拟南芥转基因
拟南芥的遗传研究和基因突变
探究拟南芥在不同生长发育阶段和逆境条件下的代谢物变化规律， 揭示其代谢调控机制。
推动转化医学和精准农业发展
要点一
转化医学研究
利用拟南芥作为模式生物，研究人类 疾病的发病机制和药物作用靶点，为 转化医学提供理论支持。
要点二
精准农业应用
将拟南芥遗传研究成果应用于作物育 种和农业生产中，通过基因编辑、分 子标记辅助选择等技术手段，实现作 物精准育种和高效生产。同时，利用 拟南芥作为生物指示器，监测和评估 农业生态环境的健康状况。
拟南芥的遗传研究和基因
突变
汇报人：XX
2024-01-11
• 拟南芥概述 • 遗传研究方法与技术 • 基因突变类型与机制 • 拟南芥基因突变研究实例 • 遗传研究在农业领域应用 • 未来展望与挑战
01
拟南芥概述
生物学特性
形态特征
拟南芥是一种小型、多年生草本植物，具有典型的莲座叶丛和直立茎。其叶片呈长椭圆形，花朵为四瓣白色或淡紫色 ，果实为长角果。
且排水良好的环境中。
02Leabharlann 分布范围由于其适应性强，拟南芥现已广泛分布于全球各地，包括北美、南美、
非洲和大洋洲等地区。
03
生长条件
拟南芥对生长条件的要求并不严格，可以在多种土壤类型和温度条件下
生长。然而，为了获得最佳的生长效果，需要提供充足的光照和适中的
水分。
遗传背景与重要性
• 基因组特点：拟南芥的基因组相对较小且简单，约包含120Mbp的DNA序列 和大约25000个基因。这使得对其进行全基因组测序和分析相对容易。
研究植物在盐碱胁迫下 的生理生化反应和分子 机制，发掘耐盐碱相关 基因，通过遗传转化提 高作物的耐盐碱能力。
拟南芥植物基因功能研究
拟南芥植物基因功能研究拟南芥，是一种小型模式植物，也是植物学家和遗传学家研究植物的重要模型，由于其小、易培养和基因组小且功能多样，拟南芥被广泛应用于植物基因功能研究领域。
基因功能是指基因在生物体内的作用及其调控机制。
而拟南芥基因功能研究这个领域，对于理解生物学的基本规律、开拓新的研究方法和实现绿色农业发展等方面都具有重要作用。
一、拟南芥基因组研究的目的1.发现新基因同人类基因组一样，拟南芥基因组虽然只有25,000个基因，但包含了植物生命中各个关键环节中的基因，例如开花、果实发育、细胞分裂和形态构成等。
拟南芥也被视为是研究其他植物领域的垫脚石，拟南芥基因组研究的一个目的就是通过在其基因组中发现新基因，对于扩大人类对植物基因工程的认知具有重要意义。
2.揭示基因调控机制在拟南芥中，基因的调控是非常复杂的，包括转录和后转录调控。
这些调节机制的研究，能够让我们更进一步地了解到，不同的基因所在的生物体部分是如何相互作用的，那会使我们有机会研究这些交互可能会导致的不良病状。
3.寻找抗病基因病原体和虫害对植物的危害，一直是植物学家们所担心的一个问题，而找出植物的制药基因，能够从分子基础上开展对植物抵抗病原体的研究，也能够为解决粮食安全问题提供更多的资源。
二、拟南芥基因功能研究方法由于拟南芥基因组具有可塑性和许多实验工具，开展拟南芥的基因功能研究显得异常的简单。
目前，关于拟南芥功能的研究方法，主要包括以下几种：1. 整合遗传和基因组学方法先通过遗传学方法，确定目标基因，再进一步使用基因组学技术确立其在基因组上的位置。
这种方法的优点在于定位准确，可以将与给定特征相关的基因数量缩小到较小的范围。
2.基因敲除技术基因敲除是利用RNA 骨架扰动小分子介导的细胞自身保护机制，通过基因克隆进行敲除，破坏载体、导致细胞死亡的一种方法。
该方法将基因关掉，根据有没有出现问题来了解基因起了哪些作用。
3.遗传页面显微镜遗传页面显微镜用于观察拟南芥基因生成物的进化变化，以及基因功能的变化，为了更好地确定基因的发生方式和发生地点。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
6、GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
卡那培养基上筛选tubulin-GFP转基因幼苗
生长一个月左右的GFP转基因植株
