生物实验4 实时定量PCR 实验报告
pcr技术实验报告
pcr技术实验报告PCR技术实验报告引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA片段，从而使得微量的DNA得以扩增至足够多的量进行进一步的分析和研究。
本实验旨在通过PCR技术扩增目标DNA片段，验证其在实验条件下的可行性和准确性。
实验方法1. 样品准备：从细胞或组织中提取DNA，并进行纯化处理。
2. PCR反应体系的准备：按照所需的PCR反应体系配制反应液。
3. PCR扩增：将DNA模板加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应。
4. 扩增产物分析：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
实验结果通过PCR技术扩增，成功获得了目标DNA片段，并在琼脂糖凝胶电泳中观察到了明显的扩增产物条带。
实验结果表明PCR技术在实验条件下具有较高的可行性和准确性，能够快速、高效地扩增目标DNA片段。
讨论本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的分子生物学研究提供了可靠的技术支持。
同时，本实验还表明PCR技术在分子诊断、基因克隆等领域具有重要的应用前景。
结论通过PCR技术实验，成功扩增了目标DNA片段，并验证了其在实验条件下的可行性和准确性。
PCR技术的高效、快速特点使其在分子生物学研究和临床诊断中具有广阔的应用前景。
总结PCR技术作为一种重要的分子生物学技术，已经成为现代生命科学研究中不可或缺的工具。
本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的研究和应用提供了可靠的技术支持。
PCR技术的不断发展和完善，将为生命科学领域的研究和临床诊断带来更多的可能性和机遇。
生物实验实时定量PCR 实验报告
实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。
按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。
注意，每次稀释都要换Tip头。
2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。
3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、104、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。
向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。
4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。
分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。
将加好样的8联管振荡。
5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
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为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
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定量和定性测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。
1/log2=-3.32
如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
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纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。
截距B则为原始模板趋 向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时 荧光PCR，如果设定的 扩增循环数为40，则其 截距B即应≥40。
A
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实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
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实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
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基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
基本概念
扩增效率E（amplification efficiency） 扩增 效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循 环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在 PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5) 可变换为: Ct =( -1/log(1+E)) Log X +Log YCt / log(1+E) (7) A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E) 如果扩增效率为1（100%），则斜率A =1/log2=-3.32 如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
PCR的种类及其应用实验报告
PCR的种类及其应用实验报告简介聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种分子生物学技术，可在体外合成大量特定DNA片段。
PCR技术广泛应用于生物医学研究、疾病诊断以及生物工程领域。
本实验旨在探究PCR技术的种类及其应用。
PCR的种类传统PCR传统PCR包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。
首先，通过高温变性将DNA 双链分离为两条单链DNA。
然后，引物与目标DNA序列的两端结合。
最后，通过DNA 聚合酶的作用，在引物的起始点上合成新的DNA链。
实时定量PCR实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是PCR的一种改进形式，可快速、准确地定量测定 DNA的相对数量。
qPCR使用荧光探针或染料实时监测PCR反应的进程，从而实时测定DNA产物的累积量。
qPCR技术广泛应用于基因表达研究和疾病诊断等领域。
反转录PCR反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）是一种结合了反转录和PCR的技术，可将RNA转录成DNA，并进一步进行PCR扩增。
RT-PCR技术常用于研究基因表达，可以测定特定基因的转录水平。
数字PCR数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种对DNA分子进行数字化处理的PCR技术。
这种技术能够准确计算起始DNA分子的数量，而不依赖于外部标准曲线。
dPCR常用于检测低拷贝基因、测定突变频率等。
PCR的应用基因克隆PCR技术在基因克隆中起着关键作用。
通过合成引物，选择性扩增所需基因片段，可以获得大量特定目标DNA。
这些扩增的DNA片段可以用于构建基因表达载体、插入突变或其他基因编辑等实验操作。
疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要意义。
通过特定引物扩增病原微生物的DNA或RNA，可以快速检测出疾病的存在。
例如，PCR在检测病毒、细菌感染和遗传疾病等方面广泛应用。
法医学鉴定PCR技术在法医学领域有着重要应用，可以通过扩增可疑样本中目标基因的DNA片段，进行罪犯的DNA鉴定。
QPCR实验报告
QPCR实验报告实验报告：QPCR技术在基因表达分析中的应用一、引言基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生相应分子的过程，是维持生物体正常功能的关键步骤。
定量聚合酶链反应（Quantitative PCR，QPCR）是一种常用的检测和分析基因表达水平的方法。
该方法通过测量目标基因在不同时间点或条件下的转录水平，可以揭示基因调控机制、寻找新的治疗靶点以及评估药物治疗的效果。
本实验旨在熟悉和掌握QPCR技术的基本操作步骤，并通过示例实验，了解该技术在基因表达分析中的应用。
二、材料与方法2.1实验仪器-核酸提取仪-反转录仪-实时定量PCR仪2.2实验材料-被测样品：包括正常组织和疾病组织样本-细胞裂解缓冲液-细胞核酸提取试剂盒-反转录试剂盒-实时定量PCR试剂盒2.3实验步骤1.样品处理：将被测样品均匀切割后，加入细胞裂解缓冲液使细胞破裂，并离心去除细胞碎片。
2.核酸提取：使用核酸提取试剂盒从细胞裂解液中提取总RNA，按照试剂盒说明进行操作。
3.反转录：将提取的总RNA加入反转录试剂盒进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。
4.实时定量PCR：根据目标基因和参比基因设计引物，并使用实时定量PCR试剂盒进行PCR反应，测量模板DNA的含量。
5.数据分析：根据实时定量PCR的结果，计算目标基因的相对表达量，并进行统计分析。
三、结果与讨论3.1实时定量PCR结果通过实时定量PCR测量得到各样品中目标基因的转录水平。
以CT值为指标，CT值越低代表目标基因的转录水平越高。
同时还可以通过计算相对定量，比较不同样品之间目标基因的表达变化。
3.2数据分析通过对实时定量PCR结果的数据分析，可以得到目标基因的相对表达量，并进行统计学分析。
通常可以通过t检验来判断不同样品之间目标基因的表达差异是否具有统计学意义。
3.3结果讨论根据实验结果，可以得出目标基因在不同样品之间的表达差异是否达到统计学意义，并进一步分析可能的原因。
QRT-PCR(荧光定量PCR)
实用文档
