绿色荧光蛋白GFP的显微观察及其在转基因研究中的应用
绿色荧光蛋白的研究进展
中国畜牧兽医２００８年第３５卷第８期生理生化·２９·
绿色荧光蛋白的研究进展
杨慧敏１。李文刚２，吴高锋１．魏娟１。王鑫１
（１．河南农业大学，郑州４５０００２；２．郑州牧专，郑州４５００１Ｉ）
摘要：绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）作为一种新型、方便的报告基因，具有很多理想特性，它灵敏度高，能在细胞内稳定表达，不
需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等，已成为目前最优良的标记基因之一。其显著特点
是在不加外源物质的情况下，受紫外光激发，就能在原核和真核活细胞中发出绿色荧光，而且荧光性质稳定，对细胞无毒，其
特有的生化性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。
关键词：绿色荧光蛋白；荧光强度；转基因
中图分类号：Ｑ５１６文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—７２３６（２００８）０８一００２９一０３
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，
ＧＦＰ）是２０世纪９０年代中期发展起来的一种全新
的报告分子。同以往常用的报告基因ＬａｃＺ、ＣＡＴ、
荧光素酶基因以及其他抗生素基因相比，ＧＦＰ不需
要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污
染，而且可以在ＵＶ或蓝光激发下直接观察。因
此，其被广泛应用于分子生物学研究。Ｒａｓｈｅｒ等
（１９９２）首次克隆得到多管水母的ＧＦＰ基因。ＧＦＰ
基因由３个外显子组成，分别编码６９、９８和７１个氨
基酸。Ｃｈａｌｆｉｅ等（１９９４）首先在大肠杆菌细胞中表
达了ＧＦＰ，开创了ＧＦＰ应用研究的先河，之后很快
发现ＧＦＰ能在多种异源细胞内表达，因此在多个学
科领域引起了广泛的关注，被誉为“活细胞探针”。
野生型ＧＦＰ荧光强度较低，受温度影响大，其应用
受到了限制。Ｈｅｉｍ等（１９９５）采用定点突变的方式，
把第６５位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸，荧光强度提
高了４－－．６倍。后来的研究中用到的ＧＦＰ突变体都
是在此基础上通过改变若干碱基而得到的。增强型
绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白
亚细胞定位中的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白
亚细胞定位是研究细胞内蛋白质在细胞中的定位和运输过程的重要领域。绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）和红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，简称RFP）是经常被使用的一对标记蛋白，它们在细胞内可以通过荧光显微镜观察到不同的荧光信号，从而帮助研究者揭示蛋白质的定位和运输。
GFP最早由日本科学家下村脩在1962年研究海葵(Aequorea
victoria)中的荧光蛋白而获得，并于1992年被将其克隆到其他生物系统。GFP的一个重要特点是它在没有外源激发剂的情况下就可以自行发出荧光。GFP可以通过其自身的三肽序列引导，与细胞内的目标蛋白连接在一起。当GFP连接在目标蛋白后，细胞内目标蛋白的表达和定位就可以通过荧光显微镜直接观察到。基于GFP的定位系统被广泛应用于其他蛋白质的研究中。 RFP也是一种荧光蛋白，其最早是从珊瑚Disocora unifora中分离得到的。RFP和GFP有相似的结构，但它们有不同的激发和发射波长。RFP发射波长较长，通常在560-620nm之间。RFP也可以被编码到目标蛋白上并通过荧光显微镜观察到。
GFP和RFP在细胞内的应用主要有两个方面：1.追踪蛋白质的定位和运输；2.研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。
