔｋｉｎｄｓｏｆｔｕｍｏｒｓ，ａｎｄｉｔｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｏｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇｉｎｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ＰＤＣＤ５ｐｌａｙｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎａｖａｒｉｅｔｙｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ，ｓｕｃｈａｓｃａｎｃｅｒｓ，ｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｉｅｓ，ａｎｄａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰＤＣＤ５ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｑｕｉｔｅｓｉｍｐｌｅｗｉｔｈｏｕｔｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｖｅｒｙｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｕｒｐｏｓｅｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｍａｉｎｌｙｆｏｃｕｓｅｓｏｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｏｆＰＤＣＤ５ｉｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｔｗｏｄｅｃａｄｅｓ，ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｆｅｃｔｓｏｆＰＤＣＤ５ａｓｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｓ，ｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｓｗｅｌｌａｓｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｏｆｔｈｅｖａｌｕｅｏｆＰＤＣＤ５ｉｎｏｔｈｅｒｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＰＤＣＤ５；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｔｕｍｏｒ；ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ １９９９年，北京大学人类疾病基因研究中心利用ｃＤＮＡ差示分析法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｎａｌｙ ｓｉｓ），从诱导凋亡的ＴＦ １细胞用中成功克隆了在凋亡时表达上调的人类新基因，命名为ＴＦＡＲ１９（ＴＦ １ｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１９）（Ｌｉｕ等．１９９９）。
足细胞凋亡与膜性肾病的研究进展
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２２４３
中存在足细胞凋亡，而导致足细胞凋亡 的主要原因则为糖尿病肾病氧化应激 的产物ＲＯＳ。目前认为ＲＯＳ的来源主 要有两条途径．一为ＮＡＤＰＨ氧化酶途 径，二为线粒体途径。Ｓｕｓｚｔａｋ等［１０］研究 表明．在体外培养的条件性永生足细胞 中加入高糖（３０ ｍｍｏｌ／Ｌ）可刺激细胞膜 ＮＡＤＰＨ氧化酶和线粒体两条途径产生 大量ＲＯＳ．ＲＯＳ又通过ｐ３８ＭＡＰＫ信号
２．Ｉ．２
ＴＧＦ．Ｂ１介导的足细胞凋亡ＴＧＦ．
Ｂｌ（转化生长因子Ｂ１）是一种多功能的 细胞因子．在损伤的肾小球内。呈典型 上调。越来越多的研究表明ＴＧＦ．１３１介 导了肾小球足细胞的凋亡。在肾小球硬 化过程中发挥着重要作用。目前认为 ＴＧＦ．Ｂｌ主要通过以下两条信号转导通 路介导足细胞的凋亡。
２．１．１
ＴＧＦ．Ｂ１／ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路
ＴＧＦ．１３１除激活Ｓｍａｄ通路外．还激活丝 裂原活化的蛋白激酶（ＭＡＰＫＳ），如 ｐ３８ＭＡＰＫ通路。ｐ３８ＭＡＰＫ为ＴＧＦ．１３ ｌ 系统下游的一个通路。ＴＧＦ．１３１通过与 其Ｉ型和Ⅱ型丝／苏氨酸激酶受体的不 同成分相互作用，将信号转入细胞内， 刺激激活ＭＫＫＫ（ＭＡＰＫ激酶激酶），转 而激活ＭＫＫ（ＭＡＰＫ激酶）主要为 ＭＫＫ３和ＭＫＫ６．然后通过双位点磷酸 化激活ｐ３８ＭＡＰＫ．活化的ｐ３８ＭＡＰＫ信 号诱导促凋亡因子Ｂａｘ（Ｂｃｌ．２家族成 员）蛋白合成，Ｂａｘ与含ＢＨ３结构域的 另外的Ｂｃｌ．２家族成员作用。导致前者 的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜 通透性的改变．跨膜电位丢失，释放细 胞色素Ｃ和其他蛋白［８］。释放的细胞色 素Ｃ与Ａｐａｆ－Ｉ（凋亡促进因子）结合引 起Ａｐａｆ－１寡聚。从而募集并激活 Ｃａｓｐａｓｅ．９．由Ｃａｓｐａｓｅ．９激活Ｃａｓｐａｓｅ－ ３，使细胞进入凋亡［引．此即凋亡的线粒 体通路。这一过程在Ｓｃｈｉｆｆｅｒ等㈧的研． 究中被证实：在足细胞内，ＴＧＦ一１３１刺激