CT 值（ threshold value ）：每个反应管内的 荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称 为 CT 值。 研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越 小。反之亦然。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表 CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选 cDNA的前提下，完成对cDNA片段的克隆
实用量的飞跃，而 且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解 决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光 化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产 物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们 就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从 而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如下图) 。
实用文档
荧光定量PCR化学原理
1、SYBR Green （荧光染料掺入法） 在PCR反应体系中， 加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料 分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan （探针法） PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端 分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩 增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光 分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同 步。
实时荧光定量PCR技术详解及总结
实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。
在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。
通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。
与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。
首先，它被广泛应用于基因表达分析。
通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。
其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。
例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。
此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。
相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。
首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。
实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。
其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。
实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。
此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。
总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。
该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。
实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。
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实验四定量PCR扩增
姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞
一、实验目的
复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程
二、实验原理
实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
三、实验仪器及材料
real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品
四、实验步骤
1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。
按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。
注意，每次稀释都要换Tip头。
2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。
3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、10
4、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。
向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。
4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。
分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。
将加好样的8联管振荡。
5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。
振荡好的样品进机进行PCR扩增。
6、扩增后利用软件分析C T值及未知样的定量结果。
五、实验结果与讨论
1、实验结果如何？试分析。
答：实验结果及分析如下。
（1）、实验具体数据见下表
Well Task CтCт Mean Cт SD Quantity Quantity
Mean Quantity SD
Ct
Threshold
A1 STANDARD 8.2488 8.2527 0.0 0 0.0712 A2 STANDARD 8.2565 8.2527 0.0 0 0.0712 B1 STANDARD 11.3893 11.6598 0.3825 0.0712 B2 STANDARD 11.9303 11.6598 0.3825 0.0712 C1 STANDARD 15.3292 14.9668 0.5126 0.0712 C2 STANDARD 14.6043 14.9668 0.5126 0.0712 D1 STANDARD 19.4912 19.3080 0.2590 100000 0.0712 D2 STANDARD 19.1249 19.3080 0.2590 100000 0.0712 E1 STANDARD 22.5385 22.4196 0.1681 10000 0.0712 E2 STANDARD 22.3007 22.4196 0.1681 10000 0.0712 F1 UNKNOWN 8.9370 8.9691 0.0454 *******.625 0.0712 F2 UNKNOWN 9.0012 8.9691 0.0454 *******.625 0.0712 G1 NTC 32.5329 0.0712 G2 NTC 32.9549 0.0712 其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。
每个样品做两个平行。
通过软件分析，由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83×107。
（2）、扩增曲线
从扩增曲线中可以看出，样品均经历了良好的扩增过程。
（3）、标准曲线
从标准曲线中可以看出，R2值较好，标准曲线可以使用。
但扩增效率一般。
其中106和107的两个平行样的CT偏差较大，这一现象可以从（1）表中看出，其SD分别为0.5126和0.3825，相比其他点较大，一般认为SD大于0.5不理想。
（4）、融解曲线
图中，可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内（82~86℃），所以扩增是正常的，不存在非特异性扩增。
2、实验过程中需要注意些什么细节？
答：（1）、操作过程中尽量不要说话，以避免污染；
（2）、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下，这样样品不会留在管壁上；
（3）、不能在定量PCR管做标记，裸手不可以接触定量PCR管，操作时应戴手套。
（4）、8联定量PCR管加完样后，可先将盖子放上，等放到振荡机上再把盖子盖紧。
3、通过这个实验你有什么收获？这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助？
答：通过实验我加深了对定量PCR的理论认识，熟悉了实时荧光定量PCR的操作流程。
这一实验对我今后研究环境问题的微生物活动方面是有帮助的。
六、思考题
如果你自己的试验过程中，发现扩增效率是0.76、1.52或0.99, 实验结果能用吗？如果结果不能用，请说明原因，怎么样改变实验来解决这个问题？
答：扩增效率的有效值分两个范围，宽范围在0.8-1.2之间，窄范围在0.9-1.1之间。
如题，若实验得到的扩增效率为0.76或1.52，均在宽范围之外吗，则说明扩增不太理想，数据不能直接用。
可以通过删除某些偏差较大的点来提高扩增效率，若还不行，则需要重新实验。
若扩增效率为0.99，则表明扩增较好，结果可以使用。
在实验中，可以使用购买特定公司配好的mix溶液，来提高扩增效率。
若扩增效率太低，可能存在非特异性扩增，应排查一下反应体系，根据融解曲线是否单峰，并结合扩增曲线CT值进行综合分析。