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
Bars= 100 μm
CONFOCAL荧光显微镜观察GFP-TUBULIN 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
• 材料：野生型拟南芥种子WT、 GFP转基因拟南芥种子
• 试剂：
75％乙醇； 50％84消毒液； 无菌水； MS培养基；
。 MS+kan(卡那霉素）培养基 1ml 移液器
实验操作注意事项： • 严格无菌操作！ • 消毒过程动作要快！ • 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ • 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ • 操作时尽量避免说话和人员走动！ • 注意小组内的配合和小组间的协调！
种子消毒及播种实验流程 （超净工作台中完成所有步骤）
1. 将培ห้องสมุดไป่ตู้皿做好标记， 2. WT和GFP两种类型的种子已春化（ 置于4℃冰箱48h）（已
做）； 3. 用1 ml量程的移液器去掉EP管中的ddH2O，加入新的500 ul
ddH2O ，再加入500ul 84消毒液，混匀；颠倒数次，孵育6 min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 1 ml无菌ddH2O水，洗3遍后，去上清 5. 最后加入200 μl ddH2O 6. 用移液器吸取单颗种子，将种子点在培养基表面（每皿4-5 颗种子 尽量均匀）； 7. 封膜，正置平放于培养架上培养。
实验六、八
GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
2019-11-13
实验六 拟南芥种子消毒及无菌培养
实验目的
1.建立无菌实验操作的概念； 2.掌握植物（拟南芥）无菌培养的方法。
GFP报告基因
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥啊，这可是个挺有意思的事儿呢！咱就一步步来瞧瞧。
首先呢，你得有拟南芥，这就好比做饭得有食材呀。
得挑那些长得
健康、精神的拟南芥植株。
然后呢，你得想好要转进去啥基因，这就
跟你决定给菜加啥调料一样重要。
接下来就是关键步骤啦！得把你想要的基因给弄出来，这可不是随
随便便就能做到的哦。
就好像从一堆宝贝里精准地挑出你最想要的那
一个。
挑出来基因后，还得找个合适的载体，让这个基因能跟着载体一起
进入拟南芥里。
这载体就像是一辆小车子，载着基因去它该去的地方。
然后呢，就是把带着基因的载体和拟南芥凑到一块儿啦。
这可不是
简单地放一起就行，得用一些特别的方法，就好像要把钥匙插进锁孔里，得找对角度和力度。
等基因进去了，还得让拟南芥好好长一长，看看基因是不是真的转
进去了。
这就跟等菜做好了，尝尝味道对不对一样。
哎呀，你说这过程是不是挺复杂的？但这也是科学的魅力所在呀！
每一步都得小心翼翼，就跟走钢丝似的。
要是有一步出了错，那可能
就前功尽弃啦。
你想想，要是能成功地把想要的基因转到拟南芥里，那多有成就感啊！就好像你自己创造了一个小小的奇迹。
而且这转基因拟南芥用处可大啦！可以帮助我们研究基因的功能，可以让我们更好地了解植物的生长发育，还能为农业生产带来新的希望呢！
总之呢，转基因拟南芥虽然步骤多，过程复杂，但只要你有耐心，有细心，就一定能做好。
你说是不是呢？可别小瞧了这小小的拟南芥哦，它里面蕴含着大大的科学奥秘呢！。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选
内蒙古农业大学硕士学位论文MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选姓名：王晓娟申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：于卓;杨丽梅20070501１８ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选试验设定了７个卡那霉素浓度梯度，分别为：５０、１００、２００、３００、４００、５００１１１９／Ｌ。