细胞凋亡的检测(来自北京大学人类疾病基因研究中心
摘自北京大学人类疾病基因研究中心/news/apoptosis.htm细胞凋亡的检测北京大学人类疾病基因研究中心陈英玉细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DN A的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
atf2转录因子 -回复
atf2转录因子-回复转录因子（Transcription Factors，简称TFs）是一类能够调控基因转录的蛋白质分子，它们通过结合到基因的启动子区域上，与RNA聚合酶和其他转录激活或抑制因子相互作用，从而影响基因的表达。
在细胞发育和生理过程中，TFs起到了至关重要的作用，能够调控基因的启动和停止、确定基因表达的细胞、组织和器官特异性，以及参与激素信号传导等。
本篇文章将深入探讨ATF2转录因子及其在细胞信号转导中的功能。
ATF2 （Activating Transcription Factor 2）是一个重要的转录因子家族成员，其编码基因位于人类染色体2q32-q34区域。
ATF2是一个受丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路调节的双重转录因子，能够通过调控基因的转录起到生物学功能。
该转录因子由两个功能域组成：N末端的ATF 家族保守结构域（bZIP结构域）和C末端的加上杆。
ATF2参与了多种信号通路的调控，例如T细胞受体（TCR）信号通路、线粒体途径和糖代谢途径等。
在TCR活化过程中，ATF2被丝裂原活化激酶家族蛋白激活，进而促使其定位到TCR信号通路的启动子区域，通过结合到响应元件上，与其他转录因子相互作用，从而调控下游基因的转录。
这一过程在免疫细胞的激活和应激反应中起到了重要的作用。
此外，ATF2还与肿瘤的发生和发展密切相关。
研究发现，ATF2能够调控细胞周期和凋亡相关基因的表达，进而影响细胞的增殖和生存。
ATF2的过度表达可能导致细胞增殖水平的提高，从而推动癌症的发展。
另一方面，ATF2的功能丧失可能导致凋亡信号通路的紊乱，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。
因此，ATF2有望成为治疗癌症的重要靶点。
除了在细胞信号转导中的功能，ATF2还参与了细胞的应激反应。
在环境胁迫、氧化应激等情况下，ATF2能够被激活，进而调控一系列应激反应基因的转录。
这些基因的表达可以使细胞适应环境的变化，并促进细胞的存活。
TFF与消化系统肿瘤关系的研究进展
TFF与消化系统肿瘤关系的研究进展冯丽英;马丽;秦玉彩【摘要】Trefoil factor (TFF) peptides are a family of small molecular regulatory protein which is mainly expressed in gastrointestinal mucus membrane,including TFF1 (PS2), TFF2 (SP)and TFF3(ITF). Its main function is to keep the integrity of mucous membranes and promote the repair of epithelial damage. Recent studies have found that trefoil factor family has connection with the occurrence and development of digestive tumors. At the same time it has a certain impact on cell proliferation and apoptosis. Therefore further study on mechanism of trefoil factor family in gastrointestal tumor will provide new approaches for the diagnosis and treatment of gastrointestal cancer.%TFF是一族主要表达于胃肠道黏膜的小分子多肽,包括乳腺癌相关肽、解痉多肽和肠三叶因子,其主要功能是维持黏膜的完整性和促进损伤黏膜的修复.近年研究发现TFF与消化系统肿瘤的发生、发展有关,同时对细胞的增殖和凋亡有一定的影响,因此,进一步研究TFF在消化系肿瘤中的作用机制,将为消化系肿瘤的诊断与治疗开辟新的途径.【期刊名称】《临床误诊误治》【年(卷),期】2011(024)009【总页数】4页(P82-85)【关键词】三叶因子;肽类;消化系统肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡【作者】冯丽英;马丽;秦玉彩【作者单位】0000石家庄,河北医科大学第二医院消化科;0000石家庄,河北医科大学第二医院消化科;0000石家庄,河北医科大学第二医院消化科【正文语种】中文【中图分类】R735TFF(trefoil factor family，TFF)是新近发现的一类小分子多肽，又称三叶肽。
