转基因大豆检测技术研究进展

转基因大豆检测技术研究进展 [摘要] 大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。由于转基因产品的安全性在世界范围内引起广泛关注，对转基因检测技术的要求也越来越高，因此,对转基因大豆检测技术的研究成为近年来研究的热点。重点介绍以蛋白质和核酸为目标的检测技术，如EI。ISA、PCR和基因芯片技术的最新进展，并对不同方法的优缺点进行比较，为转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。 [关键词]转基因大豆；检测技术；蛋白质；核酸 Abstract：

Soybean transformation research is a/hot spot0in the area

of plant molecular genetics. Transgenic soybean has become the important power of soybeans industry development in the worlds' major producers of soybean. The different points on potential ecological risks and the impact of transgenic products on human health attracted worldwide attention． With the increase of transgenic products， the transgenic detection technology requirements should be established and perfected． The advance in detection techniques of transgenic soybean were summarized focusing on the protein and nucleic acid for target detection technology，such as new research on ELISA，PCR and gene chip techn0109y，and their characteristic were compared to provide references for transgenic soybean fast detection selection，improvement and subsequent research． Key words：transgenosis soybean；detection technology；protein；nucleic acid. 转基因大豆，是指利用转基因技术，通过基因工程方法导入外源基因所培育的具有特定性状的大豆品种。转基因大豆是种植面积最大的转基因作物，而随着转基因作物及其产品的大规模商业化，其安全性以及对人类健康和生态环境的潜在威胁受到国际社会和广大民众的广泛关注，对转基因成分的检测越来越受到重视。为此，对转基因大豆检测技术进行了综述，并对其优缺点进行比较，以期对转基因大豆快速检测方法的选择、改进和后续研究提供参考。 1 转基因大豆发展现状 近年来,由于转基因技术突破了生物物种间遗传物质转移和交换的天然屏障,使人类从对生物的简单认识和利用进入了可以按自己的意愿改造和创造新种质的时代。转基因技术打破了常规育的各种局限,并且得到迅猛发展和不断完善,现已成为大豆品质改良育种主要的且最有前途的技术手段。自从世界第一例转基因烟草1983年在美国问世以来,国际上已有30多个国家批准了数千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达40多种。转基因大豆品种的育成和推广是世界大豆科技史上具有里程碑意义的重大突破,产生了巨大的经济效益和广泛而深远的社会影响,已成为世界大豆生产发展的主流趋势。目前我国已正式批准棉花、西红柿、烟草和牵牛花4种转基因作物进行商业化生产,但真正商业化生产的转基因作物只有棉花,转基因水稻的安全评价已经进入到了最后阶段。转基因大豆、玉米等转基因作物正处于中间试验和环境释放试验阶段,进入商业化推广的准备阶段。该文综述我国转基因大豆遗传转化再生体系、遗传转化方法、目的基因类型的研究进展及其产业化现状,并就我国转基因大豆的未来发展前景进行了展望。 2 转基因大豆检测技术 为了满足强制标识的要求，各国政府在转基因检测领域投入大量的人力和物力，不断完善检测技术。目前，转基因大豆的检测方法主要以蛋白质检测和核酸检测为主。 2．1 蛋白质检测 2．1．1 ELISA法 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机结合起来的一种高灵敏度的检测技术。Rogan等建立了检测转基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白质的ELISA方法，国内自卫滨等应用E1．