拟南芥转化
拟南芥转化
2、转化液的配制：MS粉2.21g/L+蔗糖5g/L+Silwet L-77 0.1% (用氢氧化钠调PH至5.8)
3、转化前一天将植株浇透。
4、第一次将花序浸入转化液中20s，然后直接放入温度适宜的培养箱暗培养18-24h，5-7天后第二次浸染我直接有枪将转化液滴在花蕾上然后暗培养，要说明的是我两次浸染后都没有保鲜膜包住植株保湿。
以前用过抽真空法，效果并不好，后来直接沾花
我的转化液只有蔗糖和silwet-77
我一般先挑菌小摇，之后再扩繁，其实YEP还是LB差别不是很大
摇好的菌液OD在1.5--3之间，加转化液后0.75-1.5.
最重要的就是苗的状态，有时候长的好的苗三四棵就足够的
我转化拟南芥的主要实验步骤如下：
1、将-20保存的菌液加入10mLYEB(Kan20+str20+Rif40)中，假如比例为1：100，然后在
28度250rpm的摇床培养大概两天，再将哦诶样所得的菌液按1：100的比例加入250mL
新鲜的YEB中继续按上述条件培养，大概16h后取出并在4度5000rpm离心5min收集菌体，
6、一般潮霉素抗性，是大苗和小苗的差别，如果用卡那抗性，没有转进去的会变成白化苗，一般见光7天后就可辨认出来。一分辨出来就移栽，不要让呆很长时间。
朝天椒 发表于 2008-4-25 12:06
看了楼主的步骤，我们用的转化液就是MS加蔗糖,加silwet-77没有调pH。侵染时间1-3min，侵染后花盆平放覆保鲜膜并黑暗培养24h后正常条件培养至结果，无需第二次浸染，浸染一定要彻底，保证每朵花蕾都被浸染。我认为最关键的不是用什么浸染怎样浸染，而待转化拟南芥的生长状态，一棵强壮的植株可以获得几十棵阳性，而几十棵弱小植株也无法获得一棵阳性苗。
拟南芥原生质体制备转化方法整理
溶液配制1、纤维素酶解液：2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）3、W5 溶液4、MMG溶液5、WI溶液拟南芥原生质体制备转化方法整理一、土培室播种种植的拟南芥。
二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。
四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。
并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。
（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。
）六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。
当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。
（此时预冷一定量W5溶液）七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。
尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。
十一、在冰上静至原生质体30分钟。
以下操作在室温23℃下进行十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。
在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。
然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。
十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。
十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
拟南芥转化 浸花法
拟南芥转化—浸花法实验步骤：关键记录：a浸染的最好阶段是一个花盆里有20-30个花絮以及一些成熟的果夹，这些果夹浸染之前需要剪掉。
b/颠倒植株将植株浸入农杆菌细胞悬浮液10s。
c.塑料膜包裹保持黑暗高湿度16-24h。
一周后可再次侵入农杆菌细胞悬浮液浸染。
d.移去塑料膜，让植株在温室中生长一个月。
e.干燥成熟的果夹用小袋套住。
f.筛选主要转基因植株在筛选培养基上。
说明：如果转化实验要延迟或者构建没有准备好又或者想要植株有很多的花序，可以剪掉植株第一次的抽苔，使其长出更多的分支和花序，在剪去第一个抽苔的6-8天后，开始农杆菌悬浮液浸染。
如果希望增强营养来支持转化的细胞，同时又减少野生型种子（即增加转化效率）以及减少筛选主要转基因植株期间真菌病害。
去掉用于转化植株上的果夹。
具体步骤：1.已转化的农杆菌在含抗生素筛选培养基上长出单克隆，对鉴定后确定转化成功的单克隆于5ml液体YEP培养基（含抗生素）28℃活化培养16h。
2.取适量（1:50）活化培养的菌液于50ml液体YEP培养基（含抗生素）中28℃扩大培养6h。
注意：在此要鉴定是否为正确的转化农杆菌，酶切、PCR均可。
确认后，为了下次转化浸染，可以在这一步将农杆菌甘油管-70℃保存或者将菌液密封保存于4℃,高达1个月。
3.将20ml农杆菌细胞悬浮液于4000g、10min室温离心，加入1倍体积的10mM MgCl2,5%蔗糖溶液（即100ml H2O中加MgCl2·6H2O 0.202g，蔗糖 5g）。
浸染前加表面活性剂使其终浓度为0.02%（20ml加4uL）。
混匀，转移至50ml离心管。
注意：表面活性剂浓度过高有毒害。
为了产生含两种独立载体的转化植株，我们要用两种农杆菌细胞，各含有一种载体，分别加入30mL 10mM MgCl2,5%蔗糖溶液，浸染前加入适量表面活性剂，将它们混合在一个大烧杯里。
在双转化试验中我们至少要用48株植株。
间隔7天进行第二次浸染植株。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化方案
拟南芥的花浸渍转化是利用其遗传特性实现不同的目的的一项技术。
通常来说，拟南芥的花浸渍转化方案分成三个步骤：1）花粉培养 2）植物体系建立 3）转基因表达系统构建。
首先，在进行拟南芥花浸渍转化方案时，花粉培养是必不可少的一个步骤。
在该步骤中，
一般利用磷酸三钠、核酸抗凝剂、复合氮肥和碳源构建适宜的花粉培养基，利用此基础培养拟
南芥花粉以便获得正常受精细胞。
其次，完成花粉培养和受精细胞形成后，将进行植物体系的建立。
在此步骤中，需要构筑
一个适宜的植物大培养体系，一般以磷酸铵、硝酸钾、硫酸钙和无机氮构建营养基，并加入2％的半乳糖等激素以利于受精细胞的胚胎发育，建立起适宜的植物体系。
最后，构建转基因表达系统，这是拟南芥花浸渍转化中最重要也是最复杂的一步。