在细胞定位和运输方面，通过将GFP或RFP连接到目标蛋白上，可以观察到这些蛋白质在细胞中的分布情况。比如，可以通过将GFP连接到细胞器膜上的蛋白质上，来观察这些细胞器在细胞中的定位和运输过程。通过追踪GFP或RFP的荧光信号，我们可以了解蛋白质在细胞内的运输速度、路径以及转运机制。
此外，GFP和RFP还可以被用来研究蛋白质的相互作用和拓扑结构。通过将GFP和RFP连接在两个相互作用的蛋白质上，可以根据不同的荧光信号来观察这两个蛋白质的相互作用情况。另外，通过将GFP和RFP连接在目标蛋白的不同区域上，可以研究蛋白质的拓扑结构，比如膜蛋白的跨膜结构等。 不仅如此，通过对GFP和RFP进行改造，还可以实现更多的应用。比如，可以通过进行点突变来调节GFP和RFP的荧光强度和光稳定性。还可以利用GFP和RFP相近的基因组结构，进行基因工程的应用，比如将GFP或RFP基因与目标蛋白基因构成融合基因。这种基因工程的方法，通过对转基因生物进行观察，可以更直接地了解目标蛋白在生物体内的定位和功能。
绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用
＠围 技学一赫占 绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用 卫吉芸 ，刘桂林 （山西农业大学动物科技学院，山西太谷０３０８０１） 摘要：本文阐述了绿色荧光蛋白￣Ｖｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）的结构、性质、特点和在生物技术研究中的应用等，以及野生ＧＦＰ 存在的问题和改进ＧＦＰ的应用前景．． 关键词：ＧＦＰ；特点；应用；改进 中图分类号：Ｑ８１ ６ 文献标识码：Ｃ 文章编号：１ ００１—０７６９（２０１ １）０３～０１ Ｏ０—２ 绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是一种功能独 特的天然荧光蛋白质，这种蛋白质最早是从一种生活在北太平 洋寒冷水域的水母体内发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色 波长范围的光线激发下会发ｍ绿色荧光。由于具有自发荧光等 特性，可以在科研中用其观察肉眼无法看到的过程，在生物学领 域得到广泛应用。 ｌ ＧＦＰ的结构和荧光性质 ＧＦＰ分子量约为２７ Ｘ １０ 。是由２３８个氨基酸残基组成的单 链多肽『ｌ１。１ ９６２年日裔美籍科学家下村修首次从水母中分离出 ＧＦＰ，并发现其可以在紫外线照射下发出绿光；１９９４年美国科学 家马丁一查尔菲经过研究确认ＧＦＰ町作为一一种通用的基因标 志，而应用于各种有机体中；随后华裔美籍化学家钱学健发展了 不同颜色的ＧＦＰ突变体，即除绿色以外，还可以用其他颜色荧光 蛋白标示不同的蛋白质和细胞。由此，下村修、马丁一查尔菲和 钱永健获得了２００８年度诺贝尔化学奖［２１。 ＧＦＰ属于五大类报告基因之～，是虚用最多的发光蛋白。 ＧＦＰ用３９５ ｎｎｌ的紫外光和４７５ ｎｎｌ的蓝光激发，可在５０８ｎｍ处 自行发出绿色荧光。它之所以能够发光，是因其氨基酸序列中第 ６５一一６７个氨基酸（ｓｅｒ＿Ｔｙｒ－Ｇｌｙ）残基叮自发地形成一种荧光发色 团，是主要发光的部位１３１。ＧＦＰ发光性质稳定，对热、碱性ｐＨ、有 机溶剂及大多数蛋白酶均可耐受，这主要是由其一级结构决定 的。在荧光显微镜强光照射下，ＧＦＰ抗光漂白能力较强，特别在 收稿日期：２０１ １－０２－２５． 基金项目：山西省科技攻关项目（２【Ｊｆ）７ｆ）３１０５６）；山西省自然科学基金项目 国家自然科学基金项目（３０７７１５８１ 省归国留学人员资助项目。 作者简介：卫吉芸（１９８６．３．），女，在读硕士研究生：主要研究方向：动物 生物化学与分子生物学；邮箱：ｗｅｉｊｉｖａｎ．３１ １６２７３＠１６３ ｃｏｎｌ。 ”通信作者：刘桂林（１９５３ ２～），女，教授．主要研究方向：动物分子生物化 学与基因工程；邮箱： ＠！堡： 。 ４５０ ４９０ ｎｍ蓝光波长下更稳定，但在３４０一一３９０ ｎｍ内仍会发生 光漂白现象。ＧＦＰ的理他Ｉ生质稳定，对于多种变性因素具有很强 的抗性。 ２ ＧＦＰ的应用特点 ２１世纪，ＧＦＰ作为一种新的报告基因Ｔ具得到了迅速发展， 与其他报告基因相比，ＧＦＰ具有许多显著的特点：（１）无需损伤细 胞即可研究细胞内事件，且无毒作用 ；（２肿属不依耪胜，在原核、 真核细胞中都可表达为有活性的ＧＦＰ，具有活体、原位、实时表 达的特点 ；（３）结合倒置荧光显微镜动态观察目的基因在活细胞 中的表达更直观。