转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测_芦春斌
转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测_芦春斌
研究报告 芦春斌 :转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern blo t检测
1. 2. 2 PCR引物 猪 α-乳清蛋白基因的引物序列参照文献 [ 9] 。
1. 2. 3 质粒 DNA 参照文献 [ 8]提取质粒 DNA, 测定浓度并计算纯
度后 , 为 PCR扩增模板 。 1. 2. 4 基因片段的 PCR扩增和 probe制备
转基因植物技术可以定向改造生物性状 , 其应用 打破了传统育种方式只能利用亲缘关系相近物种间的 基因来改造生物的局限 , 因此转基因技术可以以前所 未有的速度和能力 , 在短时间内实现改良动 、植物品种 的产量 、质量 [ 1 - 4] 。
获得具有优良性状的转基因作物新品种 , 首先必 须确保外源 目的基因以 预期设计 的方式高 效表 达 [ 5, 6] 。然而许多情况下 转基因的表达不可预测 , 也
植物 转 化 双 元 载 体 pCG-CB-L act 为 前 期 实 验 构建 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 基因组 DNA 提取
取 100 mg样品 (叶片或种子 )放在研钵中 , 加液氮 研磨成粉末 , 采用改进的 CTAB 法提取转基因烟草的 基因组 DNA [ 7] , F lurescent 定 量剂 盒 (B io-R ad 产 品 , 170-2480)对 DNA定量 。
《种子》2007年1～12期总目次
镉处理对绿豆种子萌发及蛋 白质含量 的影响
… … … … … … … … … … … … … … …
卢
… …
莉
薛
赵一鹏
香
蔡祖 国 等 （ — ５ ３ ３）
茹萍萍（ ３ ） ３— ８ 刘崇欣 （ ４ ） ３— ０
柳枝浸提液对小麦籽粒发芽的抑制作 用研究
… … … … … … … … … … … … …
郑有 良 等 （ ６ ４— ）
２ ４Ｄ包膜处理对黄瓜种子发芽、 ， 幼苗生长和生理特性 的影响
… … … … … … … … … … … … …
小麦秸杆浸提物 的化感作用研究
… … … … … … … … … … … … … … …
杨文清
张
转基 因拟南芥 中外源基 因的 Ｓｕｈｒ ｌｔ ｏｔｅｎｂｏ检测 ……… 芦春斌 （ ２—１ ） ４
王 国鼎
文晓鹏
季祥彪 王
等（ — ４ ３ ２） 倩（ － ７ ３ ２）
胡志辉
陈禅友
雷
刚（ —１） １ ８
等（ —２ ） １ ２
大葱种 子人工老化与膜脂过氧化的研究 李 颜
酸性 Ｐ Ｇ Ａ Ｅ鉴定杂交水稻品种纯 度的研究
… … … … … … … … … … … … … … …
壳聚糖 对黄瓜种子萌发及 幼苗抗冷性 的效应
苦瓜 Ｉ Ｒ Ｃ Ｓ ．Ｒ反应体 系的建立 Ｓ
… … … … … … … … … … … … …
王 绪
１ 种兰属植物 Ｄ Ａ的提取及 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ实验体系的建立与优化 １ Ｎ Ａ Ｄ－Ｃ
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转基因拟南芥培养ppt课件
GFP报告基因
发现：
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）
水母中发现发光蛋白（20世纪60年代）
GFP报告基因
性质： 238氨基酸组成的单链多肽 在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光
有什么用呢?
蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观 察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
PstI StuI
MAP65-1
tubulin
转染成功?
