GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察

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一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6(22)申请日 2020.06.29(71)申请人贵州省水稻研究所地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省农科院水稻研究所(72)发明人闫志强　王晓雪　邓茹月　朱诉讼　尹燕斌　夏忠敏　宫彦龙　王忠妮　(74)专利代理机构北京安信方达知识产权代理有限公司 11262代理人陈丹　张奎燕(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01G 7/00(2006.01)(54)发明名称一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法(57)摘要本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。

权利要求书1页说明书11页序列表6页附图11页CN 111896506 A 2020.11.06C N 111896506A1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

实验二荧光显微镜的基本使用方法

实验二荧光显微镜的基本使用方法荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。

它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。

很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。

比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。

然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。

他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。

这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。

因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。

本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。

要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

实验目的：1. 了解荧光显微镜的基本结构；2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。

实验内容：1.荧光显微镜的基本原理和结构荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。

不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。

因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。

绿色荧光蛋白GFP的显微观察及其在转基因研究中的应用

报告基因的特点

已被克隆和全序列已测定；表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；

其表达产物容易观察或能进行定量测定
常用的报告基因
基因名称 GUS 基因编码蛋白
β-D-glucuronidase（β-D葡萄糖苷酶）
检测方法
催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定
实验仪器：荧光显微镜
实验步骤：
1. 2. 3.
取部分转基因幼苗放入IAA溶液中处理5-10分钟。无IAA处理的作为对照。 PI 染色将植物根部浸泡在1XPI工作液中10秒左右。用水冲洗30秒。

4. 制片用擦镜纸擦载玻片滴一滴水用镊子取一棵幼苗，将根部在水中展开（可以将叶片切除）用镊子夹取盖玻片，从一侧轻轻盖上 5.显微镜观察放下载物台，将载玻片放上载物台，旋转20X物镜至光路，滤光片在明场位置（1）将载物台上升至离物镜很近处，不要碰到物镜寻找视野中模糊的根，下调载物台，聚焦移动载物台，寻找根尖转换至40X物镜，滤光片调至蓝光（3）或绿光（4 ），打开shutter，观察、拍照和保存实验结果。
3:绿色荧光蛋白--GFP

GFP最初从水母，jellyfish Aequorea victoria 中分离出在分子生物学和细胞学领域，GFP是广泛使用的报告基因
GFP

GFP蛋白含238 氨基酸残基，分子量29.6KDa Fluorescent protein (荧光蛋白 ): 在蓝-紫外光的激发下产生强的绿色荧光
普通生物学实验
GFP报告基因的显微观察及其在

拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定

拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【摘要】[Objective] In order to further study the function of MDH2 gene in response to cadmium stress in plant, the vector of Arabidopsis MDH2-GFP was built up and transgenic lines were constructed.[Method] The RNA of wild-type Arabidopsis was extracted and reverse transcribed into cDNA, the full-length MDH2 coding sequence was amplified by PCR. The amplified MDH2 gene and pXB94-GFP plasmid were digested and connected by double enzymes.The connected product was transformed into E.coli competent cells, then the true recombinant plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens competent cells and the positive single colony was identified by colony PCR, then it was transferred into wild-type Arabidopsis by the floral-dip method.Finally, the positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR identification.[Result]MDH2 gene was successfully cloned and the positive transgenic lines were obtained by selective medium withresistance.[Conclusion]The successful acquisition of MDH2-GFP transgenic lines laid the foundation for further research on the function of MDH2 gene.%[目的]以野生型拟南芥为材料构建MDH2基因GFP载体及GFP转基因植株, 研究MDH2基因在植物响应镉胁迫机制中的功能.[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA, 反转录成为cDNA, 并以cDNA为模板, 利用PCR扩增MDH2基因, 将扩增所获得MDH2基因和pXB94-GFP质粒双酶切后连接, 并转化进大肠杆菌感受态细胞中, 鉴定正确后再转入农杆菌感受态细胞中, 通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落.再通过浸花法转入野生型拟南芥中, 最后利用抗性筛选和PCR鉴定获得MDH2转基因阳性植株.[结果]成功克隆MDH2基因, 并构建了MDH2-GFP重组质粒, 抗性筛选获得了MDH2-GFP转基因植株.[结论]成功获得MDH2-GFP转基因植株, 为进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2019(047)002【总页数】3页(P96-98)【关键词】拟南芥;MDH2;载体;转基因植株【作者】王媛媛;韩洋洋;耿庆鎏;朱香豫;曹树青;樊婷婷【作者单位】合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009;合肥工业大学食品与生物工程学院, 安徽合肥 230009【正文语种】中文【中图分类】Q939.9土壤重金属污染已成为世界性的环境问题之一，其中重金属镉污染是对动植物具有高毒害性的污染物之一，过量的镉会对动植物细胞造成不可逆的损伤[1-4]。

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期：　２００５－１２－２０；　接受日期：　２００６－０３－０７基金项目：　科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研）　（２００３ＣＣＡ０１１００）＊　通讯作者　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１王晨１米华玲２周根余１杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院上海２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所上海２０００３２）摘要生物信息学分析表明，　模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４　０００多种蛋白质，　目前只分离得到１　０００多种，　其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。

