SYBRGreen实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

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通过SYBR Green Ιreal-time PCR 获得样本中目的基因和内参基因的C T 值，将C T 值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量，目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数。

计算结果为4份样品中，2个拷贝的1个，3个拷贝的3个。

关键词：real-time PCR ；SYBR Green Ι；转基因大豆；拷贝数；Lectin ；35边界序列中图分类号：S565.1；Q78文献标志码：A文章编号：1005-9369（2011）10-0011-05Establishment of SYBR Green-base quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transgenic soybean/JI Zhigeng,GAO Xuejun,AO Jinxia,ZHANG Minghui,HUO Nan(Life Science and Biotechnique Research Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)收稿日期：2010-10-28基金项目：国家转基因重大专项课题（2008ZX08012-001）作者简介：冀志庚（1984-），男，硕士研究生，研究方向为转基因作物检测。

E-mail:hanbo001@ *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为转基因检测。

E-mail:gaoxj5390@ Journal of Northeast Agricultural University东北农业大学学报第42卷第10期42(10):11~152011年10月Oct.2011实时荧光定量PCR 技术是一种新的DNA 定量方法[1]。

其定量的基本原理是在PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR Green ）或特异性的荧光探针（如Taqman 探针）[2]，实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数—C T 值（Cycle threshold ）；根据C T 值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，就可知道基因线，获得C T 值与起始模板数的相关性方程，将样品的C T 值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与大豆内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数[3]。

本研究以抗草甘膦（CP 4-EPSPS ）转基因大豆为材料，以CaMV35S 边界序列为外源基因，避免以CaMV35S 和nos 为外源基因出现假阳性。

选择大豆凝集素基因（Lectin ）作为内源参照基因进行拷贝数估算，通过SYBR Green Ι实时荧光定量PCR 法检测转基因大豆中CaMV35S 基因的拷贝数。

1材料与方法1.1材料转基因杂交大豆（由东北农业大学大豆研究所提供），非转基因大豆（购自某超市）；阳性质粒（本实验室构建）；TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （Code No.:DRR015）SYBR Premix EX Taq TM （Code No.:DRR041S ）购自大连宝生物工程有限公司；ABI实时定量荧光PCR 仪（ABI7300），96孔扳（AXYG-EN ）。

1.2方法1.2.1DNA 提取转基因大豆基因组DNA 采用CTAB 法提取[4]，用分光光度计检测DNA 含量及纯度。

内参基因标准品选用转基因大豆基因组DNA ，浓度为0.43μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。

以含35S 边界序列的质粒DNA 为标准品，浓度为0.64μg ·μL -1，稀释倍数分别为50、5-1、5-2、5-3和5-4。

以Lectin 作为大豆的内参基因，以含35S 边界序列的质粒DNA 为阳性对照，未转基因大豆为阴性对照，水为空白对照。

1.2.2CaMV35S 边界序列的获得以转基因大豆基因组DNA 为模板，利用染色体步行法（TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit ）扩增CaMV35S 上游序列。

通过测序获得CaMV35S 上游大豆基因组序列。

根据获得的序列设计特异性引物，构建pMD18-T 阳性质粒载体。

1.2.3引物设计及合成转基因大豆内、外源基因的引物由Invitrogen公司合成。

引物序列见表1。

1.2.4PCR 反应体系和程序定量PCR 反应体系：SYBR Premix EX Taq TM（2×）10μL ，PCR 上游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，PCR 下游引物（10μmol ·L -1）0.4μL ，ROX Re-ference Dyer （50×）0.4μL ，模板2.0μL ，灭菌蒸馏水6.8μL ，总体积20μL 。

PCR 程序（采用两步法PCR 扩增程序）：预变性95℃30s ；95℃5s ，60℃31s ，40个循环。

5个不同稀释度的内参照基因标准品，5个不同稀释Abstract:SYBR Green Ιreal-time PCR was developed to determine copy number of exogenous 35S/plantgene in transgenic soybean.A conserved soybean housekeeping gene,Lectin was used as an internal contral and 5times diluted soybean genome DNA was used as an initial template copy of Lectin .So y =-2.9915x +22.3321,R 2=0.996,the standard curves of the cycle threshold (C T )relative to the log of each initial template copy of Lectin was obtained.In the same way,the standard curves of 35S/plant y =-3.4021x +17.7219,R 2=0.999,was obtained using 5times diluted plasmid DNA which contains 35S/plant gene.By SYBR Green Ιreal-time the C T values of Lectin and 35S/plant gene in each transgenic soybean was got,the transgene copy number was calculated by comparing the initial template copy of 35S/plant to Lectin gene in the same transgenic soybean.It concluded that among four PCR putative transgenic plants:one had two copies,and the other had three copies,respectively.Key words:real-time PCR;SYBR Green Ι;transgenic soybean;copy number;Lectin ;injection sequence of35S东北农业大学学报·12·第42卷度带有目的片段的质粒DNA ，空白对照同时进行扩增，均设3个平行。