RT-PCR实验报告
实验四-逆转录PCR-(RT-PCR)
实验四逆转录PCR (RT-PCR)【实验目的】1．了解用逆转录PCR法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录PCR的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应〔PCR〕过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增DNA序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增长的过程，使其成为检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。
一般经25-35轮循环就可使模板DNA扩增达106 倍。
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA〔complement DNA〕合成〔即RNA的反转录〔RT，reversetranscription〕〕，同cDNA的PCR 结合在一起的技术，提供了一种基因表达检测、定量和cDNA克隆的快速灵敏的方法。
由于cDNA包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含子，只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究，因此RT-PCR成为目前获得目的基因的一种重要手段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的基本原理〔图〕。
首先是在逆转录酶的作用下从RNA合成cDNA，即总RNA中的mRNA 在体外被反向转录合成DNA拷贝，因拷贝DNA的核苷酸序列完全互补于模板mRNA，称之为互补DNA 〔cDNA〕；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸〔dNTP〕为材料，在引物的引导下复制出大量的cDNA或目的片段。
在RT时，有3种引物可选择〔表4.1) 。
用1〕和2〕方法，理论上是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
如果用3〕方法，先要去:// 查它的序列，并用oligo 等软件设计引物。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
XX病毒核酸检测剂盒验证实验报告(模版)
XX病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR法）验证实验报告试验人员：XXX试验日期：XXXX年XX月XX日试验单位：XXX实验室（盖章）XX病毒核酸检测剂盒验证实验报告受XX大学XX学院委托，对XX实验室研制的XX病毒核酸检测剂盒（RT-PCR法）进行验证性检测，现将结果报告如下：1 实验材料1.1 试剂盒样品4个XX病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR法），规格均为48份/盒，均由XX实验室提供。
每个试剂盒包装内含有NDVUN反应液A（棕色）1管（240 µL）、NDVUN反应液B（白色）1管（48 µL）、NDVUN 反应液C（黄色）1管（24 µL）、NDVUN阴性质控品（绿色）1管（1 mL）、NDVUN阳性质控品（红色）1管（50 µL）。
1.2 检测样品检测样品包含：XX病毒（禽类病毒）阳性样品10份（包括10种不同XX病毒毒株的cDNA样品）和阴性样品6份（包括1份灭菌水和5份其他禽源病毒的cRNA样品）。
均由XX实验室提供。
2 实验方法2.1 样品设盲试剂盒研制单位将16份检测样品1~16分别编号，并将样品背景书面材料交给复核员保存，待试验完成后与检验员解盲。
2.2 样品检测2.2.1PCR扩增取适量PCR反应管，每管加入NDVUN PCR反应液A 5 µL、NDVUN PCR反应液B 1 µL、NDVUN 反应液C 0.5 µL；于上述PCR反应管中分别加入阳性质控品、阴性质控品和16份待测标本核酸各5 µL（建议待测核酸RNA或cDNA量为10 pg～1 µg）；再补加入DEPC水13.5 µL，将总体积调整至25 uL，8 000 rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
PCR反应条件设置为：50℃30 min，1个循环；95℃3 min，1个循环；94℃30 s→55℃30 s→72℃30 s，30~35个循环；72℃7 min。
实验二 RT-PCR
RT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription； RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反 应组合在一起的方法。
RT-PCR的原理
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分 析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另
PCR引物设计
1.
2.
3. 4. 5. 6.
7.