常用的
基因载体可以分为普通的DNA质粒和Agrobacterium质粒载体，其中保护基因所需的抗生素
标记也不相同，它们分别是：对于普通的DNA质粒，采用Kanamycin标记；而对于Agrobacterium质粒载体，采用Bastinomycin标记。
在此步骤中，我们还需要将培养好的转
基因拟南芥细胞接种到拟南芥的植株上，以便获得转基因拟南芥以及转基因表达分析。
总之，拟南芥的花浸渍转化方案具有较强的通用性，可以用于实现拟南芥的转基因技术。
此外，拟南芥的花浸渍转化方案分为三个步骤：花粉培养，植物体系建立和转基因表达系统的
构建。
与传统的转基因技术相比，拟南芥的花浸渍转化方案具有更快的获得转基因拟南芥的速度，同时也具有更高的成功率，可以为科研活动提供更高的效率和更好的效果。
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拟南芥转化
1农杆菌感受态细胞的制备
挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于5 ml含100 μg/ml利福平(Rifampicin)，50 μg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 μg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 μl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 μl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌GV3101
将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：
1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；
2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；
3) 液氮冷冻8 min；
4) 37℃水浴热激5 min；
5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；
6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；
7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；
8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；
9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化
在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5
天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
转化时将拟南芥的花序倒扣在盛有菌悬液的容器中，浸泡10-30秒，转化完毕后，将小花盆侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，12-24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，按照正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子
将已经转化的Tl代成熟种子收取后，37℃烘干后准备阳性植株的筛选。
由于表达载体带有除草剂抗性标记基因，所以用Basta(l:1(XX〕)进行阳性植株的筛选。
将Tl代种子在消毒之后均匀撒播在培养土的表面，罩上盖子，当种子出苗后3天，打开盖子，在幼苗生长到2礴片真叶后，喷洒Basta筛选阳性植株。
)
3拟南芥培养和转化
3.1 拟南芥培养
首先是拟南芥种子消毒，将待播拟南芥种子(每管100 μL) 分装于1.5 mLEppendorf 离心管中，每管加入1 mL 70%乙醇，振荡器上充分混匀，放置2 min，微型离心机上离心后，用 1 mL 枪头吸去乙醇，然后加入1 mL 10%NaClO，振荡器上充分混匀，放置15 min，期间每隔5 min 可以轻微振荡一次，可以提高消毒效果，离心后，弃上清，用无菌水冲洗5-6 次，并于超净台上吹干，即可播种。
将种子撒播于MS 固体培养基上，也可用45℃MS 固体培养基播种，方法是将种子和MS 固体培养基充分混匀，倾倒于预先铺一薄层MS 固体培养基平皿中，轻微晃动平皿，使种子均匀平铺在培养皿中。
平皿用封口膜封好后在4℃暗处理3 d。
置于拟南芥培养室培养( 培养条件：湿度60%；温度22℃；光周期16 h 光/8 h 暗；光照强度80－220 μmol m-2 sec-1) 培养一周左右，然后将其移栽至栽培介质(草炭土：蛭石：珍珠岩按5：4：1 的比例掺匀)，第一次移栽要用0.1%“花无缺”复合肥溶液浇灌渗透。
3.2 拟南芥转化
拟南芥转化采用Clough 等发明的活体蘸花法(Floral-dip)。
具体步骤如下：
1) 转化前菌体准备：
挑取平板上生长良好的阳性菌落，接种于20 mL LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基中，28℃，250 r/min 振荡培养过夜。
吸取2 mL 培养液，加入50 mL LB/ (Gen + Kan+ Rif) 液体培养基，28℃，250 r/min 振荡培养至浓度为OD600 = 0.5-0.8，然后4500 r/min 离心收集菌体，用20 ml 拟南芥转化Buffer (2.2 g/L MS 粉+ 5g/L 蔗糖+ 6-BA (1 mg/mL) +0.04%SILWET-77 (v/v)，pH 5.8；蒸馏水配制，现配现用。
) 悬浮。
2) 转化：
选取生长一个月左右、生长状况良好的植株，在转化前一周掐除顶端花序，使待转化植株产生更多的花蕾，在转化前一天浇足水。
将拟南芥花序浸入事先准备好的转化Buffer 中，并轻微晃动，约3－5 sec 取出，轻轻弹去多余的液体，用保鲜膜将整棵植株密封，暗培养16-24
h 后，揭去保鲜膜，给予正常光照和水分，直至种子成熟，收获。
3.3转基因植株抗生素筛选
将所收获种子消毒(条件同上) 后，播于MS/hyg 固体培养基上。
暗培养4℃冷处理3 d，转移移至拟南芥培养室培养，并给予正常光照和水分。
约两周后，将绿色抗性幼苗移栽至栽培介质中继续生长。
按单株收获转基因株系并挂牌标识，待种子成熟后继续筛选，直至得到纯合株系。