35SprombaI
如何判定载体转化成功，植株内是否有目 的基因的表达？
——载体及植株的筛选
生 长 一 个 月 左 右 的
转 基 因 植 株
GFP
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
生 长 两 个 月 左 右 的
转 基 因 植 株
GFP
Confocal荧光显微镜观察GFP-tubulin 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
材料：GFP转基因拟南芥种子及幼苗
试剂：MS培养基(wild type) ；
MS卡那抗性培养基(GFP-MAP65)； 75％乙醇； 10％NaClO；
无菌水。
种子消毒及播种实验流程
种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）； 75％乙醇润洗一遍，再用75％酒精消毒1min
（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 10％NaClO润洗一遍，再用10％NaClO消毒
10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 无菌水洗五遍，用牙签将种子点在培养基表
面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）； 封膜，做好标记，平放于培养架上培养。
目的基因
目的基因tubulin 拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞中微管骨
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法
转基因是一种重要的遗传工程技术，可以将外源基因导入到生物体内，从而改变其性状和功能。
但是，如何鉴定转基因是否成功呢？下面介绍几种方法。
1. PCR扩增法。
PCR是一种可以扩增DNA序列的技术，可以通过PCR扩增转基因序列和内部参考序列，然后对扩增产物进行电泳，观察是否存在目标大小的DNA条带，从而证明是否成功转基因。
2. Southern blotting。
Southern blotting是一种检测DNA序列的方法，可以将DNA片段转移到膜上，然后使用探针特异性检测转基因序列的存在。
3. Northern blotting。
与Southern blotting类似，但是是用来检测RNA序列的方法，可以检测目标RNA是否被表达。
4. Western blotting。
Western blotting是一种检测蛋白质的方法，可以检测目标蛋白质是否被表达。
5. 生理表型。
转基因生物的表型通常会发生明显的变化，如植物的生长速度、耐旱能力、抗病性等。
通过观察生理表型的变化，也可以鉴定转基因是否成功。
综上所述，以上方法可以用来鉴定转基因是否成功，研究人员可以根据需要选择合适的方法。
- 1 -。
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用作者：代军来源：《安徽农业科学》2015年第01期摘要Southern杂交技术作为分子生物学中的经典技术，为特定DNA片段的检测提供了快速、准确、灵敏的方法。
在植物遗传转化研究中，Southern杂交技术广泛应用于外源基因的检测及拷贝数的鉴定工作，为植物转基因研究的准确性提供了充分的保障。
综述了Southern杂交技术在水稻、玉米、小麦、大豆等主要农作物遗传转化研究中的应用，可为农作物转基因研究方法的明确及转基因食品安全检测方法的探索提供参考。
关键词Southern杂交;农作物;遗传转化;外源基因检测中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）01-020-04Application of Southern Blot in the Genetic Transformation of CropsDAI Jun（Liaoning National Normal College， Fuxin， Liaoning 123000）AbstractAs one of classical techniques of molecular biology， Southern blot provides a fast，accurate and sensitive method for the detection of specific DNA fragments. In the research of genetic transformation in plants， Southern blot is widely used in the detection of genetic transformation and identification of gene copy number. It provides adequate safeguards for the accuracy of transgenic research. This paper summarizes the application of Southern blot in the staple crops， such as rice，maize， wheat， soybean， etc.