菌落PCR实验步骤.doc
菌落PCR PCR实验技术
菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。
是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。
操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。
现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。
退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
方法细节：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。
在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。
这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。
当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。
想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。
菌落PCR
菌液PCR的经验已有578 次阅读 2013-6-19 11:27 |系统分类:科研笔记由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性。
我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。
按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定。
结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。
也难怪老板一口回绝，只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命。
后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6，因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P 出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
6菌落PCR_2012年分子生物学实验
6.1.2【实验原理】
以单链DNA为模板、4种dNTP为底物,在模
板3’末端引物存在的条件下,利用酶进
行互补链的延伸。经变性、退火和延伸
多次循环能使微量的模板DNA得到极大程
度的扩增。
6.1.2【实验原理】 典型PCR反应体系的组成
模板DNA
引物:与被分离的目的基因两条链各自5’端 序列相互补DNA（20个左右碱基的短DNA单链)
•
电泳:110V电泳30min。
注意事项
避 免 污 染 低 温 操 作 正确选择温度 正确设置程序
思 考 题
PCR中如果出现非特异的条带，可能是哪 些方面出现问题，应该如何调整？
下次实验
重组克隆子的 酶切鉴定
4、琼脂糖电泳检测
① 制胶: 配置25ml 1%琼脂糖凝胶(2人配一块胶,使用 11个小齿的梳子)。（不知道如何配置的同学问老师）
② 上样电泳:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. A1(1#) A1(2#) A1(3#) A1(-) DNA Marker A2(1#) A2(2#) A2(3#) A2(-) 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 5 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 所有样品各加入 2µl 6×loading buffer， 混匀后再上样。
细枪头粘菌：镊子取细枪头,枪头粘1个菌落,然后置入 EP管,用手转动枪头几圈,弃枪头。(在平板上做好标记)
② 循环扩增：按下述程序进行扩增 95℃ 预变性 5 min 94 ℃ 变性 45 sec 50 ℃ 退火 45 sec 30 cycles 72 ℃ 延伸 45 sec 72 ℃ 延伸 5 min
TaqDNA聚合酶 dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP） 反应缓冲液
简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤
简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物学实验中被广泛应用的技术，它能够在体外扩增特定的DNA片段。
PCR的基本步骤涉及到DNA的分离、引物设计、扩增、检测等多个环节。
本文将简述PCR的基本步骤和内容。
PCR的基本步骤PCR主要包含三个基本步骤：变性、退火和延伸。
下面将详细介绍每个步骤的内容和操作。
变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，它的目的是将双链DNA分离成两条单链DNA。
这个过程通常通过加热反应体系到较高的温度（通常是95°C）来实现。
在这个高温下，氢键断裂，双链DNA解偶，形成两条单链DNA。
退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，它涉及引物的结合和弱的碱性条件。
在这个步骤中，温度被降低到适合引物与目标DNA序列结合的温度。
引物是两小片DNA序列，它们分别位于待扩增区域的目标DNA序列的两端。
通过结合到目标序列上，引物提供木核酸链的起始点。
延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，它在合适的温度和时间下进行。
在这个过程中，聚合酶（如Taq聚合酶）通过加入互补的核苷酸，将引物与单链DNA扩增为双链DNA。
聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链，并到达引物的5’端。
一个完整的PCR循环完成后，会产生两条与目标DNA序列相同的DNA片段。
PCR的循环PCR的基本步骤在一个循环中完成一次，但为了扩增特定的DNA片段，需要进行多个PCR循环。
这些循环由PCR仪自动完成。
一般情况下，PCR的循环次数在20-40次之间。
PCR的应用PCR技术被广泛应用于多个领域，包括基因分型、基因突变检测、遗传学研究等。
通过PCR技术，可以在短时间内快速扩增目标DNA片段，为后续实验打下基础。
结论PCR是一种重要而有效的DNA扩增技术。
通过其基本步骤的反复循环，可以在体外快速扩增特定的DNA片段。
在实际应用中，我们可以利用PCR技术来进行遗传学研究、医学诊断以及其他领域的实验。
菌液PCR
菌液PCR的经验由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR 的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。
按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen 的质粒小提，累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA 3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2. 菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中37°C 200rp m摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5. 模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6. 退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C 均可以P出目的条带7. 循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。
pcr技术原理实验步骤和应用过程
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
pcr技术及其产物鉴定实验步骤
pcr技术及其产物鉴定实验步骤介绍PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可在实验室中复制并扩增特定的DNA片段。
该技术在基因测序、疾病诊断和遗传学研究等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍PCR技术的基本原理以及实验步骤，以及PCR产物的鉴定方法。
PCR技术原理PCR技术基于酶的活性，通过体外复制DNA。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被加热分解为两条单链。
在退火步骤中，引物（即DNA复制所需的起始序列）与目标DNA序列的互补部分结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶在退火后重新合成DNA链。