分辨率高；（４）检测方便，只需要紫外光或蓝色 激发；灵敏度高、速度快 ；（５）相对较小的分子使之易于和单体蛋 白融合；ｌ６）可产生不同颜色的荧光，适应于不同研究的需要，易 得到突变体；（７）ｊ勾象稳定，无光漂白作用，荧光高度稳定，无需添 加底物或辅助因子等协助指示；（８）易于构建载体，可进行活细胞 定时定位观察，操作简便。 ３ ＧＦＰ在生物技术中研究的应用 ＧＦＰ作为报道基因，被广泛应用于转基因动物、融合标记、 基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化以及病原菌侵 入活细胞示踪等领域。 ３．１在基因工程中作为筛选标记 利用ＤＮＡ重组技术，将目的基因与ＧＦＰ基因构成融合基因， 转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察。由于ＧＦＰ分子量小，在活细胞内可溶 且对细胞毒性较小，应用得最多和最成功的是ＧＦＰ与宿主蛋白构 成融合子来监测宿主蛋白的定位和最后归宿，既有荧光又有宿主 蛋白原有的正常功能和定位的融合蛋白效果最佳 。利用ＧＦＰ的 这一特｝生已经加深了我们对细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和 信号转导等一些过程的了解，可作为基因治疗检测指标。 — Ｌ ‘ — －— ｔ— －． ．址． ． — ． —址“．址．Ｓ屯．轧Ｌ．Ｓ屯．Ｓ屯龇．Ｓ屯．￥屯． ． ．址ｊ屯．ｓ止．Ｓ ．Ｓ ． Ｌ．Ｓ屯 ．址．Ｓ屯．Ｓｌ上．Ｓ屯． Ｓ屯． Ｌ．址． １８．４％、２３２％，饲料系数分别降低了０．２４、０．２８、０．２９，效果显著。 目前，’饲料添加剂是各国化Ｔ领域的发展重点和新的经济 ４ ＳＤＡ的开发前景 ＳＤＡ的用途广泛，是替代山梨酸类、丙酸盐类防霉剂的理想 产品。ＳＤＡ作为一种优良的饲料防霉剂，具有价格低、用量小、原 料来源充足、能有效提高饲料营养价值等优点，完全适合在饲料 领域上的广泛应用。与此同时，加大ＳＤＡ与其它品种的复合剂型 防霉保鲜、抗氧化产品的膻用研究与开发，生产出效果更好、成本 更低的ＳＤＡ复合型防霉剂将成为今后研究开发 作的重点 第３１卷第３期总１ ７４期 增长点，世界饲料添加剂生产规模年均增长率在７％以上。２００９ 年，我国饲料总产量约１．５亿ｔ，其中配合饲料占一半以上，位居 世界第二，按０．１％添加ＳＤＡ则需要其总量约７万ｔ，而我闰日 前ＳＤＡ的产能远低于此，随着人们对ＳＤＡ特性及优点认识程度 的深入，ＳＤＡ作为高效的饲料防霉剂和优质的畜牧水产饲料添 加剂将具有广阔的发展前景 参考文献：（３７篇，略）
GFP在生命科学中的应用
绿色荧光蛋白（GFP）在生命科学中的应用
生命科学学院2011级 2011012911 姜 悦
绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母体内的一种发光蛋白，最早是从华盛顿维多利亚水母体内克隆得到的。GFP本身具有发光功能的荧光基团，无需特殊的辅助因子或其他蛋白的参与。在近几年的生命科学研究中，GFP已经成为跟踪活组织或活细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，这一方法日益成熟，成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。GFP在组织中表达产生内在的荧光，从而可以标记一些正常的细胞学过程，再借助一些高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控这些动态过程。
一、GFP基因作为报告基因在生命科学中的应用
GFP基因是一种标志基因，带有该基因的物种会发生荧光反应。GFP基因往往与其他物种的功能基因一起植入实验物种的细胞，转基因得到的新物种如果出现荧光反应，则与GFP基因同时植入的其他物种的基因也应该存在于转基因物种的细胞内。《海洋科学》2011年第35卷第9期报道的《杜氏盐藻叶绿体ATP合酶α亚单位基因启动子的克隆及初步功能分析》（谷辉辉，冯书营，潘卫东，李杰，薛乐勋）中就利用GFP基因作为一种报告基因。
