转基因荧光鱼
转基因鱼——生物及技术方面的若干问题
转基因鱼——生物及技术方面的若干问题
Kenjiro Ozaro;Koji lnoue;Yuko Wakamatsu;张林
【期刊名称】《动物学杂志》
【年(卷),期】1992(27)1
【摘 要】随着70年代基因工程的迅猛发展,人们可以得到真核细胞的基因,通过体外实验也积累了结构与功能方面的大量信息,然而基因存在并起作用于活体内,仅仅依靠体外实验显然是不足取的。到80年代早期,产生了一项革命性的技术,这就是将外源基因显微注射到受精卵,产生携带外源基因的动物品系,并追踪该基因在体内的功能。
【总页数】5页(P44-48)
【关键词】鱼;转基因鱼;生物技术
【作 者】Kenjiro Ozaro;Koji lnoue;Yuko Wakamatsu;张林
【作者单位】
【正文语种】中 文
【中图分类】Q959.4
【相关文献】
1.转基因鱼试验湖浮游生物群落DNA多态性与物种组成关系 [J], 李学梅;余育和;冯伟松;颜庆云;吴利;张翔
2.转基因鱼研究中的若干问题 [J], 蒋耀青
3.转基因鱼构建模式的研究Ⅱ．构建转基因鱼的几个影响因素 [J], 刘春巧;张永忠;等
4.中国科学院水生生物研究所构建出能标示肝脏全程发育的转基因鱼 [J],
5.转基因鱼试验湖浮游生物群落DNA指纹与理化因子的关系 [J], 李学梅;余育和;冯伟松;颜庆云;敖鸿毅
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斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mcherry转基因模型的构建
实验研究
基金项目:国家自然科学基金(Ｎｏ.８１６７０７０９)ꎻ福建省自然科学基金(Ｎｏ.２０１７Ｊ０１１４５)ꎻ中央高校基本科研业务费(Ｎｏ.２０７２０１７０１０４、２０７２０１８００４４) 作者简介:林春雨ꎬ女ꎬ研究方向:糖尿病药物筛选ꎬＥ－ｍａｉｌ:１７１１７４１１９３＠ｑｑ.ｃｏｍ 通信作者:李明玉ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ副教授ꎬ研究方向:糖尿病疾病机理和药物开发ꎬＴｅｌ:１８６５９２４２５５７ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｍｉｎｇｙｕ＠ｘｍｃ.ｅｄｕ.ｃｎ斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达ｍＣｈｅｒｒｙ转基因模型的构建林春雨１ꎬ２ꎬ郏建新２ꎬ康琪２ꎬ吴志强１ꎬ李明玉２(１.中国海洋大学海洋生命学院ꎬ山东青岛２６６００３ꎻ２.厦门大学药学院ꎬ福建厦门３６１１０２)摘要:目的 构建α细胞细胞核特异表达红色荧光蛋白的转基因鱼ꎬ为详细研究斑马鱼胰岛α细胞的功能和药物筛选奠定基础ꎮ方法 利用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ克隆、Ｉ－ＳｅｃＩ重组、显微注射等技术构建了斑马鱼α细胞细胞核表达红色荧光的稳定遗传转基因品系Ｔｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ)ꎮ结果 建立并筛选获得标记胰岛α细胞细胞核表达红色荧光的转基因斑马鱼ꎬ该品系能准确标记所有的斑马鱼胰岛α细胞ꎬ其细胞在共聚焦显微镜下清晰可见ꎬ细胞间轮廓分别ꎬ比已有的转基因品系的α细胞的分辨率有显著提高ꎮ结论 成功构建了新的胰岛α细胞细胞核红色荧光标记的转基因鱼ꎬ可用于后期在整体动物水平上研究胰岛α细胞的发育与功能及开展药物筛选ꎻ为进一步对胰岛α细胞的深入研究提供了一个便捷又直观的新型工具ꎮ关键词:斑马鱼ꎻ转基因ꎻ胰岛α细胞ꎻ胰高血糖素ꎻ荧光蛋白中图分类号:Ｒ９６５.１ 文献标识码:Ａ 文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０５－０２５６－００６ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０５.