绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用_吴沛桥
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
（４）构建载体方便。由于编码ＧＦＰ的基因序列 很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒， 而不至于使质粒过大影响转化频率。
（５）可直接用于活细胞测定。ＧＦＰ是能在异源 细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且ＧＦＰ 的分子量较小，Ｎ一端和Ｃ一端都能忍受蛋白的融
合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察， 更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察 蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到 外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显 微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微 镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进 行三维显示。
３ ＧＦＰ的应用
ＧＦＰ的应用主要集中在利用其荧光性质的基础 上作为一种标记物。 ３．１ ＧＦＰ在分子生物学上的应用 ３．１．１ ＧＦＰ作为报告基因 报告基因是一种编码
可被检测的蛋白质或酶的ＤＮＡ，如传统的荧光素酶 （ＵⅨ）基因和ｐ一葡萄糖苷酶（ｃｕｓ）基因。ＧＦＰ作 为基因报告可用来检测转基因效率，把ＧＦＰ基因连 接到目的基因的启动子之后，通过测定ＧＦＰ的荧光 强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前， 此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传 转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得 到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时 空成像方面［１５Ｉ。 ３．１．２ ＧＦＰ作为融合标签
２ ＧＦＰ的理化性质。荧光特性及其改进
绿色荧光蛋白GFP的显微观察及其在转基因研究中的应用
报告基因的特点
已被克隆和全序列已测定； 表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细 胞中无相似的内源性表达产物；
其表达产物容易观察或能进行定量测定
常用的报告基因
基因名称 GUS 基因编码蛋白
β-D-glucuronidase（β-D葡萄糖苷酶）
检测方法
催化底物形成β-D-葡萄糖苷 酸，它在植物体中几乎无背 景，组织化学检测很稳定
实验仪器：荧光显微镜
实验步骤：
1. 2. 3.
取部分转基因幼苗放入IAA溶液中处理5-10分钟 。 无IAA处理的作为对照。 PI 染色 将植物根部浸泡在1XPI工作液中10秒左右。 用水冲洗30秒。
4. 制片 用擦镜纸擦载玻片 滴一滴水 用镊子取一棵幼苗，将根部在水中展开（可以将叶 片切除） 用镊子夹取盖玻片，从一侧轻轻盖上 5.显微镜观察 放下载物台，将载玻片放上载物台，旋转20X物镜 至光路，滤光片在明场位置（1） 将载物台上升至离物镜很近处，不要碰到物镜 寻找视野中模糊的根，下调载物台，聚焦 移动载物台，寻找根尖 转换至40X物镜，滤光片调至蓝光（3）或绿光（4 ），打开shutter，观察、拍照和保存实验结果。
3:绿色荧光蛋白--GFP
GFP最初从水母，jellyfish Aequorea victoria 中分离出 在分子生物学和细胞学领域，GFP是广 泛使用的报告基因
GFP
GFP蛋白含238 氨基酸残基， 分子量29.6KDa Fluorescent protein (荧光蛋白 ): 在蓝-紫外光的激发下产生强的 绿色荧光
普通生物学实验
GFP报告基因的显微观察及其在
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用摘要：随着科学技术的不断更新和发展，绿色荧光蛋白在动物学、植物学、微生物学等领域的应用研究越来越广泛。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)可作为报告基因，且具有分子量较小、荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需要底物等的特点。
本文就对荧光蛋白在分子生物学中的应用做一综述。
关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；应用The Application of GFP As Reporter Gene In the Molecular Biology Abstract: With the upgrade and development of science and technology, the application of green fluorescent protein used in Zoology, Botany and microbiology is more extensive. As a reporter gene, GFP have some characteristics, such as low molecular weight, good fluorescent stability, non- toxicity to organisms. This paper reviews the application of GFP in the molecular biology. Key words: green fluorescent protein, reporter gene, application of GFP绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类来自于海洋生物如水母、水螅和珊瑚等腔肠动物内的一种生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，能发射出绿色荧光。
绿色荧光蛋白——结构及应用
绿色荧光蛋白——结构及应用孙艺佩【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点,因此在各个领域已经有了广泛的应用,在细胞生物学与分子生物学领域中,基因常被用作一个报导基因作为生物探针,拿来映证某些假设的实验方法;在医学领域,常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程.本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化工中间体》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】2页(P124-125)【关键词】绿色荧光蛋白(GFP);荧光生色机理;生色团;技术应用【作者】孙艺佩【作者单位】山东省实验中学山东 250000【正文语种】中文【中图分类】Q绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