目前, 虽然已经利用盐藻的核转化系统表达了一些外源基因，但是外源基因在细胞核转化时容易发生基因沉默、表达量低等现象，为此，研究者进行了转化盐藻叶绿体而非转化细胞核的尝试。研究者采用DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、SmaI和StuI六种内切酶消化杜氏盐藻叶绿体基因组DNA，与相应DNA接头连接, 构建成无载体连接的盐藻叶绿体GenomeWalker DNA文库。利用长距离PCR技术从该文库中克隆得到ATP合酶α亚单位基因上游序列1347bp。启动子特征分析显示该序列具有一般启动子的保守序列特征，根据这些特征设计引物，扩增4个5′端系列缺失的启动子片段，并用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建启动子5′端系列缺失重组质粒，以期鉴定不同启动子片段驱动报告基因转录的活性。基因枪转化结果显示，启动子长度约1000bp的重组载体转化盐藻后，其转化株中有黄绿色的盐藻细胞出现。说明克隆的序列具有启动子活性，能驱动绿色荧光蛋白基因在杜氏盐藻中有效表达，为建立盐藻叶绿体转化系统奠定了工作基础。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
1 绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达
摘 要
绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆 表达
1. 前言
1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）
绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物
发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构
GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。 长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用
GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。其上有所用酶的酶切 2 位点。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一种自然存在于海洋水母Aequorea victoria中的荧光蛋白，其拥有强烈的绿色荧光。由于其广泛应用于细胞生物学和生物化学领域，GFP已经成为研究生物过程和信号传递的强有力工具。
GFP的结构由238个氨基酸组成，具有一个单独的蛋白质区域，称为圆柱螺旋(Beta-can)。GFP基因含有GFP编码序列，该序列通过表达可以产生GFP蛋白质。GFP的荧光性质是由三个氨基酸残基组成的染色体枢纽部分决定的，即丝氨酸(Tyr66)、谷氨酸(Pro68)和脯氨酸(Ala80)。
在GFP的自然状态下，并不发出荧光。但当该基因被转录和翻译成蛋白质之后，在有氧条件下，GFP的氨基酸序列会发生类似于玉米的光合作用过程，使得GFP的荧光激活。
在细胞生物学领域，GFP被广泛用作标记工具，以帮助研究人员观察细胞内部的某些组分或结构。研究人员可以通过将GFP基因与目标蛋白的基因融合，使目标蛋白在表达时也表达GFP。由于GFP的荧光性质，这样就可以通过荧光显微镜直接观察到目标蛋白的位置和分布。
通过GFP技术，科学家们得以研究细胞核或细胞器在发育过程中的变化，以及探索细胞活动的机制。此外，通过将GFP基因与多个目标蛋白的基因融合，科学家们可以标记多种细胞结构，并观察它们在细胞活动过程中的相互关系和动态变化。
除了在细胞生物学领域的应用外，GFP还被广泛应用于分子生物学、生物化学、药物筛选和基因治疗等领域。由于GFP的高度稳定性和荧光强度，它可以作为生物化学实验中定量和定位特定蛋白质的工具。此外，GFP作为标记基因在基因治疗研究中也发挥着重要作用，用于追踪和监测基因表达和转导的进程。
尽管GFP已经成为生物科学研究中广泛应用的工具，但也存在一些局限性。首先，GFP的结构和功能对温度和酸碱度非常敏感，因此在特殊环境中的应用可能受到限制。此外，GFP的荧光信号在某些细胞或组织中可能受到强烈的自然荧光干扰，降低其检测的灵敏度。