００２ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈｗｈｉｃｈｔａｒｇｅｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＣｈｅｒｒｙｉｎαｃｅｌｌｓｎｕｃｌｅｉＬＩＮＣｈｕｎｙｕ１ꎬ２ꎬＪＩＡＪｉａｎｘｉｎ２ꎬＫＡＮＧＱｉ２ꎬＷＵＺｈｉｑｉａｎｇ１ꎬＬＩＭｉｎｇｙｕ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭａｒｉｎｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎａꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６００３ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉａｍｅｎ３６１１０２ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈｗｈｉｃｈｔａｒｇｅｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＣｈｅｒｒｙｉｎαｃｅｌｌｓｎｕｃｌｅｉꎬｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃαｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓａｎｄｄｉａｂｅｔｅｓｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｕｓｉｎｇｚｅｂｒａｆｉｓｈａｓｍｏｄｅｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ＷｉｔｈｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＩｎ－ＦｕｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇꎬＩ－ＳｃｅＩｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓꎬａｎｄｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈ￣ｎｉｑｕｅｓꎬａｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈｌｉｎｅｎａｍｅｄＴｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ)ｗａｓｇｅｎｅｒａｔｅｄꎬｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍＣｈｅｒｒｙｆｌｕ￣ｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｉｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈαｃｅｌｌｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｓｔａｂｌｅｌｉｎｅｏｆＴｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ＢｍＣｈｅｒｒｙ)ꎬｗｈｉｃｈαｃｅｌｌｓｎｕｃｌｅｉｃｌｅａｒｌｙｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｍＣｈｅｒｒｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ.ＡｌｌｔｈｅｍＣｈｅｒｒｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｗｅｒｅｔｈｅｇｌｕｃａｇｏｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｃｅｌｌｓ.ＴｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍＣｈｅｒｒｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗａｓｈｉｇｈꎬａｎｄｉｎｄｉｖｉｄｕａｌαｃｅｌｌｗａｓｅａｓｙｔｏｃｏｕｎｔ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＡｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｚｅｂｒａｆｉｓｈｗｉｔｈαｃｅｌｌｓｎｕｃｌｅｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｆｍＣｈｅｒｒｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ.Ｉｔｃｏｕｌｄａｓｕｓｅｆｕｌｔｏｏｌｓｆｏｒｓｔｕｄｉｅｓｉｎｃｌｕｄｅα－ｃｅｌｌｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬα－ｃｅｌｌｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬａｎｄｅｖｅｎａｎｔｉ－ｄｉａｂｅｔｅｓｄｒｕｇｓｃｒｅｅｎｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＺｅｂｒａｆｉｓｈꎻＴｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓꎻＩｓｌｅｔαｃｅｌｌꎻＧｌｕｃａｇｏｎꎻＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ 糖尿病是一种复杂的代谢性紊乱疾病ꎬ主要表现为体内血糖调节失衡导致的高血糖症状ꎬ持续的高血糖导致的血管、心脏、眼睛、肾脏和神经受损等并发症[１－２]ꎮ体内血糖主要受α细胞分泌的胰高血糖素和β细胞分泌的胰岛素来共同调节ꎮ虽然１型和２型糖尿病的核心机制都是由于胰岛β细胞的破坏和功能不足导致胰岛素的绝对和相对缺乏[３－４]ꎮ但近年来研究发现ꎬ胰岛α细胞在血糖稳态调节和糖尿病发病机制中起重要的调控作用ꎬ这使有关α细胞研究越来越受到关注[５]ꎮ胰高血糖６５２药学研究ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ２０２０Ｖｏｌ.３９ꎬＮｏ.５素主要的功能是在禁食的状态下控制血糖水平ꎬ刺激肝糖产生为机体提供的葡萄糖ꎬ其浓度受到血糖水平的负性调控ꎬ若在血糖升高的情况下能够有效地抑制胰高血糖素的分泌或者阻断胰高血糖素受体信号通路ꎬ即可起到降低血糖的作用ꎬ因此针对其信号通路作为靶点也成为开发新型抗糖尿病药物的热点[６－７]ꎮ因为α细胞的功能和发育都与糖尿病的发生和发展息息相关ꎬ如能够在动物模型上实现对胰岛α细胞的定性、定量分析及对其活性功能进行示踪ꎬ将给α细胞的相关研究提供强有力的工具ꎮ作为一种新型的脊椎动物模式生物ꎬ斑马鱼具有众多优点ꎬ特别是可利用荧光蛋白对特定细胞实现可视化的活体示踪[８－９]ꎮ另外ꎬ斑马鱼的胰岛在解剖学、形态学上以及生理调控上都和哺乳动物非常相似[１０]ꎮ更重要的是ꎬ斑马鱼在胰岛α－细胞和β－细胞发育过程中关键的信号分子和信号通路都与哺乳动物基本一致ꎬ因此斑马鱼是进行糖尿病疾病机理及药物筛选的良好模式动物[１１－１３]ꎮ虽然目前ꎬ已经有胰岛α细胞表达的ＧＦＰ转基因鱼Ｔｇ(ｇｃｇａ:ＧＦＰ)[１４]ꎬ但由于其全细胞表达ＧＦＰꎬ在活体分析其细胞功能时ꎬ分辨率不高ꎬ容易造成数据的偏差ꎻ且其不能同其他表达ＧＦＰ的转基因鱼进行双荧光分析ꎬ造成了其局限性ꎮ因此ꎬ为了获得高分辨率和提供更多分析斑马鱼胰岛α细胞的工具ꎬ本文构建了胰岛α细胞细胞核特异表达ｍＣｈｅｒｒｙ的新型转基因斑马鱼Ｔｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ)ꎮ１ 实验材料１.１ 仪器 Ｅｐｓ２００电泳仪(Ｔａｎｏｎ公司)ꎻ超净台(香港力康生物医疗科技有限公司)ꎻ微波炉(西门子电器有限公司)ꎻ水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)ꎻ鱼卵培养箱(韶光市泰宏器械有限公司)ꎻ细菌培养箱(上海精宏实验设备有限公司)ꎻ电子天平(舜宇恒平仪器)ꎻＭ１６５ＦＣ体式荧光显微镜(莱卡公司)ꎻＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＡＩ正置荧光显微镜(蔡司公司)ꎻＳＰ８共聚焦显微镜(莱卡公司)ꎻ小型离心机(ＫｙｌｉｎＢｅｌｌ公司)ꎻＰＣＲ仪(德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎻＵＰＶ凝胶成像仪(上海复日科技有限公司)ꎮ１.２ 实验试剂 ＤＮＡ高保真聚合酶(北京全式金生物技术有限公司ꎬ批号:ＡＰ１３１－１１)ꎻ限制性核酸内切酶:Ａｇｅ－Ｉ、Ｋｐｎ－Ｉ(ＮＥＢ公司)ꎻＩｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(Ｔａｋａｒａ公司)ꎻ胶红(Ｇｅｌｓｔａｉｎꎬ上海翊圣生物科技有限公司)ꎻ胶回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司ꎬ批号:Ｂ５１５１０３－０１００]ꎻＤＮＡＭａｒｋｅｒ(Ｔａｒｋａｒａ公司)ꎻ多聚甲醛[ＰＦＡｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅ￣ｈｙｄｅꎬ生工生物工程(上海)股份有限公司ꎬ批号:Ｄ６０６ＢＡ０００３]ꎻ琼脂糖[生工生物工程(上海)股份有限公司ꎬ批号:Ａ５０１００４]ꎻ小鼠单克隆ａｎｔｉ－ｇｌｕｃａｇｏｎ抗体(Ｓｉｇｍａ公司ꎬ批号:ＭＡＢＮ２３８)ꎻＦＩＴＣ标记亲和纯化山羊抗小鼠ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)二抗(Ｊａｃｋｓｏｎ公司ꎬ批号:１１５－０９５－００３)ꎮ１.