PCR实验步骤以下是PCR实验的一般步骤：1. 样品准备从待检测的样品中提取DNA。
可以使用多种提取方法，如正常提取、血液提取或组织提取方法。
2. PCR试剂准备准备PCR反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液和PCR酶。
3. PCR反应设置将PCR反应液分装到聚合酶链式反应管中。
4. PCR反应条件设置PCR反应条件，包括温度和时间。
5. PCR循环将PCR反应管放置在热循环仪中进行PCR循环。
PCR循环的次数取决于所需扩增的DNA片段的数量。
6. 电泳分析使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，然后通过电场使DNA在凝胶中移动，并使用紫外线照射来观察DNA片段的迁移。
PCR产物鉴定方法通过PCR产物鉴定可以确定目标DNA片段是否被扩增成功。
以下是PCR产物鉴定的几种常用方法：1. 凝胶电泳分析将PCR产物与DNA大小标准一起加载到琼脂糖凝胶上，并通过电泳分析来观察DNA片段的迁移和大小。
2. DNA测序通过DNA测序技术来确定PCR产物的序列，从而验证目标DNA片段的扩增情况。
3. 启动子鉴定通过PCR产物的韧带背法或限制酶切等实验方法，来鉴定目标DNA片段是否存在期望的启动子序列。
结论PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，可以高效地扩增特定的DNA片段。
酵母菌落PCR试剂盒使用指南
产品编号
CAT：RY8001
保存条件
-20 ℃保存，有效期1年
产品组分
产品概述
本试剂盒含有绿色染料，可在反应结束后直接进行电泳，能够快速扩增酵母中重组质粒目的基因片段，省时省力。
Yeast lysis buffer用于破坏酵母的细胞壁；2×Yeast PCR mix含PCR buffer，dNTPs，MgCl2，热启动快速Taq酶，客户只需加入引物和模板/酵母菌落即可进行扩增，减少移液操作，提高了稳定性，且2×Yeast PCR mix中含有保护剂，反复冻融后仍可保持稳定性。
PCR产物的3’端带有A，可直接用于TA克隆。
实验流程
1、吸取3-3.5 μl Yeast lysis buffer到PCR管中，用无菌枪头或牙签蘸取适量酵母菌至PCR管中。
2、吸打（搅拌）混匀后，置于98 ℃反应10-20 min。
3、再准备一支无菌PCR管，按下表配制反应体系。
PCR反应体系：
* 步骤2的反应液短暂离心,混匀后吸取1 μl作为模板，为佳
PCR反应条件：
* 该退火温度根据引物的Tm值进行调整，一般设置Tm -5 ℃
案例：
图注：从SD/-Leu-Trp-His-Ade培养基中挑取酵母菌落直接进行酵母菌落PCR
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
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菌落PCR资料
PCR, 菌落, 资料
菌落PCR
菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。
是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。
操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
操作方法：
1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。
现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号
2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟
3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。
退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低
5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以
我的做法是：
用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。
在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。
这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。
当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了
我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。
想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。
把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。
取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。
其他的和普通pcr一样。
我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。
先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。
是的，菌落PCR不难。
但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。
扩培后再作菌落PCR就得到阳性结果了。
我是这样做的,取菌液60ul至ep管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模板,屡试不爽
拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了
如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取1ul作模板
模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的PCR里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释
一般来说, 菌落PCR能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果.
一般会出现假阳性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建议引物一个为目的基因一个为载体上的，用无菌牙签挑取菌落，在配好的PCR体系中赞一下，PCR反应条件为95度10分钟94度40秒退火55度40秒72度1分钟30个循环
建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑是否能切出目的片段。
假阳性并不高，可挑菌落摇菌12小时以上再取菌液pcr,初始变性温度可设为98度。
我们一般将接种好的菌液煮沸15min，4000rpm离心5min，用上清作模板，效果很好。
非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手.
1.挑取菌落加入50ul dd水中,振摇.
2.99度, 5'灭活菌液中的酶
3.12000rpm离心1'去除细胞碎片
4.取上清pcr,50ul体系取10ul
我做就是将菌株挑一点点加入PCR体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌落放到37度继续让它长大一些,方便接种.
刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已.
我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀疑;如果似有似无,一般都是假阳性.
菌落PCR ，菌液PCR（菌液的体积不能过大，大了会影响PCR体系，导致扩增不出来，一般取0.3微升左右就行了）都可以的，一般10微升的PCR体系，跑样时用小梳孔，（凝胶使用第一次时做回收用，将溴酚兰及核酸以外的凝胶割下来，就可以再用来做鉴定胶了，一般鉴定用的旧胶用２次都是可以的，比较节省）。
理论上，基因特异性引物和载体上的通用引物都是可以的。
最重要的是带marker,先判断大小。
当然最后还要提质粒酶切鉴定一下。
一般PCR阳性的菌，正确的可能性非常大。
但也不排除PCR阳性，但酶切阴性的可能，因为如果基因是PCR后克隆到载体的，可能会存在碱基突变的可能。
所以需要PCR和酶切两种方法鉴定。
但最终应以测序的结果为准。
跑得很好的电泳：200v，我的目的片断是400多pb，2%普通胶，跑了大概20分钟左右吧
菌落PCR很容易出现假阳性，可能与菌落本身的含量过于复杂所导致的
1。
用载体引物来作一般可以降低假阳性。
2。
菌落PCR作出来如果都是阳性或是阴性都不对，如果出现有的有，有的没有，那么可以将其摇成菌液，作菌液PCR，或是直接再次涂版，然后提取菌落作PCR，如果个个都是，证明准确。
3。
菌落PCR的假阳性很引物本身有很大的关系，所以建议鉴定做好还是酶切最为可靠，我吃过很多关于菌落PCR的亏，所以建议还是酶切
试一下热启动，可以消除引物二聚体。