gfp标记蛋白作用
gfp标记蛋白作用
GFP标记蛋白作用
绿色荧光蛋白（GFP）是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质标记工具。它源自于一种发光海洋生物，具有独特的发光特性，发出强烈的绿色荧光。GFP标记蛋白在细胞生物学、分子生物学和生物医学等领域发挥着重要作用，为科学家们提供了一个强大的工具，用于研究蛋白质在细胞内的行为、功能和相互作用。
首先，GFP标记蛋白通过其独特的荧光特性，使科学家们能够直接观察和跟踪蛋白质在细胞中的动态过程。通过将GFP融合到感兴趣的蛋白质上，科学家们可以使用显微镜等技术实时观察这些蛋白质在细胞内的位置、分布和运动。这为研究细胞的结构和功能提供了非常重要的线索，并有助于揭示蛋白质在生物学过程中的作用。
其次，GFP标记蛋白的应用也拓宽了科学家们对蛋白质相互作用的认识。通过将GFP融合到不同蛋白质上，科学家们可以观察这些蛋白质在细胞中的互相作用情况。如此，我们可以了解蛋白质之间的相互作用对细胞功能的调控机制，甚至可以揭示新的信号通路和蛋白质网络。这有助于研究疾病的发生机制以及药物研发中的靶点发现。
此外，GFP标记蛋白还可以用于研究蛋白质的空间定位和生物化学特性。通过在GFP标记蛋白上引入一些特定的突变或标记，我们可以分析蛋白质的结构以及其与其他分子之间的相互作用。这有助于理解蛋白质功能的基本机制，并为结构生物学的研究提供了有力工具。 最后，GFP标记蛋白技术的广泛应用也促进了生物医学研究的发展。通过GFP标记蛋白，科学家们可以追踪病毒、细菌和肿瘤细胞等病理过程，从而为疾病的发生、发展和治疗提供了新的思路。此外，GFP标记蛋白还可以用于监测基因表达、细胞分化和疾病标记物等方面的研究，为临床医学的诊断和治疗提供了宝贵的信息。
综上所述，GFP标记蛋白作为一种重要的蛋白质标记工具，在生物学研究中发挥着重要作用。它提供了直观的可视化手段，使科学家们能够更好地了解蛋白质在细胞内的行为和相互作用。与此同时，GFP标记蛋白也为生物医学研究提供了新的平台和思路。随着技术的不断发展和完善，相信GFP标记蛋白将继续在科学研究中发挥重要的作用，并为我们带来更深入的认识和新的突破。
gfp蛋白序列
gfp蛋白序列
GFP蛋白序列是一种广泛用于生物学研究的荧光蛋白，具有多种应用价值。本文将介绍GFP蛋白序列的结构、功能和应用，并对其在科学研究中的意义进行探讨。
GFP蛋白序列是由238个氨基酸残基组成的多肽链，具有三个主要结构域：环状的β桶结构、α螺旋和β转角。其中，β桶结构是GFP蛋白的核心结构，是其荧光性质的基础。GFP蛋白的结构稳定，不易受到外界环境的影响，使其能够在许多生物体中稳定地表达。
GFP蛋白的荧光性质使其成为生物学研究中广泛应用的工具。通过将GFP蛋白与其他蛋白或细胞器结合，可以实现对其定位、追踪和表达水平的研究。例如，研究人员可以通过将GFP蛋白与目标蛋白结合，观察其在细胞中的分布情况，从而揭示蛋白在细胞内的功能和调控机制。此外，GFP蛋白还可以作为报告基因在遗传转化研究中起到标记作用，帮助研究人员追踪和鉴定转基因生物。
GFP蛋白的应用不仅局限于细胞和生物体的研究，还可以在生物医学领域发挥重要作用。由于GFP蛋白的荧光性质稳定且不需要外部刺激，可以应用于体内活体显微成像。通过将GFP蛋白与特定的疾病标记物结合，可以实现对疾病相关细胞和组织的高分辨率成像，为疾病的早期诊断和治疗提供有力支持。
除了在科学研究中的应用，GFP蛋白还具有实际应用的潜力。例如，GFP蛋白可以应用于环境监测中，通过将其引入到特定微生物中，实现对污染物的追踪和监测。此外，GFP蛋白还可以作为生物传感器，用于检测环境中的重金属离子、有机物和生物毒素等。
尽管GFP蛋白在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，但也存在一些局限性。首先，GFP蛋白的荧光强度较低，不能满足某些高灵敏度检测的需求。其次，GFP蛋白的荧光波长在绿色区域，可能与其他标记物的波长重叠，造成信号干扰。此外，GFP蛋白的荧光性质受到温度、pH值等因素的影响，需要进行相应的优化和校正。
GFP蛋白序列是一种重要的荧光蛋白，具有广泛的应用价值。通过对GFP蛋白序列的结构和功能的研究，我们可以更好地理解其在生物体内的作用机制，为生物学和医学研究提供有力支持。随着技术的不断发展和创新，相信GFP蛋白的应用前景将更加广阔，为生命科学的发展做出更大贡献。