３ 实验动物 野生型斑马鱼(ＡＢ)ꎻＴｇ(ｇｃｇａ:ＧＦＰ)转基因斑马鱼ꎻＴｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ)转基因斑马鱼ꎮ条件及产卵方式按照以下实验方法进行ꎮ２ 实验方法２.１ 实验动物－斑马鱼的养殖 斑马鱼的饲养是按照标准的饲养方法:每天３次投喂颗粒饲料ꎬ早晚各喂养１次丰年虫卵ꎬ并给予适宜的光照(光照∶黑暗＝１４∶１０)和温度(２５℃)ꎬ并利用碱泵和盐泵调节适宜的ｐＨ(ｐＨ为７左右)和电导率(电导率为５００左右)进行培养ꎮ２.２ 重组质粒的构建 本实验使用Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ试剂盒(Ｃｌｏｎｔｅｃｈꎬ货号:６３８９１２)进行重组质粒ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍｃｈｅｒｒｙ的构建ꎮ首先ꎬ利用限制性核酸内切酶(Ａｇｅ－Ｉ和Ｋｐｎ－Ｉ)对实验室已有质粒(ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｅＧＦＰꎬ未发表)进行酶切ꎬ胶回收后获得含有斑马鱼胰高血糖素启动子的线性化载体ꎮ然后ꎬ设计引物Ｈ２ｂ－Ｆ１:５′－ＧＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣ￣ＣＧＧＴＡＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＴＣＴ－３和Ｈ２ｂ－Ｒ１:５′－ＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣ￣ＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＴＧ－３′ꎬ正向引物添加了Ａｇｅ－Ｉ酶切位点ꎬ反向引物添加了Ｋｐｎ－Ｉ酶切位点ꎮ利用这对引物ꎬ用高保真酶进行ＰＣＲ扩增的方法从实验室已有质粒ｐ－１.２Ｉｎｓ:Ｈ２Ｂｍｃｈｅｒｒｙ获得Ｈ２ｂｍｃｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段ꎬ扩增的条件为:９４℃３０ｓｅｃ、６０℃３０ｓｅｃ、７２℃９０ｓｅｃꎬ３５个循环ꎮ最后ꎬ将线性化载体与目的片段按一定比例混匀ꎬ加入２μＬＩｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅＰｒｅｍｉｘ并用水补至１０μＬꎬ５０℃孵育１５ｍｉｎ后取５μＬ加入５０μＬ感受态(ＤＨ５α)内做转化ꎬ菌落ＰＣＲ后挑取阳性单克隆ꎬ用生工质粒小提试剂盒(批号:Ｂ５１５１０３－０１００)抽提质粒ꎮ质粒进行测序并用ＥｃｏＲ－Ｉ和Ｋｐｎ－Ｉ进行酶切验证ꎮ经过比对后ꎬ质粒的测序结果和酶切片段大小与预期结果一致ꎬ因此判断该重组质粒构建完成ꎮ２.３ 显微注射及转基因品系的筛选 野生型斑马鱼(ＡＢ)按一雄两雌的比例提前一晚放至配鱼盒内并用隔板将雌雄分开ꎮ显微注射前拔出隔板ꎬ使其７５２药学研究ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ２０２０Ｖｏｌ.３９ꎬＮｏ.５自由交配产卵ꎮ先前抽提的质粒用生工ＳａｎＰｒｅｐ核酸纯化套件(批号:Ｂ５１５１０４－０１００)进行纯化ꎮ然后ꎬ按照Ｉ－ＳｃｅＩ(Ｒ０６９４ＳꎬＮＥＢ)０.２ｕｎｉｔｓμＬ－１ꎻＤＮＡ:５０ｎｇμＬ－１ꎻ１×ＮＥＢｂｕｆｆｅｒ２:０.５×的比例将重组质粒配制成显微注射体系ꎬ于１－细胞期注入斑马鱼胚胎的细胞质中ꎮ注射后的胚胎置于恒温培养箱孵育５ｄꎬ后经体视荧光显微镜下挑选胰岛处有红色荧光的个体(Ｆ０代)ꎮ３个月后将性成熟的Ｆ０代与ＡＢ系的斑马鱼进行杂交ꎬ然后进行荧光筛选ꎬ挑出能够稳定表达转基因特性的幼鱼(Ｆ１代)ꎬ待Ｆ１代性成熟后ꎬ便可进行后续实验ꎮ２.