本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。

我们克隆了该基因５＇端长１７８　ｂｐ的ＤＮＡ片段，　与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。

转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察，　ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。

实验结果表明，　ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。

本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。

关键词融合蛋白，　亚细胞定位，　转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ　Ｗａｎｇ１，　Ｃｈｅｎ　Ｗａｎｇ１，　Ｈｕａｌｉｎｇ　Ｍｉ２，　Ｇｅｎｙｕ　Ｚｈｏｕ１，　Ｚｈｏｎｇｎａｎ　Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ，　２０００３２）ＡｂｓｔｒａｃｔＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｈａｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ａｂｏｕｔ　４　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ；　ｈｏｗｅｖｅｒ，　ｏｎｌｙａｂｏｕｔ　１　０００　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｖａｌｉｄａｔｅｄ．　Ｔｈｕｓ，　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　１７８　ｂｐ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５＇ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＧＦＰ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　Ｏｎ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｐｌａｎｔｓ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ　ｔｈａｔ　Ａｔ５ｇ４８７９０　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ，　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器，　由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成，　其主要功能是进行光合作用，　另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）。

6、GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察

卡那培养基上筛选tubulin-GFP转基因幼苗
生长一个月左右的GFP转基因植株
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
Bars= 100 μm
CONFOCAL荧光显微镜观察GFP-TUBULIN 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
• 材料：野生型拟南芥种子WT、 GFP转基因拟南芥种子
• 试剂：
75％乙醇； 50％84消毒液；无菌水； MS培养基；
。 MS+kan(卡那霉素）培养基 1ml 移液器
实验操作注意事项： • 严格无菌操作！ • 消毒过程动作要快！ • 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净台！ • 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ • 操作时尽量避免说话和人员走动！ • 注意小组内的配合和小组间的协调！
种子消毒及播种实验流程（超净工作台中完成所有步骤）
1. 将培ห้องสมุดไป่ตู้皿做好标记， 2. WT和GFP两种类型的种子已春化（置于4℃冰箱48h）（已
做）； 3. 用1 ml量程的移液器去掉EP管中的ddH2O，加入新的500 ul
ddH2O ，再加入500ul 84消毒液，混匀；颠倒数次，孵育6 min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 1 ml无菌ddH2O水，洗3遍后，去上清 5. 最后加入200 μl ddH2O 6. 用移液器吸取单颗种子，将种子点在培养基表面（每皿4-5 颗种子尽量均匀）； 7. 封膜，正置平放于培养架上培养。
实验六、八
GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
2019-11-13
实验六拟南芥种子消毒及无菌培养
实验目的
1.建立无菌实验操作的概念； 2.掌握植物（拟南芥）无菌培养的方法。
GFP报告基因