ISA方法成功检测出美国、阿根廷，巴西转基因大豆含量分别为3．8％、2．8％和1．9％。ELISA方法具有简便、快速、成本低等优点，但复杂基质对其准确性有干扰，而且不能检测深加工产品中的转基因成分。 2．1．2 试纸条法 将特异的抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再与带有颜色的特异抗体进行反应，形成三明治状的色带，如果没有抗原。则无颜色反应。丁耀魁等眵3采用快速检测试纸条测定大豆转基因含量，测定时间仅需10 min，测定结果准确。其检出限可达0.1％。试纸条法操作简便，不需要特殊的仪器设备，适用于现场检验或初筛。该法的缺点是检测范围较小，转基因食品中的蛋白质抗原性加工后容易被破坏，影响检测结果的准确性。 2．1．3 SDS–PAGE法 SDS–PAGE法是根据蛋白质亚基分子量的不同来分开蛋白质。大豆在引入外源基因后，会表达相应的蛋白质，可以通过比对蛋白质电泳图谱来区别转基因大豆与非转基因大豆。武泰存等采用PCR和SDS–PAGE两种方法对转基因大豆和非转基因大豆进行检测比较发现，SDS–PAGE和PCR检测结果吻合，转基因大豆在蛋自质电泳中出现约40 kDa的蛋白带，而非转基因大豆则没有。金红等研究发现，转基因大豆中大约45kDa蛋白带的表达量明显强于非转基因大豆中相对应的蛋白带。SDS-PAGE的优点是体系中外来影响因素少，检测结果较稳定，重复性好，缺点是操作较复杂、检测时间较长。 2．2 核酸检测 2．2．1 PCR法 PCR方法是适应性最广、灵敏度较高、技术较成熟的一种检测核酸的方法。钱翔宇等采用改进的CTAB法提取大豆基因组DNA，用普通PCR方法检测到转基因大豆特异性片段CP4一EPSPS，当转基因大豆含量为0.2％时。仍然可以检出；张秀丰等建立了以CaMV35S、NOS、NPT II、CP4一EPSPS外源基因和大豆内源基因(Lection)为榆测目的片段的5重PCR检测方法。陈彦等将降落PCR与热启动相结合，检测出0.01％转基因成分的大豆基因组外源基因CaMV35S和NOS。敖金霞等建立了适用于转基因大豆、玉米和水稻深加工产品定性检测的S重巢式PCR检测方法，其检测灵敏度为O．005％。相对于普通PCR，多重PCR一次反应能够检测多个目的基因片段，可以检测多个品系的转基因成分；降落PCR的程序设计虽然繁琐．但该方法明显提高了PCR扩增的特异性和效率；巢式PCR应用多条引物，通过二次PCR扩增，大大提高了检测灵敏度。 2．2．2 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术(Loop—mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等在2000年开发的一种新颖恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃)下保温几十分钟。即可完成核酸扩增反应。柳毅等以CP4一EPSPS外源基因为检测的目的片段，进行LAMP扩增，检测已知转基因大豆和市售大豆，通过肉眼观察白色沉淀，判断检测结果，LAMP技术对转基因大豆的检出限为O．01％。田芳等应用LAMP技术对大豆、豆粕及含有大豆成分的饲料样品进行检测成功检测出CP4一EPSPS基因，灵敏度为PCR方法的100～L000倍。LAMP技术灵敏度高、特异性好、耗时短且对仪器要求不高，目前这项技术也广泛地运用到病原菌检测之中。缺点是引物设计较为复杂，对扩增产物处理不当容易造成污染，影响后续的检验结果。 Z．2．3 荧光PCR技术 荧光PCR技术是一种可用于定性或定量的PCR方法，在转基因产品检测上已得到广泛应用，主要有非特异性染料结合和荧光标记探针2种方法。王小花等建立了大豆转基因成分的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法，通过熔解曲线分析扩增反应特异性，检测限为0.01％。黄俊明等口叫针对转基因大豆外源基因CP4一EPSPS基因建立实时荧光定量PCR方法及标准曲线，对市场抽检的豆奶粉、素鸡、香肠等12种豆类制品进行含量分析，其中，五香茶干、豆奶粉、素鸡,香肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2．46％、6．26％、13．95％、0.48％和0.66％，其余7份样品为阴性。自卫滨等用荧光定量PCR技术成功检测出美国、阿根廷、巴西转基因豆粉和中国豆粉的转基因成分，其灵敏度为0.001％。尽管荧光染料技术成本低廉,但具有非特异性，实际检测中通常采用荧光探针技术。荧光PCR技术具有快速、灵敏、准确、污染少等优点，缺点是对仪器设备要求较高、检测费用昂贵。 2．2．4 基因芯片基因芯片技术 是近年来快速发展起来的分子生物学高新技术。在转基因检测中。将目前能用的报告基因、启动子、终止子的特异性片断制成检测芯片，与待测产品的DNA进行杂交，扫描信号后经计算机软件分析，判断待测样品是否为转基因产品。Germini等L22J利用肽核酸基因芯片对转基因大豆进行了检测。Leimanis等拉副