４ 斑马鱼幼鱼胰岛成像及免疫荧光染色 斑马鱼幼鱼胰岛成像:受精后５ｄ的转基因斑马鱼Ｔｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ)幼鱼在４℃条件下用４％多聚甲醛(ＰＦＡ)中固定过夜ꎬ然后将其排列于载玻片上并用盖玻片将幼鱼身体压扁ꎬ以便暴露出胰岛部分ꎮ本实验成像胰岛采用的是ＬｅｉｃａＳＰ８倒置共聚焦显微镜ꎬ所有照片均在６３×物镜下拍摄ꎮ后期处理软件为ＩｍａｇｅＪ和Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐꎮ免疫荧光染色:转基因斑马鱼Ｔｇ(－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ)幼鱼的免疫荧光染色参照已有的方法进行[１５]ꎮ一抗小鼠单克隆ａｎｔｉ－ｇｌｕｃａｇｏｎ抗体(批号:ＭＡＢＮ２３８ꎬＳｉｇｍａ公司)稀释比例为１∶１０００ꎬＦＩＴＣ标记亲和纯化山羊抗小鼠ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)二抗稀释比例为１∶５０００ꎮ３ 实验结果３.１ 转基因表达载体的构建 该转基因表达载体ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ的构建过程及结构见(见图１)ꎮ首先ꎬ利用限制性核酸内切酶Ａｇｅ－Ｉ和Ｋｐｎ－Ｉ对质粒ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｅＧＦＰ进行酶切ꎬ以除去Ｈ２ｂｅＧＦＰ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段获得含有胰高血糖素启动子的线性化载体ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａꎮ酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳可以看到大小分别为５７２８ｂｐ(ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ)和１３８０ｂｐ的两个条带ꎬ由于跑胶的原因ꎬ条带有略微上移(见图２Ａ)ꎮ与此同时ꎬ利用上述引物Ｈ２ｂ－Ｆ１和Ｈ２ｂ－Ｒ１ꎬ以质粒ｐ－１.２Ｉｎｓ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ为模板ꎬＰＣＲ扩增获得Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段ꎬＰＣＲ产物跑琼脂糖凝胶电泳后可以看到大小为１３５５ｂｐ单一的目的条带(见图２Ａ)ꎮ分别胶回收上述５７２８ｂｐ和１３５５ｂｐ目的条带后ꎬ利用Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ试剂盒对获得的Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段和ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ载体进行重组ꎬ并获得ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ质粒ꎮ获得的重组质粒经Ｋｐｎ－Ｉ和ＥｃｏＲ－Ｉ酶切和琼脂糖凝胶电泳ꎬ可见５９２２ｂｐ和１１２５ｂｐ的两条条带ꎬ与预期一致(见图２Ｂ)ꎮ最后我们通过测序再次验证了我们获得的ｐＩＢＳ－２.８ｇｃｇａ:Ｈ２ｂｍＣｈｅｒｒｙ质粒的正确性ꎬ因此我们成功构建了该载体(见图２Ｃ)ꎮ
转基因斑马鱼实验
转基因斑马鱼实验
转基因动物（transgenic
animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。 嵌合体动物（chimera mosaic
animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。
转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。
鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000
种。这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。
尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。有些种类如虹鳟鱼和鲤鱼的体积大，有助于器官或组织的操作、样品采集和简易外科程序的进行。有些种类如青鳉、剑尾鱼、斑马鱼和底鳉等，因体积小、世代时间短和实验室培养成本低，也作为人类疾病、脊椎动物发育、毒理学和遗传研究的动物模型，且被广泛应用。研究转基因动物的制备，首先要考虑用何种转基因受体细胞。选择合适的受体细胞和可行的基因导入途径，是该技术成功的前提。基因转移的受体细胞必须是全能细胞，全能细胞随着细胞分化、胚胎发育，可以把其中的基因组贮存的全部遗传信息扩大到生物体所有的细胞中。除此以外至少是多能细胞。满足转基因动物需要的受体细胞有以下几种。