细胞凋亡及检测方法
细胞凋亡细胞凋亡是指由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常称为细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD)。
具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需的细胞或即将发生特化的细胞。
例如，蛙的个体发育过程中，四肢的形成过程中尾巴消失等现象，都涉及细胞的自动死亡。
在形态学上把细胞凋亡分为三个阶段：第一个阶段是凋亡的开始，此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等;第二阶段是形成凋亡小体，核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体；第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。
细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。
【细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。
细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。
人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)。
细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。
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生物化学与生物物理进展PROGRESS INBIOCHCMISTRYAND BIOPHYSICS1999年 第1期 No.11999TF-1细胞凋亡相关基因的研究刘红涛 王玉刚 张颖妹 宋泉声 敬保迁 袁 勇 马大龙摘要 利用近年来发展起来的代表差异分析（cDNA representational differences analysis, cDNA-RDA）技术研究了在人红白血病细胞株TF-1细胞撤除细胞因子后进入凋亡时诱导表达的基因.发现了6个新基因片段.其中有三个经与GenBank nr和dbEST查询均没有发现同源性，已经向GenBank进行登记，登记号分别为U83208，U83279，U83397.此外还发现一批已知基因的表达与凋亡相关，其中包括Hou和人硫氧还原蛋白等, 提示它们在凋亡中可能起作用.这项工作为进一步研究凋亡相关基因打下了良好基础.通过RDA的研究结果，有可能发现人白血病细胞凋亡的特异标记蛋白或发挥作用的重要蛋白，以期为白血病治疗提供理论基础.关键词 TF-1细胞株，代表差异分析，凋亡学科分类号 R392.1Studies on the Apoptosis-Related Genes of TF-1 Cell Line by cDNA-RDA Technique. LIU Hong-Tao, WANG Yu-Gang, ZHANG Ying-Mei, SONG Quan-Sheng, JING Bao-Qian, YUAN Yong, MA Da-Long (Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China).Abstract The genes effecting in the process of the apoptosis of TF-1 cell line when it is deprived of the cytokine in the culture medium were studied by RDA (representational difference analysis) method. The TF-1 cell depriving of cytokines for 8 hours was selected as the Tester and normal-cultured TF-1 cell as the Driver. Seven gene fragments were found uniquely expressed or highly expressed in the process of apoptosis of TF-1 cell line which include some known genes such as Hou and thioredoxin that formerly suggested to play a role in apoptosis.There are