绿色荧光蛋白
食品与药品Food and Drug2009年第11卷第05期74
2008年10月8日，瑞典皇家科学院决定将2008
年度诺贝尔化学奖共同授予Osamu Shimomura（下
村修）、Martin Chalfie（马丁·沙尔菲）和RogerY．Tsien（钱永健），以表彰他们在绿色荧光蛋白
（green fluorescent protein，GFP）发现和研究方
面所做的贡献，这也使得在生物学研究领域早已普
遍使用的荧光蛋白走进了普通大众的视野。
下村修的主要贡献是首次从多管发光水母中分离
出GFP，并发现其在紫外灯照射下发出绿光。沙尔
菲证明了GFP在各种生物现象中作为发光遗传标签的
价值。钱永健阐明了GFP的发光机制，并开发了具
有其他颜色荧光的蛋白质，让研究者能够给予不同
的蛋白质和细胞不同的颜色，以便在同一时间跟踪
几个不同的生物过程[1,2]。GFP是20世纪90年代中期发展起来的一种全新
的报告分子。同以往常用的报告基因，如β-半乳
糖甘酶基因（lacZ gene）、氯霉素乙酰转移酶基因
（cat gene）、荧光素酶基因（luc gene）以及其
他抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和
辅助因子，无毒、稳定、无污染，而且可以在紫
外线或蓝光激发下直接观察。GFP作为一种新型标
记物，目前已被广泛应用于动物学、植物学、生物
学、药学等领域的研究中[3]。1GFP的发展历程
萤火虫发出荧光，是由荧光酶催化底物分子荧
光素，发生化学反应后产生荧光。发现蛋白质自身
发光无需任何底物这一现象，始于下村修和已故美绿色荧光蛋白
黄思玲
（山东福瑞达生物化工有限公司，山东济南250101）
国科学家约翰森的研究。1962年，下村修与约翰森
在纯化水母素的研究过程中，有一天下修村下班前
将水母发光蛋白的提取产物倒进水池里，出门前关
灯后发现水池闪闪发光。后来发现这种蛋白质副产
物在阳光下呈绿色，钨丝下呈黄色，紫外光下呈强
绿色。他们研究了其发光特性，1974年得到这种蛋
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位与农杆菌瞬时侵染方法
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位与
农杆菌瞬时侵染方法
转基因技术,生物定向改良,分子育种基因工程和育种的最有效途径,转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法。
农杆菌瞬时侵染方法
(1) 转入目的载体的农杆菌EHA105单菌落接入4mL LB-50ug/mL-Kan, 30℃摇床震荡培养20h;
(2) 转接3mL菌液进入30 mL LB-50ug/ml-Kan, 30℃摇床震荡培养6-8h;
(3) 收集菌体，用10mL 1/2 Ms（1.5% sucrose）液体培养基悬浮菌体， 加入5ul 100mM As, 混合均匀；
(4) 切洋葱内表皮，撕开后内表皮，切开的宽度控制在0.5-0.7cm, 浸入农杆菌菌液，浸泡30min;
(5) 滤纸轻轻吸去洋葱表皮表面可见的农杆菌菌液，放置在1×Ms+1.5%Sucrose固体培养基上，25℃培养18-20h;
(6) 用1XPBS (pH7.0)溶液轻轻漂洗洋葱表皮两次，无菌水漂洗1次；
(7) 在荧光显微镜下观察，采用激光共聚集显微镜采集图像；
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位
一、原理
利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，在光镜水平进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响。并且GFP的分子量为27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。
二、主要步骤
1．真核表达载体的构建 ①引物设计
利用引物设计软件，根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物：