台湾省培育出转基因鱼
台湾省培育出转基因鱼
于莲
【期刊名称】《畜牧兽医科技信息》
【年(卷),期】1997(000)010
【摘 要】台湾大学渔业科学研究所蔡怀桢教授等,应用生物技术不仅能让鱼变性,还能在饲料中添加含鱼类生长蛋白质基因的酵母,加快鱼的生长。还可用精于为媒介,将外来的生长蛋白质基因转殖到卵内,培育出一种快速生长的改良种。前一种方法只能让1代鱼长的快,而后一方法则是基因改良,而
【总页数】1页(P6-6)
【作 者】于莲
【作者单位】
【正文语种】中 文
【中图分类】S917
【相关文献】
1.转基因鱼构建模式的研究Ⅱ．构建转基因鱼的几个影响因素 [J], 刘春巧;张永忠;等
2.转基因鱼构建模式的研究 I．cMT—sGH全鱼基因鱼的构建与检测 [J], 刘春巧;曹梦芝;等
3.台湾省培育成转基因猪 [J], 陈立新
4.复旦大学医学院培育出转基因斑马鱼 [J], 复果
5.日科学家通过转基因技术培育出抗疟疾转基因蚊 [J], 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
转基因鱼 潜力无限
镬 ｜ ｊ
转基因鱼潜力无限
■文／《海洋与渔业》实习记者谢弘泓
玻璃鱼箱里游动着两种外表 颜色不同的唐鱼，一种是自然界
里的唐鱼，体色较暗淡；另一种
是转基因唐鱼，体呈亮红色，煞 是好看。这是记者最近在珠江水
产研究所生物技术室里看到的情
景。 珠江所副所长、研究员白俊 杰说，这些转基因唐鱼已培育到
第七代，已筛选到了可稳定遗传
的新品系。目前正在进行扩大繁 殖试验和转基因生物的安全性评 价，争取能早日作为观赏鱼投放
市场。 转基因是指利用生物技术，
从某种生物中提取所需要的基因，
将其导入另一种生物中，使之与 后者的基因进行重组，从而产生
特定的具有优良遗传性状的生物。
利用转基因技术可以改变动植物 性状，培育新品种。试想，若能
够借助转基因技术改良水产养殖
品种，往目标鱼类导入意愿所需 的功能基因，培育出高产、优质、
抗逆的鱼类新品系，并投入到产
业化中，那么带来的效益将不可
估量。 鱼类转基因 国际领先
据专家介绍，我国在鱼类转
基因技术研究方面一直走在国际 前列，世界历史上第一例转基因
鱼就在我国诞生。１９８３年，由中 国科学院水生生物研究所朱作言
院士领导的研究小组成功地获得
世界上首批转基因鱼，其后他们
将草鱼的生长激素基因注入鲤鱼 的受精卵，培育出一种带有草鱼
生长激素基因的转基因鲤鱼，并 培育出不育的三倍体转生长激素
基因鲤鱼——“吉鲤”。这一创举，
不仅奠定了我国转基因鱼研究技
术在世界上的地位，也使得国内 很多研究人员深受鼓励，投身其
中做进一步的科研。
一直以来，国内有不少水生
动物研究所在开展这方面的研究。
如黑龙江水产研究所研制出的转
大麻哈鱼生长激素基因鲤、中山
大学水生经济动物研究所暨广东 省水生经济动物繁殖重点实验室
与广东国家级罗非鱼良种场合作 研制出的转石斑鱼生长激素基因
太阳鱼、珠江水产研究所培育出
能稳定遗传到第七代的转红色荧 光蛋白基因的唐鱼等，都取得了 很好的成果。这些都说明，我国
荧光斑马鱼
- 1 - 荧光斑马鱼
荧光斑马鱼是科学家在荧光鱼中加入了可发光的基因，让鱼变成荧光鱼。在黑暗的夜晚，萤火虫自己发出幽绿色的光芒，来引诱鸟儿前来，人们称它为“夜明珠”，又叫“荧光鱼”。当它照在水面上时，波光粼粼，煞是好看。
这种鱼也有很多的用处。比如：它的体表呈半透明状，是制造人造昆虫和仿生物件不可缺少的材料。它可以做标本，可以做装饰品，还可以作为宠物饲养。因为它发出的光有各种颜色，白天也能发光，所以非常受欢迎。但是它必须得靠它自身的能量来发光，否则将无法生存下去。因此人们给它吃小颗粒鱼食或豆饼，然后一段时间，它就能把能量储存起来，这样它就可以不断地发光了。
萤火虫是一种受人喜爱的昆虫，在古代我国把萤火虫叫做“宵”。古时候没有电灯，人们便在夏天晚上到田野里捕捉萤火虫，拿回家中，点亮放在台灯上，那飞舞的萤火虫闪闪烁烁的，就像灿烂的星星，它们的光亮是夏夜的一道美丽的风景线。还有《诗经》中说“熠熠宵行，舒我王之问光”。意思是，漫漫长夜，看见我王的问侯灯火辉煌，如同白昼。由此可知，在古代，人们在夏夜捕捉萤火虫是为了报告王命。
《后汉书·蔡邕传》记载：“臣闻郊甸之内，夜则继以明烛，堂陛之间，夜则继以荧煌，虽有见烛，无闻见荧。”指夜幕降临后，堂陛之间以荧光照明。
8： 30～11： 00，晚饭后1～2小时。注意事项：第二步：集中孩子们的注意力，安排大家分组讨论、汇总资料。 1： 50～2： 00， - 2 - 讨论萤火虫的构造。萤火虫是怎么发光的呢？幼儿回答：萤火虫有腹部发光器、胸部发光器、侧腹发光器三部分。讨论问题： 1、萤火虫的腹部发光器有几个？它们各有什么用途？ 2、萤火虫的胸部发光器有几个？它们各有什么用途？ 3、萤火虫的侧腹发光器有几个？它们各有什么用途？ 2： 10～2： 40，幼儿画萤火虫的简笔画。 2： 40～3： 00，幼儿画萤火虫的半立体画。