three fragments are complete novel after searching the nr and EST catalogues of GenBank and were banked into GenBank. The accession numbers for them are U83208, U83279, U83397 respectively. From the novel gene fragments, the complete cDNA sequence of them can be fished and the bioactivity and function of them in apoptosis of TF-1 cell and other hematological tumors can be further studied. On the other hand, the function of some known genes which were not suggested formerly in the course of apoptosis can be studied.Key words TF-1 cell line, representational difference analysis(RDA), apoptosis 细胞凋亡（apoptosis）是当前国际生物学研究的热点之一.目前已发现多种基因参与细胞凋亡，例如TNF/FAS家族，BCL2家族，ICE/CED-3家族，多种癌基因，抗癌基因，热休克蛋白等［1］.但由于细胞凋亡为多阶段，多系统，多基因参与的复杂过程，目前对其参与的全部基因尚远未了解清楚.通过进一步克隆化新的凋亡诱导基因，特别是具有启动作用的凋亡早期表达基因，将有助于阐明凋亡机理，为一些凋亡相关疾病特别是肿瘤的治疗提供新的思路. 细胞凋亡也是造血细胞自然死亡的一种主要形式，一些血液病问题也与细胞凋亡密切相关，特别在一些血液肿瘤的发生、发展中起重要作用.在CML、B-CLL、ALL、AML等肿瘤细胞中均有高水平BCL-2的表达，细胞凋亡过程的受阻是血液肿瘤形成的重要原因［2］.目前已证明抗肿瘤化疗药物，肿瘤细胞诱导分化剂（如维甲酸及其合成的衍生物HPR），某些激素（如糖皮质激素及PGE2等），某些细胞因子及某些化学药物（如砷类化合物（As2O3）［3］）也是通过诱导血液肿瘤的细胞凋亡，发挥治疗作用.因此深入研究血液肿瘤细胞凋亡的发生机制，及其基因调控并进行基因分离和克隆，可望人为地调控细胞凋亡，提高治疗效果，预防疾病发生. 本项研究以细胞因子依赖性的人红白血病细胞株TF-1细胞作为研究对象，通过撤除细胞因子诱导其凋亡，利用代表差异分析技术(cDNA-representational difference analysis,cDNA-RDA)［4］进行凋亡早期特异表达基因的克隆化，并进行功能研究.RDA 是1993年［5］发展起来的一种新方法，最初用于基因组表达差异的研究，因其简便有效性被大家推广用于cDNA的差异表达研究.1 材料和方法1.1 细胞系和细胞培养 TF-1细胞由中国药品生物制品检定所丁锡申教授惠赠，由本室长期传代培养.培养基中加入80～100 U/ml的人重组GM-CSF.细胞去细胞因子时用Hank "s液洗三遍后悬于不含GM-CSF的培养基中.1.2 DNA片段化分析 为了解TF-1细胞去细胞因子后凋亡情况，分别于去细胞因子后0、8、12、24、48、80 h收集2×106 TF-1细胞，提取片段化DNA［6］.1.3 细胞总RNA及mRNA的提取 细胞总RNA的提取利用GIBCO-BRL公司的TRI Z0L TM试剂.各取1×107去细胞因子8 h后的TF-1细胞及相同数目不去细胞因子的TF-1细胞，离心收集后，加入1 mlTRI ZOL TM试剂提取总RNA.以上两种细胞mRNA的提取使用Pharmacia公司的QuickPrep "Micro mRNA Purification kit.1.4 双链cDNA的合成 采用GIBCO-BRL的Superscript TM Choice System for cDNA Synthesis试剂盒，利用1.3所提的不去细胞因子和去细胞因子细胞mRNA为模板，进行单链及双链cDNA的合成.1.5 RDA寡核苷酸 以下是应用于RDA的寡核苷酸［4,5,7］.RBgl24, 5′-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3′，RBgl12, 5′-GATCTGCGGTGA-3′，JBgl24, 5′-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3′，JBgl12, 5′-GATCTGTTCATG-3′，NBgl24, 5′-AGGCAAC-TGTGCTATCCGAGGGAA-3′，NBgl12, 5′-GATCTTTCCCTCG-3′ 划线的地方是每对引物配对互补的区域，以上引物由上海生工生物工程有限公司合成.1.6 RDA差示杂交 操作参照文献［4,5,7］.