拟南芥转基因实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。

2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。

3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。

转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。

本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。

实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。

将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。

将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析_院海英

［２］
长Ｇ但当时人们对ＧＦＰ的ｃＤＮＡ，ＦＰ的应用前景［３］还不甚了解．１９９４年，Ｃｈａｌｆｉｅ等首次在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的Ｇ开创ＦＰ，了Ｇ维多利亚水母的ＦＰ蛋白应用研究的先河．
［４］
连接酶，公ＩＰＴＧ、ＸａＫａＲａ（Ｊａａｎ）ａｌ等均购自Ｔ－ｇｐ司．公司产ＤＮＡ回收试剂盒为Ｐｒｏｍｅａ（Ａｍｅｒｉｃａ）ｇ品．分子量ｍ公司．ａｒｋｅｒ购自天根（ＴＩＡＮＧＥＮ）ＭＳ盐（为ＤＭｕｒａｓｈｉｅ＆ＳｋｏｏＧＭＥＤＩＵＭ）ｕｃｈｅｆａｇ公司产品．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅｃ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ）１．２实验方法１．２．１ＧＦＰ基因的克隆与鉴定扩增ＧＦＰ基因时，以质粒ｐ在５ＭＣＢ３０为模板，０μ Ｌ的反应体系中，约１加入质粒２μ ）Ｌ（００ｎ５μ Ｌ１０ ×ＥｘＴａｇｑ缓冲液，正向引物ＧｄＮＴＰ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，ＦＰＦ（５ ′ ＣＴＣＴＡ－－－Ｇ和反向引ＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ－３ ′）物ＧＦＰ５ ′ ＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧ－－Ｒ（－Ｇ各１μ 下划线部分分别为ＸＴＣＣＡＴＧ－３ ′）ｍｏｌ／Ｌ（ｂａⅠ ，和ＳａｌⅠ 酶切位点）１ＵＥｘＴａＤＮＡ聚合酶，ｑｄｄＨ２Ｏ补齐．ＰＣＲ反应程序为９４℃ ，２ｍｉｎ后，９４℃ ，，，４５ｓ５６℃ ４５ｓ７２℃ ２ｍｉｎ３０个循环后７２℃ 延伸割下１０ｍｉｎ．ＰＣＲ产物在１％的琼脂糖凝胶上检测，目的条带，利用凝胶回收试剂盒纯化后，将回收产物连接到载体ｐ将连接产物转化ＤＨ５ＭＤ１８－Ｔ上． α 、感受态细胞，在涂有ＩＰＴＧ（８ｍＸ０．１４ａｌ（－ｇｇ）、）ｍ／ｍＬ氨苄抗生素的Ｌ１００μ Ｂ平板上通过蓝ｇｇ挑取阳性克隆于Ｌ白斑筛选，Ｂ培养基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定，将鉴定正确的质粒交由北京六合华大基因科技股份公司测序，构建成ＭＤ１８ＧＦＰ．－Ｔ：ｐ：３５ＳＧ１．２．２ｐＦＰ过量表达载体的构建测序正确的质粒ｐ用ＸＧＦＰ，ｂａⅠ 和ＳａｌＭＤ１８－Ｔ： Ⅰ 酶切回，收Ｇ片段再将ＣＡＭＢＩＡ２３００ＦＰ３５ＳＣＳ载体－－Ｏｐ用同样的双酶切后回收质粒大片段．两回收产物经将连接产物经热激法转化ＴＮＡ连接酶连接后，４Ｄ挑取单克隆经过夜摇菌，提取质ＤＨ５ α 感受态细胞，粒，进行酶切鉴定，构建过量表达载体：３５Ｓ：ＧＦＰ．ｐ将该载体转化农杆菌ＧＶ用于遗传转化．３１０１，１．２．３小拟南芥和拟南芥的培养与转化２０１０年到５月３月底将小拟南芥的种子播撒在实验田里，底开始陆续开花，此时将构建好的ｐＧＦＰ载体３５Ｓ：采用农杆菌介导法转化小拟南芥，参照文献［进８］行．具体方法为：保存的转化ｐ３５Ｓ：ＧＦＰ载体的农杆菌菌液活化，扩繁到Ｏ用侵染液（Ｄ０，１０％蔗６００约２．悬浮糖，０．０２％ＳｉｌｗｅｔＬ７７，４０ｍ／Ｌ乙酰丁香酮）－ｇ菌体至Ｏ滴在正待开放的花蕾上，一周Ｄ８，６００约０．一次，共３次，获得了大量的Ｔ０代种子．拟南芥的室内培养参照文献［进行．在超净台６］上先用７然后用２０％的酒精洗涤种子１ｍｉｎ，０％漂

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GFP转基因拟南芥的培养及荧光观察
实验原理：
1.GFP报告基因
全称为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），简称GFP，20世纪60年代在水母中发现的发光蛋白。

由238氨基酸组成的单链多肽，在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，用于蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一种微管结合蛋白，可以根据拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞，下胚轴和根部细胞中微管骨架的分布情况来推断目的基因是否存在。

3.表达载体：
⏹植物表达载体的构建→导入农杆菌自我复制→浸染花粉转入拟南芥；
⏹卡那霉素抗性培养基筛选，
⏹卡那霉素:
抗生素
影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成,引起植株黄化死亡.
⏹卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作
用的。

转基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转化体就很容易从非转化体中筛选出来。

GFP转基因植株野生型植株GFP转基因植株转基因植株
1/2MS培养基1/2MS卡那抗性培养基
实验材料：
GFP转基因拟南芥种子及野生型种子；1/2MS培养基；1/2MS卡那抗性培养基；
75％乙醇；10％NaClO；无菌水。

实验步骤：
1.种子春化（加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）；
2.75％乙醇消毒1min（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
3.10％NaClO消毒10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；
4. 无菌水洗三遍，用牙签将种子点在培养基表面（每皿4-5颗种子尽量均
匀）；
5.封膜，做好标记，平放于培养架上培养。

实验结果：
黄化
正常
拟南芥下胚轴的叶绿体从数量和
正常黄化苗在叶肉细胞和保卫细胞中，转基因拟南芥观察到绿色荧光标记，但在野生型中未观测到该
少等长势不优良的现象，是因为野生型不存在卡那抗性基因，而转基因植株存在卡那抗性基因，所以可以将转基因植株在卡那抗性培养基中筛选出来；在转基因拟南芥中，荧光标记在不同位置亮度效果不同，我们认为可能是与不同位置微管分布情况和微管结合蛋白对不同位置的结合效果不同有关。

注意事项：
严格无菌操作.
消毒过程动作要快.
枪头不要重复使用，物品不要拿出超净台.
点种时每个位置尽量只点一颗子.
操作时尽量避免说话和人员走动.
注意小组内的配合和小组间的协调.
思考题：
1 .本实验用的了两种培养基，有何不同？主要作用是什么？
实验中分别用到了1/2MS培养基和1/2MS卡那抗性培养基。

MS培养基是一种常用的植物组织培养基；在1/2MS培养基中无机盐为MS培养基的一半。

但在1/2MS 卡那抗性培养基中添加了一种抗生素—卡那霉素。

卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通过卡那霉素抗性基因起作用的。