1994年，马丁·查尔菲首次在实验中成功表达GFP基因，向人们展示了绿色荧光蛋白作为遗传标签的价值。
同年，钱永健与其同事提出GFP生色团发光机理并改造GFP，使其更易作为标记物应用于各类试验。
2008年，诺贝尔化学奖授予钱永健、马丁·查尔菲和下修村，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白。
这一发现成果为生命科学的进步提供了更便捷的渠道。
从维多利亚多管水母中分离出来的野生型GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
它具有β-桶的结构，几乎是个直径2.4nm，长4.2nm的完美圆柱。
11个β-折叠链形成β-筒的外周，筒两端分别被一些分子量较小的短α-螺旋覆盖，组成生色团的三个残基（Ser65-Tyr66-Gly67）与α-螺旋共价相连，位于圆筒中央螺旋中部。
β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入,生色团被严格保护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。
绿色荧光蛋白的应用及发展前景汇总
学士学位论文文献综述题目绿色荧光蛋白的应用及发展前景姓名周紫嫣学号专业生物工程指导教师周小萍职称教师中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (II)关键词 (II)Abstract (II)Key words (II)1 GPF的发现 (1)2 GFP的结构及发光原理 (1)2.1 GFP的结构 (1)2.2 GFP的发光原理 (2)3 GFP在生物技术中的应用 (2)3.1 GFP作为报告基因 (2)3.2 GFP用于研究病毒与宿主的关系 (3)3.3 GFP用于药物筛选 (3)3.4 GFP作为生物传感器 (3)3.5 GFP用于融合抗体 (4)3.6 GFP用于计算细胞生长速度 (4)3.7 GFP用于基因表达调控 (4)4 GFP存在问题及发展前景 (4)参考文献 (5)致谢 (5)绿色荧光蛋白的应用及发展前景摘要绿色荧光蛋白(GFP）是一种由水母（Aequorea Victoria）体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
本文综述了绿色荧光蛋白的发现过程，基本性质，应用及其发展前景。
关键词绿色荧光蛋白；报告基因；药物筛选；融合抗体Green fluorescent protein application and development prospectAbstractGreen fluorescent protein (GFP) is a kind of the jellyfish (Aequorea Victoria) found in the body of the luminous protein. Molecular quality as kDa 26, with 238 amino acids, 65 ~ 67 of amino acid (Ser-Tyr-Gly) form shine group, is mainly the position of the light. The light the formation of the group has no species specificity, a fluorescent stability, and does not need to rely on any auxiliary factors or other matrix and shine. Green fluorescent protein gene into the host cell is stable, for most of the host physiology no effect, the report is a common gene. This paper reviewed the green fluorescent protein discovery process, basic properties, application and development prospect.Key wordsGreen fluorescent protein；Report gene；Drug screening；Fusion antibody1 GPF的发现2008年的诺贝尔化学奖授予从事有关:“绿色荧光蛋白( GFP) 的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家：日本科学家下村修（Osamu Shimomura）；美国科学家马丁·沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）。
绿色荧光蛋白的研究现状与应用
绿色荧光蛋白的研究现状与应用【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。
由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。
随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。
【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。
1 绿色荧光蛋白的理论研究1.1绿色荧光蛋白的发现绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。
它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。
水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。
1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。
野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。
GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。
绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。
GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展一、关键词：绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健二、背景2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。
而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。
钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。
他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。
他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。
现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。
三、GFP的主要性能GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。
GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。
发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。
在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。
GFP具有自发的荧光特性，能够发出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。
GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。
在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。
一、GFP的发现与基本原理1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。
1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用前景。
GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的参与。
GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。
GFP的发光特性具有“自发、可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研究中广泛使用的荧光标记分子。
二、GFP在光遗传学的应用光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时监测的技术。
GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶和离子泵的表达。
通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。
GFP的分子可以通过基因克隆技术导入到目标细胞或组织中，与其他光敏感蛋白一起被利用为光敏受体。
结合光学影像技术，研究人员可以通过光刺激来操作蛋白质的表达、离子流动、膜的通透性等，从而研究细胞和生物体系中各种生理或病理情况的变化。
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■通信作者 E mail :baxiaoge1957@yahoo .com .cn绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用吴沛桥1,巴晓革2■,胡海1,赵静1(1.南京农业大学生命科学学院,南京210095;2.山东药品食品职业学院,威海264210)摘要:源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP ),是一种极具应用潜力的标记物,有着极其广泛的应用前景。
我们就GFP 的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
关键词:绿色荧光蛋白(GFP );标记物;荧光特性;进展;改进;应用中图分类号:Q51,503;R318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278(2009)01-0083-04Research Progress and Application of Green Fluorescent ProteinWU Peiqiao 1,BA Xiaoge 2,HU Hai 1,ZHAO Jing1(1.Nanjing Agricultu ral University ,College of Life Science ,Nanj ing 210095,China ;2.Shandong Drug and Food V ocatio nal College ,W eihai 264210,China )A bstract :The green fluorescent protein (GFP )from the jellyfish Aequorea vietoria is a great potential for application of the marker ,has a wide range of applications .The article on the physical and chemical properties ,the fluorescence characteristics ,improvement and application of GFP are reviewed .Key words :Green fluorescent protein ;Marker ;Fluorescence characteristics ;Progress ;Improvement ;Application1 引 言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象,一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光,而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白(Green fluorescent pr otein ,GFP )是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962年Shimomura 等[1]首先从多管水母(Ae quoria victoria )中分离出一种分子量为20kD 的称为A equorin 的蛋白。
由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。
随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP ,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae )和海紫罗兰科(Renillidae )的GFP ,即Ae quoria GFP 和Renilla GFP 。
2 GFP 的理化性质,荧光特性及其改进2.1 GFP 的理化性质从水母体内分离到的GFP 基因,长达2.6kD ,由3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP 本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。
A equoria GFP 分子量约27×103,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而Renilla GFP 是分子量为54kD 的同型二聚体。
两种GFP 有不同的激发光谱,A equoria GFP 在395nm 具有最高光吸收峰,肩峰为473nm ;Renilla GFP 在498nm 具有强烈的光吸收,肩峰为470nm 。
两种GFP 含有相同的生色团,发射光谱基本相同(λmax =508～509nm )。
GFP 性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH <4.0或pH >12.0的条件下用6mol L 盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是,它们在很大的pH 范围内(pH7～12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。