去细胞因子和不去细胞因子组cDNA 2 μg用DpnⅡ切后连上RBgl12和RBgl24，然后以RBgl24为引物对两者进行PCR扩增，扩增产物用DpnⅡ切后，利用Glassmilk回收200～1 600 bp的片段，并定量取2 μg去细胞因子组的回收产物再连入JBgl12和JBgl24后,再取0.4 ng纯化的连接产物(被测组），与40 μg加因子的回收产物(本底组)（1∶100）进行长时间杂交，杂交后的产物以JBgl24为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后用绿豆核酸酶处理.终止反应后取20 μl处理后的产物为模板，以JBgl24为引物，进行18轮PCR反应.此次PCR产物纯化后用DpnⅡ切,酶切后片段为DP1（以上为第一轮杂交）.取2 μg酶切后的DP1再按以上操作连上新的Adaptor NBgl12和NBgl24（第一轮后）或JBgl12和JBgl24（第二轮后），重复RDA过程，连入新adaptor 的DNA为被测组,作PCR时分别以NBgl24或JBgl24为引物，杂交时本底组的量分别为0.1 ng(1∶400),0.01 ng(1∶4000)，分别得到DP2和DP3.取一定量的DP3与经BamHⅠ酶切并用CIP处理的载体pGEM3zf进行连接并筛选阳性克隆.1.7 测序反应 测序使用Pharmacia Biotech公司的ALF TM DNA Sequencer，测序反应按Standard Annealing of Primer to Double-Stranded Template, 以荧光标记的反向引物为测序引物，使用的酶为T7 DNA聚合酶.1.8 与GenBank已有序列的比较及新序列的登记注册 将测序所得到的序列以E-mail的形式或通过进行序列比较，并通过所提供的BankIt功能将在nr和dbEST中完全没有同源性的序列到GenBank进行登记［8～10］.1.9 mRNA斑点杂交和RNA印迹 基本操作按文献［11］，去细胞因子和未去细胞因子组总RNA用分光光度计Beckman 640定量后，对应狭线孔中各加入20 μg总RNA，利用GIBCO-BRL公司抽滤点膜装置HXBRI-SLOT TM MANIFLD将总RNA点于DUPONT公司的Gene Screen Plus " Hybridization Transfer Membrane上.RNA印迹时［12］，总RNA经在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳后，通过毛吸法转到尼龙膜上.探针的标记和杂交操作参照DUPONT公司Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluorescein-HRP(DuPont NEN "NEL803)试剂盒说明书，一般X片压膜过夜后显影，定影.2 结 果2.1 TF-1细胞去细胞因子后进入凋亡 分别于去细胞因子0、8、12、24、48、80 h时提取TF-1细胞的DNA，并进行电泳.电泳显示（图1）去细胞因子12 h时DNA的片段化就已经非常明显，说明TF-1细胞去细胞因子后进入凋亡.一般来说，基因水平的改变TF-1细胞应该早于形态学上的改变.为此我们选取去细胞因子8 h后TF-1细胞进行RDA.图1 TF-1细胞去细胞因子后DNA片段化电泳结果1:λDNA/HindⅢ标准; 2～7: TF-1细胞去因子0、8、12、24、48、80 h.2.2 RDA 进行RDA操作时，以未去细胞因子的TF-1细胞为本底组，而以去细胞因子8 h后的TF-1细胞为被测组.进行三轮RDA，每轮中本底组:被测组分别为100∶1，400∶1，4000∶1.图2显示了杂交前不去及去细胞因子TF-1细胞cDNA，以及三轮RDA每一轮的产物，从电泳上可以看出，随着RDA进行，带型发生了改变，大部分消失而局部增强.第三轮后，可以看到明显的不同条带，此类差异带可能代表差异表达的基因.图2 利用RDA筛选在TF-1细胞去细胞因子8 h后特异表达片段的电泳结果1:λDNA/HindⅢ标准; 2: 正常培养（不去细胞因子）的TF-1细胞cDNA经DpnⅡ酶切后，PCR扩增; 3: 去细胞因子8 h时TF-1细胞cDNA经DpnⅡ酶切后，PCR扩增; 4:第一轮RDA后即DP1; 5: 第二轮RDA后即DP2; 6:第三轮RDA后即DP3.2.3 测序，检索和杂交结果 三轮RDA后的产物与pGEM3zf相连后，电泳分析选择大于pGEM3zf载体的克隆进行保存并选择20个克隆用LiCl和PEG8000的方法提取质粒［12］后进行测序.测定的序列以E-mail或WWW的方式到GenBank进行检索.检索结果(表1)表明其中有7个克隆只有部分序列有同源性，可能为新的未知基因.其余13个为已知基因，将以上7个未知序列再到dbest数据库进行检索，发现其中4个有相同序列，3个没有同源序列，将这3个基因片段以EST的形式向GenBank进行登记，并获得承认.GenBank的登记号码分别是U83208，U83279，U83397.对以上克隆中的12个进行了斑点杂交以检测它们在TF-1细胞中的表达情况，杂交结果显示其中7个在凋亡的TF-1细胞中高表达（图3显示了部分结果），而在正常TF-1细胞中低表达或不表达.并用RNA印迹的方法对2个新基因转录产物(被命名为TFAR19和TFAR15(2))的长度进行了估算.