Байду номын сангаас
一对引物，与3′端互补 长度：15～30个核苷酸 碱基分布随机 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 3′端必须互补 5′端可游离
PCR反应的特点
特异性强： 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增 加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模 板扩增到微克(g=-6)水平 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩 增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要 用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌 及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩 增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、 洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩 增检测。
㈠ ㈡ ㈢ ㈣ ㈤ 筑巢PCR 多重PCR 不对称PCR 共享引物PCR 锚定PCR ㈥ ㈦ ㈧ ㈨ ㈩ 彩色PCR 原位PCR 定量PCR 差异显示PCR 重组PCR
【实验试剂】
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit
（RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase;
退火温度的优化
延伸
乙脑检测实验报告
1. 了解乙脑病毒的生物学特性及其传播途径。
2. 掌握乙脑病毒检测的基本原理和方法。
3. 提高对乙脑病毒检测技术的操作技能。
二、实验原理乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一种黄病毒科病毒，主要通过蚊子叮咬传播，引起人类和动物发生脑炎。
乙脑病毒检测主要包括病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等。
本实验采用RT-PCR技术检测乙脑病毒核酸。
三、实验材料1. 乙脑病毒核酸模板：阳性对照、阴性对照、待测样本。
2. RT-PCR试剂盒：包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒。
3. 实验仪器：PCR仪、离心机、凝胶成像系统、电子天平等。
四、实验方法1. 样本处理（1）取待测样本，加入RNA提取试剂盒中的裂解液，充分振荡，使病毒核酸充分释放。
（2）按照试剂盒说明书进行RNA提取。
（3）将提取的RNA进行逆转录，合成cDNA。
2. RT-PCR反应（1）配制PCR反应体系，加入引物、模板、dNTPs、Taq酶等。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应。
3. 结果分析（1）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。
（2）以阳性对照和阴性对照为标准，判断待测样本是否含有乙脑病毒核酸。
1. 阳性对照：在预期位置出现特异性扩增条带。
2. 阴性对照：无特异性扩增条带。
3. 待测样本：在预期位置出现特异性扩增条带。
六、实验讨论1. 本实验采用RT-PCR技术检测乙脑病毒核酸，具有较高的灵敏度和特异性。
2. 实验过程中，应注意以下几点：（1）严格操作，避免污染。
（2）提取RNA时，确保充分裂解病毒。
（3）逆转录反应时，严格控制温度和时间。
（4）PCR反应时，优化反应体系，提高扩增效率。
3. 乙脑病毒检测在流行病学调查、临床诊断和疫苗研发等方面具有重要意义。
七、结论本实验成功检测了乙脑病毒核酸，表明RT-PCR技术是一种高效、灵敏的乙脑病毒检测方法。
在实际应用中，应结合多种检测技术，提高乙脑病毒检测的准确性和可靠性。
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全第一篇：RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
基因工程实验报告
基因工程实验报告摘要：提取小麦的总的RNA通过RT—PCR扩增出GAPDH截短体基因ｃDNA，ＰＣＲ扩增ｃDNA获得大量目的基因，对目的基因和表达载体p ＧＥＸ４Ｔ－１进行双酶切，通过电泳分离条带胶回收酶切的目的基因和载体，然后载体和目的基因连接构建表达载体，重组载体转入大肠杆菌top10中大量复制目的基因；提取质粒，转入大肠杆菌bl21，通过ＩＰＴＧ诱导目的基因的表达；通过ＳＤＳ染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交检验目的蛋白是否表达。
实验流程：小麦幼苗总ＲＮＡ提取ＲＴ＿ＰＣＲ扩增目的基因表达载体构建表达菌株转化（ｔｏｐ１０）从ｔｏｐ１０转入ＢＬ２１诱导表达Ｗｅｓｅｒｎ杂交一．目的基因的获得１．小麦总ｒｎａ的提取（Ｔｒｉｚｏｌ法）１在研钵中加入液氮，再将小麦剪成小片段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的钥匙取１００ｕｌ粉末于已加入１ｍｌ的ｔｒｉｚｏｌ的ＥＰ管中，充分混匀。
２室温放置５ｍｉｎ，然后加入２ｏｏｕｌ的氯仿，剧烈震荡。
３１２０００ｒｐｍ离心１０分钟，取上清于新的ＥＰ管，加入500ul异丙醇，温和颠倒，室温放置10分钟，12000rpm离心10分钟。
4小心弃上清，加入75%乙醇，混匀，4度12000rpm离心5分钟。
5重复46弃上清，室温干燥5-10分钟，用30uldepc溶解rna。
2.rna电泳检测是否提取出rna（10ulrna+1ul buffer）图中出现明显的亮的条带的即表示提取出rna，其中我们提取的rna比较少条带不明显，可能是操作过程中被污染，所以在提取rna是一定要注意防止rna降解，因为空气中随处都是rna酶，所以要带上手套，快速操作，尽量不要暴露在空气中，使用处理过的试管，器材。
3.RT-PCR扩增目的基因cDNA3.1 rna反转录Total RNA 6ulOligo dt primer 1ulH2o 5ul65℃5min,补加下列试剂5×reaction buffer 4ulRibolock rnase inhibitor 1ul10mM dntp mix 2ulRevertaid m-mulv reverse transcripase 1ul42℃ 60min70℃ 5min3.2 PCR扩增目的基因（表达引物扩增 25ul)2×pcr mix 12.5ul 95℃1mincDNA 1ul 95℃10s引物GAPDH1-1 1ul 58℃ 20s 35cycle引物GAPDH1-2 1ul 72℃45sH2O 9.5ul 72℃10min通过图片的条带可以看出pcr扩增的产物；通过RT-PCR获得的目的片段，为连续表达的基因片段，去除了真核基因中的内含子序列，通过重组质粒载体的构建可以直接在宿主大肠杆菌中克隆和表达。
总RNA的提取,RT-PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
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逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
使dna充分变性，减少dna 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要吝啬这个步骤。
此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr反应得以顺利进行。
（二）变性--退火--延伸循环：①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链。
（三）pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。