Renilla GFP 的稳定性就更为显著。
它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。
根据Sheen生物医学工程研究J ournal of Biomedical Engineering Res earch2009,28(1):83～86 等[2]的研究,GFP在受体内表达时,其稳定性并不亚于CAT蛋白,因而可以得到持续时间较长的荧光。
2.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。
GFP表达后折叠,在氧存在的条件下,使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。
由65～67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-p-hydroxybene -5-imidazolinone),形成生色团(基于组成生色团的元件不同,可将已知的GFP及其变种分为7种,每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)[3-5]。
GFP无需再加任何底物和辅助因子,在紫外或蓝光激发下就能发荧光,在450～490nm蓝光激发下, GFP荧光至少能保持10min以上,不像其他荧光素,荧光容易淬灭。
其中,GFP的一个引人注目的特点,其生色团的形成没有物种的特异性,可以在翻译后2～4h通过自动催化作用来合成。
Cubitt等[6]认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成,由此Kolb等[7]提出一个假说,即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。
2.3 GFP的荧光性质及应用优点[8-9]GFP的荧光性质比较特殊,具有诸多优点而备受关注。
(1)易于检测,灵敏度高。
GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子,只需紫外光或蓝光激发,即可发出绿色荧光,用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。
其次,即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的,在正常室内光线下仍清晰可辨。
对于单细胞水平的表达也可识别。
(2)荧光性质稳定。
GFP对光漂白(一种荧光衰减现象)有较强的耐受性,能耐受长时间的光照,从而延长了可探测时间;GFP在pH7～12范围内也能正常发光,对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。
(3)对细胞无毒害。
从目前的研究结果来看, GFP对生活的细胞基本无毒害,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能没有影响,转化后细胞仍可连续传代。
(4)构建载体方便。
由于编码GFP的基因序列很短,所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率。
(5)可直接用于活细胞测定。
GFP是能在异源细胞内表达后,能自发产生荧光的蛋白,并且GFP 的分子量较小,N-端和C-端都能忍受蛋白的融合,是理想的标记物,可进行活细胞实时定位观察,更能接近自然真实的状态。
如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态,还可实时观察到外界信号刺激下,目的蛋白的变化过程,借助荧光显微镜观察,使研究更为方便。
使用激光共聚焦显微镜,其图像效果更佳,结合现代的计算机软件,可进行三维显示。
(6)不受假阳性干扰。
由于其他生物本身不含有GFP,因此不会出现假阳性结果,GFP作为分子探针可以代替荧光染料,避免由于染料扩散造成的定位不准,使结果真实可靠。
(7)广谱性。
表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制,在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达,其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制,在各个部位都可以表达发出荧光。
(8)易于得到突变体。
如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体,且增强了荧光强度,适合在不同物种中专性表达。
2.4 GFP的改进尽管GFP作为报告基因或分子探针有许多无可比拟的优点,但是野生型GFP(wtGFP)具有一定的缺点:如GFP有两个激发峰影响了其特异性,并且长波激发峰强度较小,不易观察;GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大,表达量较低;而且在某些植物细胞中并不表达。
这些都限制了进一步的应用,所以,一些研究人员运用定点突变、DNA-shuffling等技术对GFP进行了改进,获得了荧光光谱、量子产率、溶解性、密码子嗜性、温度敏感性等改变的多种突变体,扩大了GFP的应用范围。
2.5 GFP的改进方法2.5.1 除去GFP基因中隐蔽型内含子 Haseloff 等[10]利用农杆菌把含花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的GFPcDNA转入到拟南芥上,但在转基因拟南芥幼苗上检测不到GFP的荧光。
经研究发现这是由于GFP片段中第405～488碱基序列转录的mRNA被植物误识别为内含子,从而被错误加工,导致GFP不能正确表达。
因此改变碱基组分,消除隐蔽型内含子,可以避免植物细胞的错误剪接。
如突变型m GFP改变了碱基组分后,在转基因拟南芥中检测到荧光,但荧光强度较弱。
2.5.2 消除编码蛋白的积累 Haseloff等[10]认为消除隐蔽型内含子后的突变体mGFP荧光较弱,可能是由于编码蛋白的积聚。
增加ER定位信号可部分84 生物医学工程研究 第28卷消除编码蛋白的积累,增加荧光强度。
2.5.3 改变碱基组分 Zolotukhin等[11]改变了wt G FP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替,使GFP的荧光强度提高22倍。
其中S65T突变提高了GFP的荧光强度,Y66H突变使之同时具有部分蓝色荧光蛋白(B FP)的性能,但其蓝色荧光强度很低。
这种GFPh 是一种人工全合成的适合在哺乳动物细胞中高效表达GFP的突变体。
McCullough等[12]对水母的密码子进行优化修饰,更换为植物偏爱密码子,即增加G 和C的含量,降低A和T含量,改造的GFP基因表达效率可有较大提高。
2.5.4 更换GFP生色团氨基酸 Heim等[4]将wt G FP中的Ser65用Thr替代,得到突变体S65T-GFP,相比wtGFP具有明显的改进。
首先,S65T-GFP激发谱中只有一个峰,且红移至490nm,是一种红移荧光蛋白(RSFP)。
用蓝光即可激发R SFP,更适于普通荧光显微镜观察。
其次,激发后产生的荧光强度是wtGFP的6倍,并且对光漂白具有更强的抵抗性。
最后,这种突变体分子的成熟速度比wtGFP 快4倍,从而缩短了从合成到发光的时间。