结果显示（图4）TFAR15(2)长度约为1.0 kb,而TFAR19长度约为700 bp.利用Pharmacia公司的Pharmacia LKB Imagemaster DTS扫描仪扫描分析.结果显示以上两个克隆在去细胞因子组及不去细胞因子组间表达有差异(表2).表1 利用RDA技术发现在TF-1细胞去细胞因子所致凋亡中表达的基因克隆号测序长度同源性已知序列（全长）杂交结果130998%HSU32849人Hou基因(1426)H 325096%HSU54645人腺苷激酶2B(adk2b)基因(2105)H 425798%HSU21138人核糖体蛋白L9mRNA N.D51)39668%(40/68)CEF07A11 Caenorhabditis elegans cosmid F07A11(35,692)H620398%HSLDHAR人乳酸脱氢酶A(LDH-A,EC1.1.1.27)(1661)NH 724797%HUMCD24B人CD24 mRNA(2116)ND 811198%人硫氧还原蛋白mRNA(501)H 923697%人胸腺嘧啶核苷合成酶基因(18597)NH 1022098%人卫星DNA ⅢNH 11 同4ND 1328898%HSU17899人氯离子通道调节蛋白mRNA(1355)ND 141)16658%(68/117)DDP8A7 Dictyostelium discoideum P8A7 gene(2568)NH 15290 同4ND 1729096%同10NH191)29059%(71/119)HUMSFRS人剪切因子7（富含精氨酸/丝氨酸）(SFRS7)(8213)H2020099%HSU56637人帽蛋白alpha亚基同种异形体ND 231)27089%(44/49)X58779/HSHTLIP人肝三甘油酯脂酶5′非编码区ND 8(2)1)263 无同源ND 15(2)1)31274%(35/47)HUMMDR1人P糖蛋白(MDR1)mRNA(4646)H 19(2)1)25059%(71/119)同19号H 1)表示可能为新基因；ND表示没有检测；H或NH表示在去细胞因子TF-1细胞中高表达或不高表达.图3 RDA得到克隆在正常培养和去细胞因子TF-1细胞中表达的狭缝杂交结果1:β-actin;2～5: 克隆1, 5, 14, 19.图4 二个未知新基因的RNA印迹结果1: 人GAPDH; 2: TFAR15(2); 3: TFAR19.A：去细胞因子；B：加细胞因子.表2 RNA印迹扫描分析结果 去细胞因子组加细胞因子组GAPDH 1.27 1.27TFAR190.3240.132TFAR15(2)0.6960.236注：表中数值为去除背景(background)后条带的平均分光光度值(A).3 讨 论 TF-1细胞株［13］是从患红白血病的病人分离建立的人前髓细胞株.TF-1细胞的生长增殖依赖于IL-3、GM-CSF、IL-13、EPO、SCF等细胞因子的单独或联合作用［13］.一旦在培养基中去除细胞因子，TF-1细胞就会进入凋亡.一般去细胞因子8 h后，几乎70％的细胞进入凋亡［14］.我们的DNA片段化电泳结果也证实了这一点.去细胞因子后培养基中加入蛋白质合成抑制剂环己酰胺后，细胞的凋亡受到抑制［15］，这说明TF-1细胞去细胞因子后的凋亡时有大分子蛋白质的合成.尽管以前的工作证明，TF-1细胞凋亡时BCL-2的mRNA和蛋白质水平均下降，而且是通过抑制PKC激酶的活性达到的［14］.但对TF-1细胞凋亡早期基因水平的变化还没有一个全面的了解. 为了更好地研究TF-1细胞去细胞因子凋亡机制并以期发现在凋亡中起作用的新基因，我们用RDA方法进行了TF-1细胞去细胞因子凋亡中基因差异表达的研究.本研究以细胞因子刺激生长的正常TF-1细胞为本底，以去除细胞因子的进入凋亡的TF-1细胞为被检查者，试图发现在凋亡早期过程中发挥作用的一系列基因.并进一步为其他血液肿瘤细胞的诱导凋亡和临床治疗提供一定的理论基础. 总的来说，凋亡涉及到从胞外至胞内一系列的信号传导过程和效应器蛋白水解酶的活化和调节两个步骤［16］.从本研究中所得到的在TF-1细胞凋亡中差异表达的基因编码的蛋白质，主要是一些核内调控因子，这与我们选择去细胞因子的时相在早期有关.一些克隆（如Thioredoxin［17］, Hou［18］等）经过检索发现以前的工作提示它们的高表达在凋亡中起作用,为我们今后进一步地研究以上已知基因在凋亡中的作用打下良好基础.更为重要的是，我们发现了数个新基因片段.而利用未知基因的片段可以从文库中筛选全长cDNA或用RACE的方法克隆出全长cDNA序列，有可能发现信号传导途径上的新蛋白或凋亡的标记蛋白.使我们对血液肿瘤细胞的凋亡的认识有进一步的提高，具有重要的理论意义和潜在的应用价值.最近，我们已克隆出TFAR15和TFAR19的全长cDNA序列在GenBank登记并被接受，登记号分别为AF022385和AF014955.作者单位：北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室, 北京 100083参考文献 [1] Thompson C B. 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