（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。
2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。
通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用，可以直接用于ta克隆的进行。
什么是半定量pcr半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription andpolymerase chain reaction ,sqrt-pcr）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中特异mrna的相对数量。
以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标化的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。
这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。
步骤： 1.抽提rna，2.反转录获得cdna，3.以cdna为模板做pcr 注意：步骤1，rna抽提质量一定要好，注意污染。
内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。
步骤3，半定量rt-pcr应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！半定量rt-pcr与荧光定量real-time pcr最大的区别就在于 semi-pcr需要跑电泳根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-time pcr则无需电泳可以实时监测整个pcr的全程并且由给出的ct值及standard curve来判断gene拷贝数的高低。
所以由上可见 semi-pcr不如real-time pcr精确。
至于rt 应该指 reverse transcription。
为了便于区分我们更偏好使用qpcr来特指 real-time pcr 同时要注意realtime-pcr的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。
所以要利用melting curve，如果是第一次做一个目的基因的realtime-pcr，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。
rt-pcr 只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。
而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。
所以，realitime-pcr更精确些。
篇二：rt-pcr实验方法逆转录pcr (rt-pcr)实验四逆转录pcr (rt-pcr)【实验目的】1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。
【实验原理】聚合酶链式反应（pcr）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。
因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增实验四逆转录pcr (rt-pcr) 【实验目的】1．了解用逆转录pcr法获取目的基因的原理。
2．学习和掌握逆转录pcr的技术和方法。
【实验原理】rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。
rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。
rt-pcr的基本原理（图4.1）。
首先是在逆转录酶的作用下从rna合成 cdna，即总rna中的mrna在体外被反向转录合成dna拷贝，因拷贝dna的核苷酸序列完全互补于模板mrna，称之为互补dna（cdna）；然后再利用dna聚合酶，以cdna第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dntp）为材料，在引物的引导下复制出大量的cdna或目的片段。
在rt时，有3种引物可选择（表4.1) 。
用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cdna，还要用此产物做pcr的模板继续扩增。
如果用3）方法，先要去/retype/zoom/7b17bdaf89eb172ded63b7a3?pn=2&x=0&y=1268&raww=535&rawh=340&o=png_6_0_0_135_265_601_383_892.979_1262.879&type=pic&aimh=305.04672897196264&md5sum=388ad1889e15cfe390decc00721a2ce0&sign=8ccc656492&zoom=&png=48793-106221&jpg=0-0"target="_blank">点此查看由图4.1不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。
引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。
这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。
为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。
随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。
因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一般选用poly(a)+rna。
oligo(dt)起始比随机引物特异性高。
它同大多数真核细胞mrna 3端所发现的poly(a)尾杂交。
因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cdna的数量和复杂度要少得多。
因为其较高的特异性，oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及poly(a)+选择进行优化。
建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dt)。
oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr。
基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。
gsp是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。
用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。
gsp可以同与mrna 3最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。
已经制备好的双链cdna和一般dna一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当的接头(linker)，接头可以是在pcr引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经pcr扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna的末端接上一段寡聚dg和dc或dt和da尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。
本实验是要从小鼠肝脏组织中获取fas配体基因，fas配体(fasl)是一分子量约为40u的ii型跨膜糖蛋白，属tnf家族成员。
活化的t细胞可表达fas和fasl，并通过fas/fasl系统介导细胞凋亡作用，保持机体免疫系统的自稳态。