(参考资料)荧光基团及淬灭基团
荧光PCR知识
摘要：在进行基因分离、克隆和核苷酸序列分析等生物过程中，通常会运用到聚合酶链反应技术，即PCR技术。
荧光PCR是近年来科学家和学者常用的手段，本文就对荧光PCR的原理、常用探针的优缺点以及多重荧光PCR技术的进展进行了综述。
关键词：荧光PCR；探针；多重荧光PCR聚合酶链反应( PCR) 技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用[1]。
但是，利用传统的PCR 技术进行检测鉴定时，需要进行扩增反应后的电泳分离及染色处理，且不能准确定量，使其应用受到限制[2]。
荧光PCR 技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具[1]。
1、荧光PCR原理荧光PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。
荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。
Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
Ct值是实时荧光PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。
每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。
因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
与普通PCR相比，荧光PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。
概括地说，荧光PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量[2]。
荧光报告基团选择
荧光报告基团选择常用荧光基团资料篇二：荧光探针的选择标准荧光探针的选择标准(zz)荧光团探针的选择依赖于下面的重要标准：A. 仪器。
比如，光源，滤片，检测系统。
B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。
例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。
C. 要求的灵敏度。
比如，Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。
Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA) 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。
对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。
由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。
AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。
由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。
AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。
如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 异硫氰酸荧光素耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm，发射的最大波长为520nm。
由于FITC被使用了很长时间而且产量很大，FITC被广泛应用。
荧光素的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。
DTAF是荧光素的一个衍生物，激发和发射波长均和FITC相同。
当和链霉亲合素耦联时，因为荧光强度上有明显的区别，最好不使用FITC，而使用DTAF。
Cyanine dyes （Cy2, Cy3, Cy5）花青染料Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。
Cy2和FITC使用相同的滤波片。
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分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
分子生物学-背诵版
名词解析1、原位PCR(in situ PCR):直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在完整细胞中进行PCR抗增的方法。
2、实时定量PCR(qPCR):在反应中引入了荧光标记分子，在反应过程中对反应过程中每一时刻的产物量进行实时分析。
3、易错PCR(error-prone PCR):通过改变PCR 条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的 DNA 序列或基因。
4、分子信标：是一种茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团靠近。
5、荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)。
如果检测到荧光信号超过阈值则被认为是真正的信号。
荧光阈值通常设置为3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍。
6、Ct值（循环阈值）：PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号)到达阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值与模板起始拷贝数（起始模板量）的对数呈线性关系，模板起始拷贝数越大，Ct值越小。
7、限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链的核酸内切酶，又称为内切酶或限制酶。
8、限制性核酸内切酶的星号活性：限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断。
9、质粒（plasmid）:是存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。
10、蓝白斑筛选：是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，主要为α-互补与抗生素基因。
蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。
11、转化：将质粒DNA或以质粒载体构建的重组DNA导入原核细胞细菌(大肠埃希菌)的过程。
12、包含体：是无定型的蛋白质聚合物，其中大部分（50%以上）是外源基因的表达产物，这些产物一级结构正确，但空间构像错误。
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
实时荧光定量PCR技术
荧光定量PCR过程
一 体系配制
组分名称 10×buffer（Tri-Hcl、 ( NH4)2SO4、K+、Mg2+等） 作用 缓冲液-提供反应环境
引物mix
探针mix Taq酶（10U/ul） UNG酶（1U/ul） dNTPs（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP、dUTP）20mM H2O
四 数据分析
• 从核酸的提取到实验结果的获得，中间的步骤繁多，因而影响反应的因 素也很多，主要包括：反应体系，模板的浓度与纯度，Mg2+浓度，引物 与探针的浓度，反应循环数，Taq酶活性，扩增程序等。因而实验结果 也会出现各种各样的问题，主要包括：信号强度低，扩增效率低，特异 性低，体系稳定性差等。
• 反应过程
MGB探针
• 新型TaqMan探针，其3`端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的 能量后并不发光，大大降低本底信号的干扰。此外MGB探针3`端还连接 了一个小沟结合物--二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模 板的杂交，提高探针Tm值，使得较短的探针也能达到较高的Tm值，淬灭 效果更好，荧光背景更低。
TaqMan探针
利用Taq酶的5`外切活性，即Taq酶具有天然的5`-3`核酸外切酶活性 ，能水解双链DNA 5`端的核苷酸。 依据目的基因设计一条能与之特异杂交的探针，5`端标记报告基团 Reporter，3`端标记淬灭基团Quencher，正常情况下两个基团的空间距离 很近，构成FRET关系，荧光基团信号被淬灭。PCR扩增时，引物与探针结 合到模板上，探针位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时 ，Taq酶利用5`-3`外切酶活性，将探针5`端连接的荧光分子从探针上切割 下来，破坏了两个荧光分子的FRET关系，从而发出荧光。
分子信标技术
分子信标的原理、应用及其研究进展翟士桢（基础医学院生物物理学系）摘要分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术。
分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的灵敏度，目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具。
本文着重介绍了分子信标的基本原理及其应用，并对其近年来的研究进展做以简单介绍。
1 引言在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针，用以进行定性和定量检测。
1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信标技术，很快这种技术就广泛的应用于医学、生物学、分子生物学、临床医学和化学等诸多领域。
分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。
在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。
近年来，人们对分子信标的结构作了诸多改进，发展出很多具有更多特性的新型分子信标。
随着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。
2 分子信标的原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。
在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。
（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。
根据Foerster 理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。
所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。
此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。