2： 20～3： 00，欣赏教师带来的各种荧光鱼。 3： 00～4： 00，欣赏与萤火虫相关的文章。 4： 00～4： 10，写观察日记。
鱼类转基因实验报告
鱼类转基因实验报告
摘要
本实验旨在通过转基因技术改变鱼类的基因组，以探索其在生长和抗病能力方面的潜力。通过将特定基因引入鱼类的基因组中，我们成功地改变了它们的表型。实验结果表明，转基因鱼类在生长速度和抗病能力方面相比常规鱼类具有明显优势。然而，转基因技术的使用也引发了一些伦理和环境问题，需要更多的研究和讨论来解决。
引言
转基因技术是一种人工干预生物基因组的方法，通过将外源基因导入目标生物体的基因组中来改变其性状。应用广泛的转基因技术已经在农作物中取得了一系列的成功，如提高产量、抗虫性和耐逆性等。然而，在动物领域，转基因技术的应用相对较少。本实验旨在探索鱼类转基因技术的潜力，特别是在生长和抗病能力方面。
材料与方法
动物材料
实验中使用的是普通鲤鱼（Cyprinus carpio）作为实验对象。鲤鱼是一种常见的淡水鱼类，生长周期短且易于饲养。
转基因技术
我们选择了生长激素基因作为外源基因，通过基因工程技术将其引入鱼类基因组中。具体操作如下：
1. 提取鲤鱼的胚胎细胞，并将其进行培养。
2. 利用质粒转染技术，将生长激素基因导入鲤鱼细胞。 3. 培养经转基因的细胞，并筛选出表达生长激素基因的细胞株。
4. 通过体内转染技术，将经转基因的细胞注入受精卵中。
5. 培育转基因鲤鱼。
实验组设计
将转基因鲤鱼和常规鲤鱼放置在不同的鱼缸中，提供相同的饲料和环境条件。观察和记录它们的生长速度和抗病能力。
结果与讨论
经过一段时间的实验观察和数据统计，我们得出了以下结果：
1. 转基因鲤鱼在生长速度方面表现出了明显的优势。与常规鱼类相比，转基因鲤鱼的体重增长速度更快。这可能是由于转基因技术引入的生长激素基因促进了其细胞分裂和增殖的能力。
2. 转基因鲤鱼在抗病能力方面也表现出了显著的改善。在接种疾病原菌后，转基因鲤鱼的存活率明显高于常规鲤鱼。这可能是由于转基因技术引入的基因增强了鱼类的免疫系统。
3. 转基因技术也引发了一些伦理和环境问题。一方面，长时间高强度的生长可能会对鱼类的身体健康和福利产生负面影响；另一方面，转基因鱼类的逃逸可能会对自然鱼群和生态系统产生潜在威胁。因此，我们需要更多的研究和探讨来解决这些问题。
转基因鱼
什么是转基因鱼
转基因鱼是生物技术的成果。生物技术是一项以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理生产生物制品和创造新物种的综合性科学技术，又称生物工程。主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个领域。
我国成功的鱼类基因转移
转基因鱼的意义
鱼类是人类食物消费中比普通家畜更为偏好的重要蛋白质来源发展和完善鱼类基因转移技术,将有用的鱼类基因,如生长激素、干扰素、抗寒性、抗病性及抗盐性等基因导入鱼卵可改良鱼类性状,为培育高产、优质及抗逆的养殖鱼类新品系提供新途径。转基因鱼研究虽稍晚于哺乳类但由于鱼类基因工程育种本身所具有的潜在经济价值和作为转基因研究所具有的有利条件而取得重大进展,转基因鱼是目前国内外获得最成功的转基因动物之一80年代后期开始,国际上掀起了鱼类基因转移研究的高潮,20多个实验室以不同的鱼为对象,相继投入这一领域的研究,取得了不同的进展。转基因鱼首先产生于中国,之后英国、法国、加拿大、爱尔兰、德国、美国也先后进行了转基因鱼的研究,转基因鱼研究已成为鱼类品种改良的前沿生物技术。
转基因鱼的构建及检测
利用鱼类受精卵系统做基因转移比哺乳类动物的相应系统有无可比拟的优越性。鱼类怀卵量多,易获得大量基因转移受体;在室温下干净的水中即可完成胚胎体外发育,操作方便,易于培养、管理和观察;鱼类发育至幼鱼的时间短,可以用改变环境温度控制其发育速度,是研究发育过程中基因调控与表达等生物学问题的理想材料。另外鱼类是脊椎动物系统发育较原始的类群,不同种属,甚至在不同科之间,容易亲和协调,因此鱼类在接受外源基因和外源基因表达方面较高等的种类更有利转基因鱼的构建及检测转基因鱼研究首先是构建外源基因。转基因鱼研究早期使用mMT、SV40和RSV等表达效率低而且存在安全性顾虑的外源基因启动子,及人、牛、羊和鼠的生长激素(GH)基因构建目的基因,之后克隆了鱼类自身的高效启动子和鱼类生长激素、抗冻蛋白基因(AFP)、珠蛋白(Globin)基因,并进行了全鱼基因的转基因鱼研究。GH基因和AFP基因为鱼类转基因研究的两个热点基因。转基因鱼中基因导入受体卵中的方法较多,有显微注射法、电穿孔法、精子载体法、基因枪法,其中最常用的是显微注射法。转基因鱼的检测依据基因整合及基因表达采用不同的检测方法,运用斑点杂交和PCR法可检测出含有外源基因的受体鱼;采用Southern杂交作进一步检测来确定外源基因是否真正整合入受体鱼基因组;Northern杂交或RT-PCR可用来检测外源基因的转录;采用组织提取液酶活性或标记特异性抗体与组织提取液或血清等进行免疫学反应可推断外源基因的表达水平。