， which provides references for the definitude of the ways for studying genetic transformation， as well as the explore of the ways for detecting genetically modified food safety.Key wordsSouthern blot; Crops; Genetic transformation; Detecting exogenous gene基金项目国家林业公益性行业专项资助项目（200904064）。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法随着生物技术的发展，转基因技术逐渐成为一种有效的方法，应用在农业、医药、生物制药等领域。
转基因技术通过人工改变生物基因，进而创造出新品种或个体。
在转基因工程中，鉴定转基因是否成功是极其重要的。
本文将从多种角度介绍鉴定转基因是否成功的方法。
一、利用PCR技术确认转基因是否成功PCR反应是鉴定转基因是否成功最为简便和经济的方法之一，这种技术是利用酶切扩增DNA的特点，在反应中对改造的基因进行检测，在特定的条件下扩增目的基因片段，并与未转基因进行比较。
如果扩增所得的基因片段与转基因所期望的片段大小一致，说明转基因已经成功。
二、Southern blotting 鉴定转基因Southern blotting是一种DNA测定技术，通过将RNA 转换为DNA并进行胶体电泳将目标DNA片段从细胞中分离并检测目标片段。
Southern blotting 可以检测到基因定位，基因拷贝和突变，改变DNA构型和次级结构。
Southern blotting的结果可以表明：在细胞内是否存在谷氨酸脱羧酶基因等转基因相关的基因组位置。
三、利用生物学筛选法进行鉴定利用生物学筛选法可以鉴定出转基因是否成功，它们往往是通过化学诱变法，以及处理基因的特殊性质，来筛选目标基因。
例如可以利用抗草甘膦，病毒耐受性，抗虫淀粉酶等性质来鉴定。
只要观察到相应的特性，就可以证明此转基因已经成功。
四、荧光成像鉴定转基因Fluorescent Proteins如GFP和RFP等，诞生于最近十几年之间。
通过构筑转基因生物，来融入荧光基因，从而使生物体内部发亮。
并且，荧光标记的转基因生物能使生物学家们观察到某些细胞活动的细微变化以及动物生命体系资源的流入流出等现象。
五、PCR约束消化鉴定转基因PCR约束消化也被广泛用于检测转基因。
将PCR扩增的产物，用细菌中相应的酶切割，然后进行胶溶电泳，这么做可从大小上直观鉴定出目的基因片段是否已被插入基因位点，以及是否是单一拷贝。
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用
2、DNA digestion：将基因组DNA进行限制性内切酶消化，得到特定长度的 DNA片段。
3、凝胶电泳：将消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，将不同大小的 DNA片段分离出来。
4、Southern转移：将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，以便进行进 一步的杂交操作。
5、探针标记：将特异性探针进行放射性标记，以便在杂交过程中进行信号 的放大和检测。
参考内容二
一、引言
Southern印迹杂交是一种常用的分子生物学技术，用于分析特定DNA序列在 基因组中的存在和分布。这项技术的改良版本，既保留了原始方法的准确性，又 极大地提高了效率和易用性，对于各类科研和临床应用具有重要的实际价值。
二、方法描述
在改良的Southern印迹杂交方法中，我们采用了更高效的DNA提取和纯化步 骤，以及创新的凝胶电泳和转移步骤。这使得我们能更好地保留和检测到DNA的 特异性序列。
三、详细介绍
1、印迹剂的选择
在Southern印迹杂交过程中，需要选择合适的印迹剂。常用的印迹剂包括尼 龙膜、滤纸、PVDF膜等。选择合适的印迹剂非常重要，因为它直接影响到DNA的 转移效果和杂交效率。
2、杂交条件的设定
杂交条件的设定对于Southern印迹杂交技术的结果至关重要。这些条件包括 杂交温度、盐浓度、缓冲液类型等。这些参数需要根据实验目的和具体实验条件 进行调整，以获得最佳的杂交效果。
6、杂交反应：将标记好的探针与硝酸纤维素膜上的DNA片段进行杂交反应， 使得特异性序列能够结合在一起。
7、洗膜和显影：洗去未结合的探针，并通过放射性自显影技术显现出杂交 信号，从而确定目标基因的位置和拷贝数。
参考内容
基本内容