由表ｌ可见，卡那霉素对试验材料的发芽率没有显著影响，而对幼苗白化率有显著影响，随着浓度的增大，幼苗白化率逐渐增高。
说明卡那霉素不影响种子萌发却能抑制芽的生长。
当浓度达到３００ｍｇ／Ｌ时，未转化基因的野生型拟楠芥种子３个处理全部白化，无一株成活的绿茁，而转基因Ｔｌ代种子仍有部分幼苗正常生长。
本试验采用的卡那霉素筛选浓度定为３００ｍｇ／Ｌ。
图２卡那霉素浓度从左至右分别为５０、２００，３００ｍｇ／Ｌ时对照Ｃｏｌｏｍｂｉａ筛选２０ｄ的表现Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｎｏｎ·ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ表５ａ００ｍｇ／Ｌ卡那霉素对ＴＩ代种子筛选结果Ｔａｂｌｅ５ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＴ５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ３００ｍｇ／Ｌ图３卡那霉素浓度３００ｍ∥Ｌ时Ｔｓ代转基因种子和未转化亲本筛选２０ｄ时的对比Ｆｉｇ３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＬｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｏｅｄｓａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓ∞ｌｅ，ｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ内蒙古农业大学硕士学位论文１９将试验中得到的Ｔｌ代８７株抗性苗编号移栽到苗钵中，在人工气候培养室培养。
待到收获时严格单株收获种子，即Ｔ２代种子。
继续用３００ｍｇ／Ｌ的卡那霉素进行筛选，直到抗性不再发生分离时，结束试验。
试验中，在Ｔ３代就已经有全部呈现抗性的材料出现，后又对其进行了两代筛选，确保抗性基因达到了纯合。
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拟南芥转基因
拟南芥是一种模式植物，多年来围绕拟南芥的相关研究很多，尤其是对于拟南芥转基因研究非常热门，相关的论文也有很多。
原因主要有以下几个方面：
1 拟南芥是一种模式植物，基因组小，克隆其基因比较简单。
2 种植方便，条件易得。
3 拟南芥是自花传粉植物，这样既很容易进行遗传分析。
4 方法简单，不同于传统的植物转基因，不需要植物组织培养阶段，对于实验操作的要求不是很高。
当前拟南芥转基因所使用的方法主要是农杆菌介导的转化（载体法），区别主要是转化的方法不同，有抽真空，花序浸染和喷雾法使用最为广泛。
农杆菌介导转化的基本流程
农杆菌（目标载体）液的制备→拟南芥种植→花期（侵染）→共培养→收种→验证
农杆菌制备
1)从—80℃冰箱中取出lml农杆菌。
2)LB培养基中添加50mg/L的卡那霉素(Kan)和100mg/L的利福平(Rif)。
3)把lml农杆菌加入到含有Kan和Rif抗生素的LB培养基中，28℃振荡10h。
4）拟南芥转基因浸润液采用的是1/2MS，加蔗糖50g/L, PH值调至5．7,。
然后在15p 压力下蒸汽灭菌15min，灭菌结束，冷却后保存于4°C，以待转基因使用。
转化
抽真空/花序浸染/喷雾法
其中抽真空法转化效率最高，但是步骤麻烦，而且要将拟南芥倒置浸染到菌液中，操作不方便。
喷雾法相比来说简便易行，而且进行重复浸染，可以提高转化效率。
验证
1.种子筛选，将收到的种子种植于含有筛选剂（卡那霉素/潮霉素等）的培养基上，筛选出抗性幼苗。
2.PCR, 提取拟南芥基因组，进行PCR扩增，核酸电泳观察有无目的基因。