转基因鱼的现状和应用前景
转基因鱼的现状和应用前景
姓名：周宇宁 班级：食品131 学号：1310305113
摘 要：转基因鱼是20世纪人类最重要的成就之一,对于鱼类育种具有重要意义,但一直以来转基因鱼的产业化进程并不顺利,究其根本原因在于人们对其安全性顾虑重重。因此,本文分别从食用和生态两个角度对转基因鱼的安全性进行了综述,分析了其可能存在的安全隐患以及近年来围绕此问题开展的相关研究。最后,对转基因鱼下一步的应用前景进行了展望。
关键词：转基因鱼；转基因食品；安全检测
2015年11月19日，在确认其食用安全性五年、环境安全性三年之后，美国食物药品管理局（FDA）批准了水恩公司（AquaBounty）的转基因三文鱼品牌“AquAdvantage”上市，从而使之成为首个获批的供食用转基因动物。这种三文鱼的主要特点是生长迅速，仅需18个月便能长成——而常规三文鱼需要至少三年。这件事使人们关注起了转基因鱼这个新事物。1983年，中国科学院水生生物研究所在世界上率先开展鱼类转基因研究，我国也一直走在鱼类转基因的前列。
1.转基因鱼的定义
转基因鱼是首先从鱼体中鉴定出与生长、品质、抗病和抗逆等性状相关的基因,
并将此类基因设计加工, 然后转移到拟进行遗传改良的受体鱼染色体内, 从而培育出优良品种[1]。转基因鱼研究大多基于提高鱼类生长速度和抗病、抗逆能力, 培育新品种, 开展环境监测以及医学研究等目的。目前已有金鱼、鲫鱼、鲤鱼、泥鳅、鳟鱼、大马哈鱼、鲶鱼、罗非鱼、鲂、鲑鱼等多种淡水鱼和海水鱼用于转基因研究,
多种哺乳类、鸟类的基因亦被成功整合到鱼类的基因组中[2]。
转基因鱼育种不仅突破了物种间的生殖隔离,拓展了遗传资源利用范围, 而且还减少了育种世代、提高了育种效率。另外, 对转基因鱼的研究可大大提高鱼类的生长速度和抗逆能力, 使之更易应对恶劣的环境条件, 对扩大优质鱼种养殖范围提供了新的途径, 产生相当可观的经济效益。同时, 利用转基因鱼可快速、 直观地评价环境中污染物的内分泌干扰作用, 对于污染物的防治和监控具有重要的应用和理论研究价值。另外, 利用转基因鱼生产生物活性物质也是未来的开发热点, 以改变当前医药需求无法得到满足的现状。
转基因动物实例
转基因动物实例
1，透明的金鱼
鱼有许多不同的类型和种类，每一种鱼可能都有其独特之处，但只有极少数的鱼，通过自然进化，可以看到它们透明的形态。在我们的印象中，金鱼是一种美丽而又神秘的生物，它拥有迷人的外形，鲜艳的色彩以及令人着迷的身体结构。因此，人们对其进行着各种研究。金鱼就是其中之一。但这种鱼并没有将金鱼种类列入其中。为此，日本科学家想到了制作金鱼透视的方法，并取得了成功。日本三重大学和名古屋大学制作了这些透明金鱼。肉眼观察，由于鳞片和皮肤没有色素，可以直接看到金鱼的心脏等器官。
2.环保猪
从外在的角度看，猪为地球人类所做的肉类是吃得最多的，显得过于平凡，根本无法造成危害。但事实上，猪并不是一个简单的生物个体，它也有一些特殊之处：例如，它们可以利用粪便来进行发电；而且它们还能通过排泄粪便中的某些物质来获得能量。但是这种认识并不正确，特别是由于其体内存在一种潜在的危险化学物质——磷。这种反应是猪消化食物后自然产生的，在排便后释放到世界各地。
如果植物中的营养成分过多，就会成为污染物，多余的就可能流入溪流和湖泊。而如果这些营养物质被动物吸收后再用来喂养牲畜，那么就有可能导致严重的后果。目前，人类面临着这样一个难题：如何让动物吃到更多营养丰富的食物呢？因此，科学家们不得不为这一问题而努力，而环保猪正是为此而培养起来的。经过特殊培育后，环保猪排粪含磷量明显降低。
3，转基因荧光鱼
转基因荧光鱼的产生并非偶然。科学家们希望鱼能发出特殊色彩的光，并从种类角度出发，利用水母中提取的荧光蛋白使斑马鱼发光，于是转基因荧光鱼应运而生。按照计划，它们的确闪烁着许多色彩。比如蓝色、红色和黄色等等。这些颜色看起来都非常可爱，而且很有创意，让人爱不释手。这也是为什么很多人愿意购买一些颜色鲜艳的鱼的原因所在。但是，这样的人类造物不适合在自然环境下生存，鲜艳的色彩使其更容易被掠食者杀死。因为，这些东西是买给宠物的。