Southern印迹杂交技术是一种在基因组学和分子生物学中广泛应用的印迹技 术，主要用于检测和识别特定DNA序列。本次演示将详细介绍Southern印迹杂交 技术的原理、实现过程、优点、不足以及其他相关印迹技术，最后对Southern印 迹杂交技术的优劣和应用前景进行全面评价。
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植物 转 化 双 元 载 体 pCG-CB-L act 为 前 期 实 验 构建 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 基因组 DNA 提取
取 100 mg样品 (叶片或种子 )放在研钵中 , 加液氮 研磨成粉末 , 采用改进的 CTAB 法提取转基因烟草的 基因组 DNA [ 7] , F lurescent 定 量剂 盒 (B io-R ad 产 品 , 170-2480)对 DNA定量 。
第 26卷 第 2期 2007年 2月 种 子 (Seed) V o.l 26 N o. 2 Feb. 2007
转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern b lot检测
芦春斌 (暨南大学生殖免疫中心 , 广州 510632)
摘要 :外源基因在转基因植物的稳定表达是获得 理想转基因植物的首要条件 。 在我们进行的转基因植物研究中 , 根据转 基因植物所带有的转基因成分和标记基因的 DNA 序列 , 采用 Southe rn b lo t技术对转基因植物中的猪 α-乳清蛋白基因和 标记基因的拷贝数进行了分析 。 结果表明 :外源 基因的拷贝数和外源基因的稳定表达相关 。 关键词 : 转基因植物 ;基因沉默 ;猪 α-乳清蛋白基因 ;Southe rn b lo t分析 中图分类号 : Q 812 文献标 志码 : A 文章编号 :1001-4705(2007)02-0014-03
双元载体 (pCG-CB-Lact)(图 2)特有的边界序列 LB和 RB之间包含 2个 35 S启动子序列驱动的 α-乳 清蛋白基因 , 以及除草剂抗性基因 Bar表达单元 , α-乳 清蛋白基因和 Bar基因编码区中只有一个 H id Ⅲ酶切 位点 , H ind Ⅲ可用于 Southern b lo t的基因组 DNA消化 。
10 μg基因组 DNA 加入 0. 8 μl的内切酶 H ind Ⅲ (80 U /μl), 75 μM 精胺 , 总体积 25 μl, 37 ℃消化过夜 。 0. 8%琼脂糖胶分离酶处理的 DNA, 转移到 Ze ta-P rober GT 尼龙膜 (B io-Rad产品 , 162-0196), UV 交联仪固定 , 用含有 0. 1 ×SSC, 0. 1%SDS溶液洗涤滤膜进行预杂 交和杂交 。 分别用α-32 P dCT标记的 Lact和 Bar探针杂 交 , X 光片曝光处理 。
株的叶片和种子进行 PCR反应 , 都检测到这两种外源 基因成分 [ 9] , 上述引物对检测猪 α-乳清蛋白 基因和 Bar基因具有高度的特异性 。
以质粒 (pCG-CB-Lact)DNA 为模 板 , 该引 物可以 特异 性 地 扩 增 得 到 目 的 基 因 DNA 片 段 , 进 一 步 P α-32 dCTP随机引物标记法 标记 PCR 产物作为探 针 , 该探针高度灵敏 、特异 , 是进行 Southe rn分析的关键 。
Southern B lot A nalysis of Exogenous Transgenic G enes in Transgenic A rab idopsis P lan ts
LU Chun-b in (Institu te of Reproductive Imm uno logy, Ji’ nan Un ive rsity, Guangzhou 510632, C hina)
收稿日期 :2006-11-16 基金项目 :教育部留学回国人员科研启动基金资助 。 作者简介 :芦春斌 (1964 -), 男 , 陕西长安人 。 副研究员 , Iow a S tate U n i-
vers ity博士后 , 主要从事转基因植物和食用疫苗研究 。
14
存在基因沉默现象 。 基因沉默无法使转基因植物表现 预期的优良经济性状 , 研究基因沉默的机理和克服外 源基因的不表达是转基因植物研究和应用的关键 。 本 研究中以 Sou thern blo t对我们获得的猪 α-乳 清蛋白 转基因拟南芥的基因拷贝数进行分析 , 旨在探讨拷贝 数与外源基因表达之间的关系 。
转基因植物技术可以定向改造生物性状 , 其应用 打破了传统育种方式只能利用亲缘关系相近物种间的 基因来改造生物的局限 , 因此转基因技术可以以前所 未有的速度和能力 , 在短时间内实现改良动 、植物品种 的产量 、质量 [ 1 - 4] 。
获得具有优良性状的转基因作物新品种 , 首先必 须确保外源 目的基因以 预期设计 的方式高 效表 达 [ 5, 6] 。然而许多情况下 转基因的表达不可预测 , 也
genes in transgencic p lan.t The resu lts show ed the copynum ber o f exogenous genes is dram atically re la ted to the stab le expression o f exogenous genes. K ey word s: transgenic p lants;gene silencing;porcine α-lactalbum in;southe rn blo t
图 1 PCR扩增植物猪 α-乳清蛋白基因和除草剂 Bar基因 注 :M :Invitrogene公司 1 K b P lu s DNA ; Lane 1、 2:除草剂 B ar基因引物 Ba rSeq扩增 ;Lane 3、4:猪 α-乳清蛋白引
物 LactSeq扩增 ; Lane 1、3:野生型拟南芥基因组 DNA , 阴性对照 ;Lane 2、4:pCG -CB-LACT
然而在许多情况下外源基因整合进受体植物的基 因组后 , 经常发生外源基因在转基因植物中的基因沉 默 (gene silec ing)现象 , 以及多种外界环境条件和植物 的生长发育因素影响其表达与稳定性 , 结果不仅外源 基因没有表达, 反而影响了内源基因的正常表 达 。 [ 5, 6, 11]
外源基因的基因沉默是一个非常复杂的现象 , 基 因沉默不同于 DNA 岐变或位置效应引起的基因表达 水平低下 , 也不同于外源基因在子代分离过程中的丢 失 。外源基因沉默现象在 DNA修饰水平 、基因转录水 平和转录后调节水平均可发生 [ 5, 6] 。
Sou thern杂交结果发现 , 抗除草剂 F inale 阳性拟 南芥转化株 A rab 06和 A rab 15的植物基因组中均整 合了猪 α-乳清蛋白基因单拷贝 (图 3 B. Lact), 同样这 两株抗除草剂 F ina le阳性转化株的基因组中除草剂基 因 Bar基因也是单拷贝整合 (图 3A. Bar )。
Ab stract:The fo reign genes are stably expressed in transgen ic p lant, w hich ism ain issue for plan t transform ation research. In this artic le, accoding to transgenic components and DNA sequence o f m arker genes in transgenic p lant, we adopt southern blot techno logy to analyze porcine α-lactalbum in and copy num be rs of m arke r
转在获得的转化植物及其后代中 , 生长过程中只有拟 南芥转化株 A rab 06和 A rab 15的多个组织器官 , 即种 子和叶片都有猪 α-乳清蛋白基因蛋白的稳定表达 。
3 讨 论
植物转化的受体植物中导入外源的基因必须在转 基因植物后代中稳定表达 , 外源基因能否以预期的方 式稳定 表 达是 影响 转 基因 植 物应 用 前景 的 首要 因 素 。 [ 5, 6, 11]
研究报告 芦春斌 :转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern blo t检测
1. 2. 2 PCR引物 猪 α-乳清蛋白基因的引物序列参照文献 [ 9] 。
1. 2. 3 质粒 DNA 参照文献 [ 8]提取质粒 DNA, 测定浓度并计算纯
度后 , 为 PCR扩增模板 。 1. 2. 4 基因片段的 PCR扩增和 probe制备
图 3 转基因拟南 芥 Southe rn分析 注 :Lane 1:Invitrogene公司 1 K b Plu s DN A;ck:野 生型拟南 芥基因组
DNA , 阴性对照 ;A rab 06和 A rab 15:转化株 。
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第 26卷 第 2期 2007年 2月 种 子 (Seed) V o.l 26 N o. 2 Feb. 2007
随着生物科学的发展 , 转基因植物技术等分子育 种技术为培育作物优良新品种开辟了一条崭 新的途 径 。植物转化可将具有优良性状的外源基因导入受体 植物 , 使之具备新的生物性状 , 由此而得到具有各种重 要经济价值 的 “遗 传修饰生 物 ” (G ene tic m odified organism , GM )-转基因作物 。 目前进入实际应用的商业 化转基因作物主要是导入抗除草剂基因 , 抗病毒基因 、 抗虫基因等各种优良性状基因 。玉米 、大豆和棉花等 转基因作物已经在世界各地大面积种植 , 对世界农业 已做出很大的贡献[ 1 -4] 。
(1)PCR反应体系和反应程序参照文献 [ 9] 。 猪 α-乳清蛋白基因 94 ℃变性 45 s, 55 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 , 循环 35次 。Bar基因 PCR扩增的条件 , 除 50 ℃退火 1m in外 , 其余条件同前者 。